趙穎丹，張?zhí)灬?，馬 駿，張偉偉，易 揚(yáng)，顧 波，王漢清，宣 怡

(上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院靜安分院腎內(nèi)科，上海 200040)

在大氣顆粒物中，細(xì)顆粒物2.5(particulate matter 2.5，PM2.5)占有較大比例，由于PM2.5具有較大的比表面積，其更易吸附重金屬和有機(jī)物，進(jìn)而損傷人體健康[1-2]，因而具有更高的毒性。最近的研究表明，PM2.5很容易通過肺泡上皮細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，最終破壞心血管系統(tǒng)和腎臟[3-5]。如Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，短期暴露PM2.5加重氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)BALB/c小鼠腎臟損傷。Yang等[7]同樣發(fā)現(xiàn)，PM2.5能夠激活核因子紅細(xì)胞相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)/血紅素氧化酶-1(heme oxygenase 1, HO1)通路，進(jìn)而加重人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。因此，抑制氧化應(yīng)激將有助于減輕PM2.5導(dǎo)致的腎損傷。黃芪甲苷是從常見中藥黃芪中提取的活性成分。Gui等[8]學(xué)者報(bào)道，黃芪甲苷可通過抑制凋亡途徑和氧化應(yīng)激通路預(yù)防缺血引起的急性腎損傷。由此推測，黃芪甲苷可能有助于減輕PM2.5誘導(dǎo)的腎臟氧化損傷。因此，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)探究黃芪甲苷在抑制PM2.5誘導(dǎo)的腎臟氧化損傷中的作用及其分子機(jī)制，以期為PM2.5所致腎臟氧化損傷的治療提供幫助。

1 材料

1.1 試劑 HK-2細(xì)胞購：中國科學(xué)院細(xì)胞庫；DMEM和F12培養(yǎng)液：美國Thermo Fisher Scientific公司；黃芪甲苷：南京春秋生物工程有限公司；Western blot相關(guān)試劑、Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、CCK8試劑盒、BeyoClickTMEdU-488細(xì)胞增殖檢測試劑盒和一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液：上海雅吉生物科技有限公司；總活性氧(reactive oxygen species，ROS)分析試劑盒：Sigma Aldrich；抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-px)檢測試劑盒：R&D Systems；丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量檢測試劑盒和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；羊抗兔二抗：杭州華安生物技術(shù)有限公司；兔多克隆一抗：Abcam。

1.2 儀器 BioTek ELx800全自動(dòng)酶標(biāo)儀：美國BioTek公司；BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀：美國BD公司；ImageQuant RT ECL凝膠成像系統(tǒng)：美國GE Healthcare公司；TGL-18臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：四川蜀科儀器有限公司；XDS-200D數(shù)碼電腦型倒置顯微鏡：蘇州景通儀器有限公司；TSP/PM10/PM2.5顆粒物大流量采樣器：青島精誠儀器儀表有限公司；全自動(dòng)超聲波清洗機(jī)：深圳市深力勁超聲波自動(dòng)化設(shè)備有限公司。

2 方法

2.1 PM2.5的采集 PM2.5采集于上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院、華山醫(yī)院靜安分院；通過PM2.5大流量采樣器對PM2.5進(jìn)行連續(xù)采樣(流量：1.05 m3/min；時(shí)間：22 h)。對采樣后的濾膜稱質(zhì)量，并裁剪為1 cm×1 cm，浸泡去離子水的同時(shí)進(jìn)行超聲振蕩(每次0.5 h，共3次)，隨后對洗提液進(jìn)行6層紗布過濾，濾液經(jīng)真空干燥后制成粉末，經(jīng)紫外線照射殺菌0.5 h后，通過磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)配制成5 mg/mL的PM2.5懸液，使用前超聲振蕩15 min。

