于婷喬，劉藝芳，袁慶葉，石興宇，李欣

(1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院國際教育學(xué)院，北京 102442；2.華大智造科技股份有限公司，深圳 518000)

國內(nèi)外研究顯示胰島素抵抗、肥胖、多囊卵巢綜合征(PCOS)等代謝性疾病患者血清脂聯(lián)素(ADP)水平較低[1]。2004年Sieminska等[2]報道了ADP與PCOS臨床表現(xiàn)的相關(guān)性，ADP可以改善脫氫表雄酮(DHEA)誘導(dǎo)的小鼠PCOS表型，并上調(diào)棕色脂肪組織(BAT)活性[3]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，ADP可以影響雙氫睪酮(DHT)誘導(dǎo)的PCOS小鼠卵巢組織中性激素類固醇合成相關(guān)酶Cyp19a1、Hsd3b的mRNA水平[4]。在PCOS大鼠模型中，卵巢組織中ADP受體1和2的表達增加[5-6]，在一定程度上表明，ADP可能通過直接作用于卵巢組織改善PCOS癥狀。卵巢組織中含有顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞，PCOS卵巢膜細(xì)胞中ADP受體表達下降[7]，在膜細(xì)胞中ADP抑制雄烯二酮合成和雄激素合成途徑中關(guān)鍵酶表達[8]。胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞暴露于ADP同樣可以改變其類固醇生成途徑[9]。此外，PCOS中ADP水平的降低可能與胰島素抵抗和氧化應(yīng)激(OS)的增加有關(guān)[2]。ADP通過降低氧化應(yīng)激或通過脂聯(lián)素受體1(adipor1)介導(dǎo)的NF-κB通路在a、β暴露的腦內(nèi)皮細(xì)胞(bEnd)中抑制膿毒癥內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[10]。顆粒細(xì)胞在卵子生長和發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，是卵巢組織合成雌激素的主要位點。但是在卵巢顆粒細(xì)胞中，ADP對雌激素合成和氧化應(yīng)激的影響還尚不清楚。

因此，本研究通過利用人卵巢顆粒細(xì)胞系(KGN細(xì)胞)外源添加ADP，在毛喉素(forskolin，F(xiàn)SK)處理的前提下，分析細(xì)胞中雌二醇、孕酮和芳香化酶(aromatase)的蛋白表達，觀察ADP對KGN細(xì)胞中雌激素合成的影響；并進一步利用氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑叔丁基過氧化氫(tBHP)和ADP聯(lián)合處理，觀察ADP對tBHP誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的改善作用。以期探究ADP改善PCOS卵巢功能的分子機制，為PCOS相關(guān)疾病的診療提供參考。

材料和方法

一、實驗材料

1.細(xì)胞來源：KGN來源于國家生物醫(yī)學(xué)實驗細(xì)胞資源庫(HTX2045，北京)。

2.主要試劑：DMEM/F12(上海Basalmedia)；胎牛血清(FBS)(Gibco，新西蘭)；MTT(88417)、人ADP/Acrp 30/ADIPOQ蛋白(SRP4592)、Forskolin(F3917)(默克，美國)；DCFH-DA(S0033)、丙二醛(MDA)試劑盒及FITC Annexin V凋亡檢測試劑盒(碧云天生物)；tBHP溶液(上海麥克林生化)；雄烯二酮(大連美倫生物)；兔源Aromatase(#14528)、鼠源SOD1(#4266)、兔源SOD2(#13141)和鼠源b-actin(#12262)的抗體(Cell Signaling，美國)；超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)檢測試劑盒(南京建成生物)。

二、研究方法

1.KGN 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理：KGN細(xì)胞在添加25 mmol/L葡萄糖、10%FBS、1%青霉素和鏈霉素的DMEM/F12中生長。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長至85%～90%時進行細(xì)胞傳代，將細(xì)胞接種于6孔板。由于KGN細(xì)胞無合成雄激素的能力，因此細(xì)胞中添加雄烯二酮(100 nmol/L)。

為了分析ADP對KGN細(xì)胞活力的影響，ADP的濃度設(shè)置了0、0.05、0.125、0.25、0.5、1.0 μg/ml共6個濃度，每組(每個濃度)8個孔，添加ADP后培養(yǎng)24 h，用MTT定量比色法在96孔板上測定細(xì)胞活力[9]，選取一個合適濃度(0.05 μg/ml)用于后續(xù)實驗。

