楊志偉，耿亞松，李國臻，陶林林，戴豪楊，戴芳芳，鄭波

(邢臺不孕不育專科醫(yī)院/邢臺生殖與遺傳?？漆t(yī)院，邢臺 054000)

體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術(shù)中通過促排卵得到較多的卵母細胞，體外培養(yǎng)后可挑選形態(tài)學較好的胚胎移植入子宮，提高單次移植成功率，但卵母細胞利用率較低，通常需要獲得10枚卵母細胞才能獲得滿意的妊娠結(jié)局[1]。大量研究表明，體外過夜受精時非生理狀態(tài)的高濃度精子產(chǎn)生氧自由基等損傷胚胎發(fā)育潛能[2-3]，短時受精聯(lián)合早期補救ICSI可有效避免卵母細胞受精失敗的風險，并且短時受精比過夜受精可獲得更好的胚胎結(jié)局和臨床妊娠結(jié)局[4-5]。因此，短時受精已被廣泛應(yīng)用于國內(nèi)大量生殖醫(yī)學中心。

中國專家共識[6]建議短時受精加精時間為HCG注射后38～40 h，受精率較為理想。HCG注射后授精時機可能會影響卵母細胞的發(fā)育能力[7]。增加受精前卵母細胞孵育時間有利于卵母細胞質(zhì)成熟，核質(zhì)同步成熟是卵子受精和獲得優(yōu)質(zhì)胚胎的有力保障，但卵母細胞體外孵育時間過長可引起卵母細胞的老化，且培養(yǎng)基中代謝廢物的積累均可導致非整倍體概率的增加[8]，錯過最佳受精時機。短時受精縮短精卵共培養(yǎng)時間至1～6 h，能夠改善可移植胚胎率和優(yōu)質(zhì)胚胎率[9]。在規(guī)范的時間內(nèi)，適當調(diào)整授精時機可導致卵母細胞孵育時間和精卵共孵育時間長短的改變。本研究分析卵母細胞取出后體外孵育時間和精卵共孵育時間對IVF-ET結(jié)局的影響，探討在取卵時間和脫顆粒細胞時間相對固定的情況下，如何綜合考慮取卵后卵母細胞孵育時間和精卵共孵育時間，選擇合適的授精方案。

材料與方法

一、研究對象

回顧性分析2017年1月至2020年12月在我院生殖中心行IVF-ET治療患者的臨床數(shù)據(jù)。

納入標準：女方年齡≤35 歲；首次主因女方輸卵管因素接受輔助生殖短時受精助孕，新鮮胚胎移植；排除子宮內(nèi)膜異位癥、盆腔炎等宮腔和盆腔病變，子宮畸形和染色體異?；颊?。

所研究的時間段共2 060例患者在我中心行短時受精助孕。排除短時受精失敗行早期補救ICSI 119例和未新鮮周期移植748例，最終共1 193例行短時受精新鮮周期移植的患者納入分析。

二、診療回顧

1.控制性促排卵：納入研究對象均采用常規(guī)長方案促排卵，女方在黃體期肌肉注射促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a，達菲林，益普生，法國)，達到降調(diào)節(jié)后，給予重組促卵泡β素(rFSH，普利康，歐加農(nóng)，荷蘭)或尿促性素(HMG，樂寶得，珠海麗珠制藥)促排卵，定期通過陰道B超監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，當1/3卵泡直徑≥18 mm時肌肉注射HCG(珠海麗珠制藥)5 000～10 000 U，36 h左右B超引導下經(jīng)陰道穿刺取卵。卵冠丘復合體置于37℃、6%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.體外受精和胚胎移植：HCG注射后38～40 h授精。30～50 μl微滴法授精，每滴1～2個卵母細胞，授精濃度為2×105條/ml。授精后1～6 h拆除卵子周圍大量顆粒細胞，觀察受精情況酌情行早補救ICSI。授精后16～18 h觀察，出現(xiàn)兩個極體和兩個原核為正常受精，兩個以上原核為多原核受精。參考2011年版ESHERE發(fā)布的Istanbul共識[10]，受精后第3天根據(jù)卵裂球數(shù)目、大小不均、碎片和有無多核等情況判定胚胎質(zhì)量為優(yōu)質(zhì)、中等和差，選擇中等及以上1～2枚胚胎進行移植和冷凍，剩余胚胎培養(yǎng)囊胚；受精后第5天和第6天對囊胚進行評分，參考Gardner評分標準[11]，選擇3BC及以上評分囊胚移植或冷凍。