2.2 細(xì)胞分組 HK-2細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)液；培養(yǎng)條件：5% CO2和37 ℃，匯合度70%～80%時(shí)消化，并按1∶4比例傳代培養(yǎng)。黃芪甲苷用PBS制成500 nmol/L的溶液。將HK-2細(xì)胞分為5組：對照組(僅PBS處理)、模型組(200 μg/mL PM2.5處理24 h)、黃芪甲苷低劑量組(200 μg/mL PM2.5及10 nmol/L黃芪甲苷共同處理24 h)、黃芪甲苷中劑量組(200 μg/mL PM2.5以及100 nmol/L黃芪甲苷共同處理24 h)、黃芪甲苷高劑量組(200 μg/mL PM2.5以及200 nmol/L黃芪甲苷共同處理24 h)。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 HK-2細(xì)胞經(jīng)消化、離心、清洗后依次添加結(jié)合緩沖液(100 μL)、Annexin-Ⅴ-FITC(20 ng/L，10 μL)，在避光條件下孵育(37 ℃)0.5 h，隨后添加PI(50 ng/L，5 μL)，在避光條件下孵育(37 ℃)5 min，接著添加結(jié)合緩沖液(0.4 mL)，并迅速通過BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

2.4 CCK8測定細(xì)胞增殖能力 1×106/mL HK-2細(xì)胞接種于96孔板中(每孔0.1 mL)，12 h后，更換含10% CCK8試劑的培養(yǎng)基0.1 mL，培養(yǎng)(37 ℃，避光條件下)2～3 h后，最后通過BioTek ELx800全自動(dòng)酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光值。

2.5 TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡 各組HK-2細(xì)胞接種于鋪有蓋玻片的6孔板內(nèi)，濃度l×108/mL，培養(yǎng)過夜后給予各組相應(yīng)處理，經(jīng)4%多聚甲醛固定1 h后，PBS洗滌并添加3% H2O2封閉10 min；經(jīng)0.1% Triton X-100檸檬酸鈉通透液孵育120 s后，添加TUNEL反應(yīng)液并孵育60 min，經(jīng)洗滌后添加POD轉(zhuǎn)換液并孵育(避光)30 min，接著添加DAB底物并且孵育10 min，最后封片并且在顯微鏡下觀察和分析。

2.6 EdU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞增殖能力 將4×103/mL HK-2細(xì)胞接種于96孔板中，12 h后，添加0.1 mL含EdU的培養(yǎng)基，孵育2 h，進(jìn)行多聚甲醛固定以及Triton X-100通透處理，接著添加0.1 mL的Apollo染色反應(yīng)液，封片后通過BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖能力。

2.7 Western blot檢測總Nrf2、核Nrf2、HO1、NQO1表達(dá)水平 經(jīng)RIPA裂解液裂解30 min后,收集上清并檢測總蛋白濃度,然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)膜并封閉。接著孵育一抗過夜,包括Nrf2抗體(1∶500稀釋)、NAD(P)H醌脫氫酶1[NAD(P)H quinone dehydrogenase 1，NQO1]抗體(1∶500稀釋)、HO-1抗體(1∶500稀釋)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體(1∶1 000稀釋)；洗膜后孵育羊抗兔二抗(1∶2 000稀釋),2 h后添加電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)底物,暗室曝光后掃描底片,最后計(jì)算灰度值。

2.8 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 將不同處理的HK-2細(xì)胞進(jìn)行裂解，然后將上清液在冷的線粒體分離緩沖液中進(jìn)行搖勻。使用ROS分析試劑盒、MDA含量檢測試劑盒檢測ROS和MDA水平；采用總SOD活性檢測試劑盒、GSH-px檢測試劑盒檢測GSH-px與SOD，詳細(xì)操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 黃芪甲苷減輕PM2.5誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果(圖1)顯示，PM2.5處理導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡比例明顯增加，而給予黃芪甲苷處理后，凋亡率明顯降低(P<0.05)；隨著黃芪甲苷濃度的提高，腎小管上皮細(xì)胞凋亡比例逐步降低。進(jìn)一步行TUNEL染色，檢測結(jié)果(圖2)顯示與流式細(xì)胞儀分析結(jié)果相似的趨勢。隨后觀察黃芪甲苷對腎小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞增殖的影響。EdU細(xì)胞增殖檢測結(jié)果(圖3)顯示，PM2.5處理顯著抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖(P<0.05)，而黃芪甲苷處理后，HK-2細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)；隨著黃芪甲苷濃度的提高，HK-2細(xì)胞增殖能力逐步增強(qiáng)。CCK8檢測結(jié)果顯示同樣的趨勢(圖4)。

