施志超

腎癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，起源于腎小管上皮細(xì)胞，約占腎臟腫瘤的90%，其發(fā)病率僅次于膀胱癌，為泌尿系腫瘤發(fā)病率中的第二位，在過去的幾十年中，其發(fā)病率逐年上升，在所有成人惡性腫瘤中占5%左右[1]。腎癌的治療過程中存在對(duì)放化療不敏感、術(shù)后預(yù)后差等問題。隨著中藥學(xué)的發(fā)展，眾多中藥被應(yīng)用于腫瘤的治療[2]，相比傳統(tǒng)的化療藥物，中藥具有多靶點(diǎn)、藥物毒副作用小等優(yōu)勢(shì)[3]。黃芪甲苷（astragaloside Ⅳ）是從黃芪提取的物質(zhì)之一，也是眾多單體中活性較強(qiáng)的成分之一[4]。研究表明，黃芪有抗肝癌細(xì)胞等作用[5]。本研究通過檢測(cè)黃芪甲苷對(duì)769-P 細(xì)胞的細(xì)胞活性、活性氧（ROS）、線粒體膜電位和胱天蛋白酶3/9（Caspase 3/9）活性的影響，旨在研究黃芪甲苷抗腎癌的活性及其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人源腎癌細(xì)胞（769-P）（上海中科院細(xì)胞庫）。

1.2 主要試劑和儀器 RPMI 1640 培養(yǎng)基（Gibco公司，8120481）；胎牛血清（Gibco 公司，42G5093K）；ROS 檢測(cè)試劑盒（碧云天生物科技公司，100620201106）；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（碧云天生物科技公司，032421210013）；CCK-8 試劑盒（碧云天生物科技公司，010919190109）；啶磷脂酰絲氨酸蛋白抗體偶聯(lián)熒光標(biāo)記物FITC（Annexin V-FITC）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（碧云天生物科技公司，062719190909）；Caspase 3 活性檢測(cè)試劑盒（碧云天生物科技公司，071018190112）；Caspase 9 活性檢測(cè)試劑盒（碧云天生物科技公司，060618200410）；黃芪甲苷（純度≥98%，阿拉丁生化科技公司，2007264）。CO2培養(yǎng)箱（日本PHCbi 公司），流式細(xì)胞儀（美國BD 公司），酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司），高速低溫離心機(jī)（美國Thermo 公司）。

1.3 方 法

1.3.1 人源腎癌細(xì)胞（769-P）在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件（37 ℃，5% CO2）下，RPMI 1640 培養(yǎng)基添加10%胎牛血清，1% GlutaMAX 和100 μ/mL 青霉素-鏈霉素。用含有EDTA 的胰酶消化，按1∶4 傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 使用CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。769-P 細(xì)胞接種到96 孔板，貼壁生長(zhǎng)24 h，使用0、5、10、20、40 和80 μM 的黃芪甲苷溶液共同孵育48 h 后，每孔加入10μL CCK-8 試劑，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h 后進(jìn)行檢測(cè)，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處的吸光度。以0 μM 黃芪甲苷溶液組作為對(duì)照組，計(jì)算各組769-P 細(xì)胞活性。

1.3.3 細(xì)胞ROS 水平檢測(cè) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞ROS 水平。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞置于6 孔板中（3×105個(gè)/孔）用于實(shí)驗(yàn)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h 后，加入黃芪甲苷溶液（0、10、20 和40 μM）共同孵育24 h 后，每孔加入1 mL DCFH-DA（1∶1000 稀釋）探針進(jìn)行染色，放入培養(yǎng)箱孵育20 min，使用PBS 洗去探針染色，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)探針熒光強(qiáng)度（ROS 水平）。

1.3.4 細(xì)胞線粒體膜電位水平檢測(cè) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位水平。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞置于6孔板中（3×105個(gè)/孔）用于實(shí)驗(yàn)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h 后，加入黃芪甲苷溶液（0、10、20 和40 μM）共同孵育24 h 后，每孔使用1 mL JC-1 探針染色液體進(jìn)行染色，放入培養(yǎng)孵育20min 后，使用染色緩沖液（1×）清洗2 次，使用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)線粒體膜電位水平。

1.3.5 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡檢測(cè) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞置于6 孔板中（3×105個(gè)/孔）用于實(shí)驗(yàn)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h 后，加入黃芪甲苷溶液（0、10、20 和40 μM）共同孵育48h。每孔使用5 μL Annexin V FITC 和10 μL PI 雙染法染色，避光反應(yīng)20 min，PBS 洗滌2 次后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例變化。