3.黃體支持和妊娠確定：取卵當日肌注黃體酮注射液(浙江仙琚)進行黃體支持。視HCG注射日E2水平，移植日給予適量雌二醇(補佳樂，拜耳醫(yī)藥，德國)補充，移植當日常規(guī)使用黃體酮(安琪坦，博賞醫(yī)藥，法國)口服或陰道上藥進行黃體支持。移植后14 d查血HCG，陽性者移植后28 d行B超檢查，見孕囊確定臨床妊娠。

三、分組及觀察指標

根據(jù)注射HCG日雌激素水平的中位數(shù)將新鮮周期移植患者二分類為E2≤11 129.63 pmol/L組(A組)和E2>11 129.63 pmol/L組(B組)；再根據(jù)取卵至授精時長的中位數(shù)將新鮮周期移植患者二分類為卵母細胞孵育時間≤3 h組(A1組和B1組)和卵母細胞孵育時間>3 h組(A2組和B2組)。

卵母細胞孵育時間為取卵至授精時間，精卵共孵育時間為授精至脫顆粒細胞時間；正常受精率=受精后16～18 h出現(xiàn)2原核及2極體卵子數(shù)/加精卵子總數(shù)×100%；多PN率≥3原核卵子數(shù)/加精卵子總數(shù)×100%；可移植胚胎率=(冷凍或移植評級為中等及以上的卵裂胚數(shù)+3BC及以上囊胚數(shù))/卵裂數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=(冷凍或移植優(yōu)質(zhì)卵裂胚數(shù)+3BB及以上囊胚數(shù))/卵裂數(shù)×100%；早補救ICSI率=早補救ICSI周期數(shù)/短時受精周期數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/新鮮移植周期數(shù)×100%；種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

四、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、患者基礎(chǔ)資料比較

共1 193例短時受精且完成鮮胚移植的患者納入最終分析。依據(jù)HCG日雌激素水平將新鮮周期移植患者分為E2≤11 129.63 pmol/L組(A組，n=596)和E2>11 129.63 pmol/L組(B組，n=597)；再依據(jù)取卵至授精時間細分為卵母細胞孵育時間≤3 h組(A1組和B1組)和卵母細胞孵育時間>3 h組(A2組和B2組)兩個亞組。因而總共分為A1(n=277)、A2(n=319)、B1(n=320)、B2(n=277)4個組進行分析。

4組患者間女方年齡、BMI、基礎(chǔ)FSH水平和HCG日子宮內(nèi)膜厚度均無顯著性差異(P>0.05)；A1、A2兩組HCG日E2和孕酮(P)水平顯著低于B1、B2組(P<0.05)，但A、B組內(nèi)亞組間比較無顯著差異(P>0.05)(表1)。

二、患者體外受精/新鮮胚胎移植結(jié)局比較

1.受精及胚胎培養(yǎng)結(jié)局：A組(A1、A2)獲卵數(shù)顯著低于B組(B1、B2)(P<0.05)，可移植胚胎率顯著高于B組(B1、B2)(P<0.05)，而同組亞組間(A1 vs. A2，B1 vs. B2)比較均無顯著差異(P>0.05)。4組患者間正常受精率、多PN受精率和囊胚形成率均無顯著差異(P>0.05)。A1、B1組較A2、B2組精卵共孵育時間顯著延長(P<0.05)；B2組優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著高于B1組(P<0.05)，A2組優(yōu)質(zhì)胚胎率較A1組有增高趨勢(25.85% vs. 23.99%)，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。

表1 患者基礎(chǔ)資料比較(-±s)

表2 患者體外受精及胚胎培養(yǎng)結(jié)局比較[(-±s)，%]

2.新鮮胚胎移植周期結(jié)局：4組間移植胚胎數(shù)、囊胚占比、臨床妊娠率和流產(chǎn)率均無顯著差異(P>0.05)；A1組胚胎種植率顯著低于其他3組(P<0.05)，A2組臨床妊娠率相對于A1組有增高趨勢但無顯著差異(63.32% vs. 57.40%，P>0.05)；B1與B2組間臨床妊娠率和種植均無顯著差異(P>0.05)(表3)。

表3 患者新鮮胚胎移植周期結(jié)局比較[(-±s)，%]