注：A.對照組；B.模型組；C.黃芪甲苷低劑量組；D.黃芪甲苷中劑量組；E.黃芪甲苷高劑量組；與對照組比較，*P#P△P◇P<0.05

注：A.對照組；B.模型組；C.黃芪甲苷低劑量組；D.黃芪甲苷中劑量組；E.黃芪甲苷高劑量組；與對照組比較，*P#P△P◇P<0.05

注：A.對照組；B.模型組；C.黃芪甲苷低劑量組；D.黃芪甲苷中劑量組；E.黃芪甲苷高劑量組；與對照組比較，*P#P△P◇P<0.05

注：A.對照組；B.模型組；C.黃芪甲苷低劑量組；D.黃芪甲苷中劑量組；E.黃芪甲苷高劑量組；與對照組比較，*P#P△P◇P<0.05

3.2 黃芪甲苷抑制氧化應(yīng)激反應(yīng) 本研究對氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，PM2.5處理導(dǎo)致HK-2細(xì)胞ROS、MDA水平顯著提高(P<0.05)，而抗氧化酶SOD、GSH-Px水平均明顯降低(P<0.05)。給予黃芪甲苷處理后，PM2.5處理導(dǎo)致的ROS和MDA水平升高被顯著抑制，且隨黃芪甲苷處理濃度的增加，ROS和MDA水平不斷降低。進(jìn)一步對抗氧化酶進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，黃芪甲苷處理后抗氧化酶SOD和GSH-Px水平明顯升高(P<0.05)，且隨黃芪甲苷處理濃度的增加，SOD和GSH-Px水平不斷升高。見表1。

3.3 黃芪甲苷對Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)-Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件(antioxident response element, ARE)信號(hào)通路的影響 本研究對氧化應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路Keap1-Nrf2-ARE進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，PM2.5處理后總Nrf2、核Nrf2、HO1以及NQO1水平顯著降低(P<0.05)，而給予黃芪甲苷處理后，總Nrf2、核Nrf2、HO1以及NQO1水平明顯升高(P<0.05)，且隨黃芪甲苷濃度的升高而升高。結(jié)果見圖5和表2。

表1 黃芪甲苷對HK-2細(xì)胞ROS、MDA、SOD、GSH-Px水平的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與黃芪甲苷低劑量組比較，△P<0.05；與黃芪甲苷中劑量組比較，◇P<0.05

4 討論

研究顯示，PM2.5具有表面積較大、粒徑較小、含有較多有害物質(zhì)且在空氣中漂浮時(shí)間長的特點(diǎn)，因而具有長距離傳輸?shù)哪芰9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5是由金屬(砷、鉛)、有機(jī)物(多環(huán)芳烴、有機(jī)碳)、微生物(真菌孢子、細(xì)菌)等成分組成的復(fù)雜混合物。這種顆粒非常小，很容易沉積在肺泡中[7,11]。最近的研究表明，PM2.5很容易通過肺泡上皮細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，最終破壞心血管系統(tǒng)和腎臟[12-13]。因此，抑制PM2.5所致腎臟損傷也成為學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，PM2.5處理后，腎小管上皮細(xì)胞凋亡率明顯增加；而給予黃芪甲苷處理后，細(xì)胞凋亡率明顯下降。這表明黃芪甲苷能夠抑制PM2.5所致腎小管上皮細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步檢測細(xì)胞增殖情況發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PM2.5處理的腎小管上皮細(xì)胞增殖力明顯降低，而經(jīng)黃芪甲苷處理后，細(xì)胞增殖力則明顯高于模型組。結(jié)果說明黃芪甲苷處理有助于促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖。因此，黃芪甲苷的應(yīng)用有助于PM2.5所致腎臟損傷的治療。