1.3.6 Caspase 3 和Caspase 9 活性檢測(cè) 采用分光光度法檢測(cè)Caspase 3 和Caspase 9 活性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞置于6 孔板中（1×106個(gè)/孔），待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h 后，加入黃芪甲苷溶液（0，10，20 和40 μM）共同孵育48 h，收齊細(xì)胞，4 ℃離心10 min 后去除上清液，每管細(xì)胞加入100 μL 裂解液冰上裂解15 min 后，取裂解液50 μL 和檢測(cè)緩沖液40 μL、檢測(cè)試劑10 μL 在37 ℃孵育60 min，使用酶標(biāo)儀在405 nm處的吸光度值，計(jì)算Caspase 3 和Caspase 9 活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。所有正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較作Dunnett’s檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對(duì)769-P 細(xì)胞增殖活性的影響 使用CCK-8 檢測(cè)黃芪甲苷對(duì)769-P 細(xì)胞增殖活性的影響。結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，在5～80 μM 濃度范圍內(nèi)，經(jīng)黃芪甲苷處理48 h 后，以濃度依賴性的方式抑制769-P 細(xì)胞增殖活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見表1。

表1 不同濃度黃芪甲苷對(duì)769-P 細(xì)胞生長(zhǎng)影響（%，）

表1 不同濃度黃芪甲苷對(duì)769-P 細(xì)胞生長(zhǎng)影響（%，）

注：與0 μM 黃芪甲苷比較，aP＜0.05，bP＜0.01

2.2 黃芪甲苷對(duì)ROS 水平的影響 使用DCFH-DA探針檢測(cè)黃芪甲苷促進(jìn)769-P 細(xì)胞產(chǎn)生的ROS。在不同濃度的黃芪甲苷作用于769-P 細(xì)胞24h 后，與對(duì)照組比較，熒光強(qiáng)度明顯上升，結(jié)果表明，黃芪甲苷以劑量依賴性方式增加ROS 產(chǎn)生，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見表2、圖1。

表2 不同濃度黃芪甲苷對(duì)769-P 細(xì)胞ROS 水平影響（熒光強(qiáng)度，）

表2 不同濃度黃芪甲苷對(duì)769-P 細(xì)胞ROS 水平影響（熒光強(qiáng)度，）

注：ROS 為活性氧；FL1-A 為JC-1 單體；與0 μM 黃芪甲苷比較，aP＜0.05，bP＜0.01

2.3 黃芪甲苷對(duì)線粒體膜電位的影響 使用JC-1探針檢測(cè)黃芪甲苷對(duì)769-P 細(xì)胞線粒體膜電位的影響。在不同濃度的黃芪甲苷作用于769-P 細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組比較，黃芪甲苷處理組的綠色熒光（JC-1 單體）與紅色熒光（JC-1 聚合物）的比值升高，黃芪甲苷處理后，769-P 細(xì)胞的線粒體膜電位下降，黃芪甲苷能以劑量依賴的方式降低769-P 細(xì)胞線粒體膜電位，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見表3、圖2。

表3 不同濃度黃芪甲苷對(duì)769-P 細(xì)胞線粒體膜電位的影響（熒光強(qiáng)度比值（）

表3 不同濃度黃芪甲苷對(duì)769-P 細(xì)胞線粒體膜電位的影響（熒光強(qiáng)度比值（）

注：FL1-A 為JC-1 單體；FL2-A 為JC-2 單體；與0 μM 黃芪甲苷比較，aP＜0.05，bP＜0.01

2.4 黃芪甲苷對(duì)線粒體膜電位的影響 Annexin V FITC/PI 雙染法檢測(cè)黃芪甲苷對(duì)769-P 細(xì)胞凋亡的影響。不同濃度的黃芪甲苷作用于769-P 細(xì)胞48 h后，Annexin V FITC/PI 雙染法檢測(cè)結(jié)果顯示（Q1 代表壞死細(xì)胞，Q2 代表晚期細(xì)胞，Q3 代表早期凋亡細(xì)胞，Q4 代表正常細(xì)胞），與對(duì)照組比較，黃芪甲苷處理組凋亡比例明顯增加（Q2+Q3），表明黃芪甲苷能誘導(dǎo)769-P 細(xì)胞凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4、圖3。