三、卵母細胞孵育時間和精卵共孵育時間與短時受精胚胎結(jié)局的相關(guān)性

采用Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：隨著卵母細胞孵育時間的增加，精卵共孵育時間顯著縮短(R=-0.318，P<0.001)；卵母細胞孵育時間和精卵共孵育時間與正常受精率、囊胚形成率和可移植胚胎率無顯著相關(guān)性(P>0.05)；卵母細胞孵育時間與多PN率呈顯著負相關(guān)(R=-0.006，P=0.008)；精卵共孵育時間與優(yōu)質(zhì)胚胎率呈顯著負相關(guān)(R=-0.057，P=0.012)(表4)。

四、卵母細胞孵育時間和精卵共孵育時間對短時受精臨床結(jié)局的影響

采用二元Logistics回歸排除了女方年齡、BMI、子宮內(nèi)膜厚度、獲卵數(shù)、移植囊胚占比和胚胎移植個數(shù)的影響。結(jié)果顯示，2 060例患者行短時受精助孕，其中短時受精失敗行早期補救ICSI 119例，卵母細胞孵育時間和精卵共孵育時間對于短時受精是否失敗均非獨立影響因素(P>0.05)；1 193例行短時受精新鮮周期移植的患者中，卵母細胞孵育時間與精卵共孵育時間對新鮮周期移植的臨床妊娠率、種植率和流產(chǎn)率均非獨立影響因素(P>0.05)(表5)。

表4 卵母細胞孵育時間、精卵共孵育時間與短時受精胚胎結(jié)局的相關(guān)性分析

表5 卵母細胞孵育時間、精卵共孵育時間對短時受精臨床結(jié)局的二分類Logistic回歸分析

討 論

體外受精通常采用長受精，精卵共孵育18～20 h，但發(fā)生完全不受精比例為4%～16%[12]，而在不明原因不孕的患者中，這一比例甚至高達25%[13]。短時受精縮短精卵共孵育時間為1～6 h，聯(lián)合補救ICSI成為預(yù)防完全受精失敗和受精率低的有效方法[14]。很多研究表明短時受精可提高卵母細胞利用率和胚胎種植率，人類自然生理條件不會出現(xiàn)高濃度精子與卵母細胞共同孵育情況，短時受精縮短了高濃度精子對卵母細胞作用，更接近生理狀態(tài)。因此，短時受精已被廣泛應(yīng)用于體外受精-胚胎移植技術(shù)中[3-4]。

受精前卵母細胞孵育時間對IVF-ET結(jié)局的影響存在爭義，增加受精前卵母細胞孵育時間有利于卵母細胞質(zhì)成熟，核質(zhì)同步成熟是卵子受精和優(yōu)質(zhì)胚胎獲得的有力保障。蔡慧中等[15]發(fā)現(xiàn)在注射HCG后38～42 h范圍內(nèi)授精，授精時機在41～42 h時優(yōu)質(zhì)胚胎率和可利用胚胎率最高，并且可獲得較好的臨床妊娠率，但卵母細胞體外孵育時間過長可引起卵母細胞的老化，且培養(yǎng)基中代謝廢物的積累均可導致非整倍體概率的增加[16-17]，錯過最佳受精時機。本研究顯示注射HCG后38～40 h授精，隨著卵母細胞孵育時間的增加，多原核受精明顯降低，但正常受精率、囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率和可移植胚胎率沒有顯著變化。卵母細胞孵育時間3～4 h和精卵共孵育時間1～6 h的條件下，授精時機不影響短時受精失敗，同時對臨床妊娠率、種植率和流產(chǎn)率也沒有明顯的影響。

然而調(diào)整授精前后孵育時間可能改善特定人群助孕結(jié)局。近年有研究報道適當延長卵母細胞體外培養(yǎng)時間[HCG注射后(41±1)h授精]是高齡卵巢低反應(yīng)患者獲得優(yōu)質(zhì)胚胎的一種簡單有效的方法[18]，Le Bras等[19]就證實縮短精卵共孵育時間可以改善胚胎碎片多患者的胚胎質(zhì)量。考慮到雌激素水平可能是反映卵母細胞成熟度的有效指標[20]，本研究根據(jù)HCG注射日雌激素水平的中位數(shù)將新鮮周期移植患者二分類為低E2組(E2≤11 129.63 pmol/L，A組)和高E2組(E2>11 129.63 pmol/L，B組)，再根據(jù)取卵至授精時長分為短卵母細胞孵育時間組(≤3 h，A1組和B1組)和長時間卵母細胞孵育時間組(>3 h，A2組和B2組)，探討扳機日不同血清雌激素水平時授精前后孵育時間對IVF-ET妊娠結(jié)局的影響。A組獲卵數(shù)、HCG日E2和P水平顯著低于B組，但A、B組內(nèi)亞組間比較無顯著差異(P>0.05)，因此，A1與A2以及B1與B2的胚胎結(jié)局和妊娠結(jié)局有一定的可比性。B2組優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著高于B1組(P<0.05)，A2組優(yōu)質(zhì)胚胎率較A1組有增高趨勢，但差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。HCG日E2水平較低時A2組的種植率顯著高于A1組(P<0.05)；HCG日E2水平較高時B1和B2兩組種植率沒有顯著差異。因此，注射HCG日E2水平較低時增加卵母細胞孵育時間降低精卵共孵育時間，可能獲得較好的IVF-ET結(jié)局。