注：A.對照組；B.模型組；C.黃芪甲苷低劑量組；

表2 黃芪甲苷對Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與黃芪甲苷低劑量組比較，△P<0.05；與芪甲苷中劑量組比較，◇P<0.05

PM2.5所致氧化應(yīng)激是其誘導(dǎo)生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵機(jī)制[13-14]。如Hu等[15]研究顯示，PM2.5暴露可激活HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)和線粒體凋亡，導(dǎo)致皮膚刺激和損傷。因此，本研究從氧化應(yīng)激方面進(jìn)一步探究黃芪甲苷減輕PM2.5所致腎小管上皮細(xì)胞損傷的分子機(jī)制。結(jié)果顯示，PM2.5處理后，HK-2細(xì)胞ROS和MDA水平顯著升高，同時(shí)SOD、GSH-Px水平均明顯降低，說明PM2.5導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷是由氧化應(yīng)激反應(yīng)加重導(dǎo)致的。腎小管上皮細(xì)胞給予PM2.5和黃芪甲苷共同處理后，進(jìn)一步檢測指標(biāo)表明，ROS、MDA水平均顯著低于PM2.5處理的HK-2細(xì)胞，而SOD、GSH-Px水平顯著高于PM2.5處理的HK-2細(xì)胞。由此確定黃芪甲苷減輕PM2.5所致腎小管上皮細(xì)胞損傷是由抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。這與Yan等[16]的研究——黃芪甲苷通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕順鉑所致急性腎損傷的結(jié)果相近。

Keap1-Nrf2-ARE通路在氧化應(yīng)激中作用明顯。Nrf2通過與ARE、Keap1相互作用，進(jìn)而啟動(dòng)下游解毒酶以及抗氧化蛋白的基因表達(dá)，展示出細(xì)胞保護(hù)作用[17-19]。因此，本研究探究了黃芪甲苷對Nrf2、HO1、NQO1表達(dá)的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，腎小管上皮細(xì)胞經(jīng)黃芪甲苷處理后，總Nrf2、核Nrf2、HO1以及NQO1的表達(dá)水平均明顯升高；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，隨著黃芪甲苷濃度的增加，總Nrf2、核Nrf2、HO1以及NQO1表達(dá)水平不斷升高。這說明黃芪甲苷的抗氧化作用是通過Keap1-Nrf2-ARE通路實(shí)現(xiàn)的，并且黃芪甲苷處理能夠促進(jìn)Nrf2入核。目前多項(xiàng)研究報(bào)道了黃芪甲苷等中藥提取物在抗氧化應(yīng)激中的作用[20-21]。如黃存東等[22]發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷通過調(diào)控Keap1-Nrf2-ARE通路保護(hù)腎小球系膜細(xì)胞免受高糖環(huán)境的損傷。然而黃芪甲苷如何促進(jìn)Nrf2表達(dá)和入核目前尚未完全被闡明。

綜上所述，本研究探究了黃芪甲苷對PM2.5所致腎小管上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。結(jié)果顯示黃芪甲苷能夠通過調(diào)控Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕PM2.5誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞氧化損傷。本研究結(jié)果將有助于腎小管上皮細(xì)胞氧化損傷的治療，以及為黃芪甲苷的臨床應(yīng)用提供幫助。同時(shí)，黃芪甲苷減輕PM2.5所致腎小管上皮細(xì)胞氧化損傷的體內(nèi)研究以及黃芪甲苷作用時(shí)間的選擇仍需進(jìn)一步研究。