表4 不同濃度黃芪甲苷對(duì)769-P 細(xì)胞凋亡率的影響（%，）

表4 不同濃度黃芪甲苷對(duì)769-P 細(xì)胞凋亡率的影響（%，）

注：與0 μM 黃芪甲苷比較，aP＜0.05

2.5 黃芪甲苷對(duì)Caspase 3/9 活性的影響 使用酶標(biāo)儀檢測(cè)黃芪甲苷對(duì)769-P 細(xì)胞Caspase 3/9 活性的影響。在不同濃度的黃芪甲苷作用于769-P 細(xì)胞48 h 后，結(jié)果表明，黃芪甲苷能以劑量依賴的方式促進(jìn)Caspase 3/9 活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見表5。

表5 不同濃度黃芪甲苷對(duì)769-P 細(xì)胞Caspase 3和Caspase 9 的影響（相對(duì)活性，）

表5 不同濃度黃芪甲苷對(duì)769-P 細(xì)胞Caspase 3和Caspase 9 的影響（相對(duì)活性，）

注：Caspase 3 為胱天蛋白酶3；Caspase 9 為胱天蛋白酶9；與0 μM黃芪甲苷比較，aP<0.05，bP<0.01

3 討論

目前治療腎癌以手術(shù)治療和化療為主[6]，但是傳統(tǒng)的化療已經(jīng)不能滿足臨床治療的需求，因此探尋新的治療腎癌的藥物成為新的熱點(diǎn)之一。過量產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致氧化應(yīng)激是眾多抗腫瘤藥物的機(jī)制之一[7]。ROS 不僅直接攻擊脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，導(dǎo)致線粒體膜電位的下降，并充當(dāng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路的上游信號(hào)分子之一[8]。

本研究結(jié)果表明，與空白對(duì)照組（0 μM 黃芪甲苷）比較，黃芪甲苷處理組能顯著地以濃度依賴性的方式抑制769-P 的增殖活性，降低細(xì)胞的存活率，具有抗腫瘤活性。在腫瘤細(xì)胞死亡的方式中，凋亡是其中主要的死亡方式之一[9]，同時(shí)細(xì)胞凋亡是細(xì)胞毒性中一個(gè)非常重要的現(xiàn)象。細(xì)胞凋亡是一個(gè)高度調(diào)控的過程，而在化療過程中產(chǎn)生的腫瘤凋亡通常是由于化療藥物使用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生[10]。它是由兩個(gè)主要的細(xì)胞死亡信號(hào)通路觸發(fā)，死亡受體介導(dǎo)（外源性）和線粒體（內(nèi)源性）信號(hào)通路[11]。線粒體膜電位的下降，導(dǎo)致細(xì)胞色素c 從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，隨后激活Caspase 9[12]。Caspase 9 的激活導(dǎo)致Caspase 3 的激活，切割特定底物以執(zhí)行凋亡。本研究表明，與0 μM 黃芪甲苷組比較，10、20 和40 μM 黃芪甲苷處理組的熒光明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05 或P<0.01），說明黃芪甲苷能促進(jìn)769-P 細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平升高，細(xì)胞內(nèi)的ROS 異常升高，會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究采用JC-1 探針檢測(cè)線粒體膜電位的情況，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能顯著降低769-P 的線粒體膜電位，這也進(jìn)一步說明黃芪甲苷導(dǎo)致的ROS 升高進(jìn)一步影響到線粒體的膜電位，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。本研究通過Annexin V FITC/PI 雙染對(duì)黃芪甲苷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷10、20 和40 μM處理組的早期凋亡和晚期凋亡比例呈現(xiàn)濃度依賴性增加，而壞死區(qū)域的細(xì)胞比例無明顯變化，進(jìn)一步說黃芪甲苷誘導(dǎo)769-P 細(xì)胞死亡的主要方式是凋亡而并非壞死。在黃芪甲苷處理組Caspase 3/9 相對(duì)活性呈現(xiàn)濃度依賴性增加，表明黃芪甲苷能顯著提高Caspase 3/9 的活性，Caspase 3/9 作為線粒體凋亡途徑中的標(biāo)志性蛋白，參與到細(xì)胞凋亡過程中，表明黃芪甲苷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制可能與激活Caspase 通路有關(guān)。作為傳統(tǒng)中藥植物黃芪的主要活性成分，黃芪甲苷在本研究中具有顯著的體外抗腎癌細(xì)胞系769-P 的活性，其原因可能是與促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生，降低膜電位導(dǎo)致線粒體損傷有關(guān)。

總之，黃芪甲苷可抑制腎癌細(xì)胞系769-P 的增殖活性，促進(jìn)ROS 水平升高，降低線粒體膜電位，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其分子機(jī)制可能與激活Caspase 通路有關(guān)。