減少了精卵共孵育時間是否影響卵母細胞受精率是胚胎技術(shù)人員最關(guān)心的問題，多數(shù)研究表明縮短精卵共孵育時間并不影響受精率。中國專家共識建議短時受精加精時間為HCG注射后38～40 h，精卵共孵育時間1～6 h受精率和胚胎結(jié)局較為理想[6]。本研究納入病例的受精時間和精卵共孵育時間均在專家共識建議范圍內(nèi)。取卵時間和脫顆粒細胞時間相對固定的情況下，授精時機影響取卵后卵母細胞孵育時間和精卵共孵育時間。本研究顯示隨著卵母細胞孵育時間的延長，精卵共孵育時間(R=-0.318，P=0.000)顯著縮短。理想條件下，哺乳動物性交后20 min內(nèi)可使卵母細胞受精[21]，熒光標記的精子與正常卵冠丘復合體共孵育15 min進入卵丘，3 h內(nèi)穿過卵丘層，4 h出現(xiàn)在卵母細胞皮層，且精卵共孵育時間16 h比1 h多精受精率高，這表明縮短精卵共孵育時間到1 h不影響卵母細胞受精[22]。這與我們的研究結(jié)果相似，在1～6 h內(nèi)，精卵共孵育時間與短時受精失敗沒有顯著相關(guān)性，但男方精液質(zhì)量、加精濃度和操作流程均可能影響受精率，不同生殖中心可能有不一樣的結(jié)果。早期大量研究表明短時受精縮短了高濃度精子對卵母細胞作用，更接近生理狀態(tài)。常規(guī)體外受精時較短時受精時具有較高濃度的活性氧(reactive oxygen species，ROS)[23]，顆粒細胞持續(xù)分泌E2及 P[24]，高水平E2對胚胎有毒性作用，縮短精卵共孵育時間可降低ROS，較早去除大量顆粒細胞可以降低ROS和E2等對胚胎的不利因素。在短時受精中精卵共孵育時間是否對胚胎發(fā)育潛能有影響，目前沒有報道。我們的數(shù)據(jù)顯示，精卵共孵育時間1～6 h范圍內(nèi)，隨著精卵共孵育時間增加優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著降低(R=-0.057，P=0.012)。短時受精中降低精卵共孵育時間可能通過降低大量精子產(chǎn)生的ROS對胚胎發(fā)育潛能的負面影響，提高優(yōu)質(zhì)胚胎率。這可能是本研究中HCG日E2水平較低時A2組胚胎種植率顯著高于A1組的原因，而HCG日高E2組具有較高的獲卵數(shù)，新鮮周期可以獲得較多優(yōu)質(zhì)胚胎用于移植，B1和B2組的首次移植周期胚胎種植率沒有顯著差異。

綜上所述，隨著卵母細胞孵育時間的延長，精卵共孵育時間顯著縮短；卵母細胞孵育時間3～4 h和精卵共孵育時間1～6 h的條件下，隨著卵母細胞孵育時間的增加多原核受精率降低，精卵共孵育時間的增加不利于優(yōu)質(zhì)胚胎的形成；授精前后孵育時間非影響短時受精失敗、臨床妊娠率、種植率和流產(chǎn)率的獨立影響因素。但若注射HCG日E2水平≤11 129.63 pmol/L，建議增加卵母細胞孵育時間降低精卵共孵育時間，可能獲得較好的胚胎種植率。調(diào)整授精時機，適當延長卵母細胞孵育時間降低精卵共孵育時間的策略是否能夠改善IVT-ET的結(jié)局有待進一步前瞻性隨機對照研究，期望為IVF-ET精細化治療提供參考。