鑒于FSK具有調(diào)控類固醇激素合成作用，在分析ADP對KGN細(xì)胞雌激素合成的影響時，將細(xì)胞分為4組，分別為空白對照組、FSK組(3 μmol/L)[11]、ADP組(0.05 μg/ml)、ADP(0.05 μg/ml)+ FSK(3 μmol/L)組，藥物處理24 h后收集細(xì)胞。用于檢測雌激素水平。

此外，將KGN細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞聚集達到70%，用ADP(0.05 μg/ml)單獨或混合tBHP(150 μmol/L)處理24 h，并設(shè)置空白對照，收集細(xì)胞用于檢測細(xì)胞抗氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和芳香化酶蛋白表達。

2.雌二醇和孕酮的測定：收集ADP和(或)FSK處理的各組細(xì)胞，1 000g離心3～5 min后，收集細(xì)胞上清，按照ELISA試劑盒(武漢賽培)的使用說明檢測雌二醇和孕酮的水平。

3.細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)測定：用DCFH-DA分光光度法測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平。按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，終濃度為10 μmol/L。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，在37℃下加入1 ml的10 μmol/L熒光染料進行孵育，20 min后去除熒光染料，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，充分去除未進入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。使用熒光顯微鏡成像(BX43，Olympus，日本)，并利用多功能酶標(biāo)儀器(Infinite F50，Tecan，奧地利)檢測488/525 nm熒光強度。

4.氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測：收集不同分組處理的KGN細(xì)胞2105個，1 000g離心3～5 min，分離細(xì)胞上清，按照各個指標(biāo)檢測試劑盒中的操作說明進行檢測。

5.細(xì)胞凋亡檢測：采用FITC Annexin V凋亡檢測試劑盒(碧云天生物)。將KGN細(xì)胞以約4×105細(xì)胞的密度接種在6個培養(yǎng)皿中，每組3個。ADP加或不加tBHP孵育24 h后，收集細(xì)胞，用冷PBS沖洗2次，195 μl 1× binding buffer重懸為1×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，加入5 μl FITC-Annexin V和10 μl PI，輕輕旋轉(zhuǎn)樣品，在20～25℃黑暗中孵育15 min，1 h內(nèi)用FACScan流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson，美國)檢測分析。

6.蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)：收集細(xì)胞，PBS洗滌3次后加入RIPA裂解液處理30 min，4℃，12 000g離心20 min，收集上清，利用BCA檢測蛋白濃度后，取20 μg上樣，進行SDS凝膠電泳分離并進行PVDF轉(zhuǎn)膜[12]。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%BSA封閉30 min，然后加入一抗，其中一抗稀釋比例為1∶2 000(3% BSA稀釋)，4℃孵育，搖床搖動過夜；TBST 漂洗5次，每次5 min，再加入二抗(稀釋比例為1∶7 500，5%脫脂奶粉稀釋)，二抗常溫孵育1 h后，TBST 漂洗。將洗好的膜放置于保鮮膜上，按照ECL發(fā)光試劑盒用成像系統(tǒng)顯影(Amersham image 600，GE，瑞典)檢測。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、KGN細(xì)胞中ADP促進FSK誘導(dǎo)雌二醇的合成

為了檢測ADP對KGN細(xì)胞活力的影響，使用不同濃度的ADP處理KGN細(xì)胞24 h，MTT法檢測細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，不同ADP濃度對細(xì)胞活力的影響不同，與空白對照組(0 μg/ml)相比，0.25 μg/ml ADP抑制了KGN細(xì)胞活力，而0.05 μg/ml ADP顯著增強了KGN細(xì)胞活力(P<0.05)(圖1A)。后續(xù)實驗采用0.05 μg/ml ADP。

ADP對性激素合成影響的實驗結(jié)果顯示，與空白對照組(Con)相比，F(xiàn)SK組的孕酮和雌二醇水平均顯著升高(P<0.05)，而ADP組無顯著性變化(P>0.05)；與FSK組相比，ADP+ FSK組的孕酮和雌二醇水平也均顯著升高(P<0.05)(圖1B、C)。

ADP對芳香化酶表達影響的實驗結(jié)果顯示，與空白對照組(Con)相比，F(xiàn)SK組KGN細(xì)胞中芳香化酶的蛋白表達水平顯著上升(P<0.05)；而與FSK組相比，ADP+FSK組芳香化酶表達水平雖有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖1D、E)。

二、ADP抑制tBHP誘導(dǎo)的KGN細(xì)胞氧化應(yīng)激

利用DCFH-DA染色檢測ADP對tBHP誘導(dǎo)的ROS積累的影響，結(jié)果表明，與空白對照組(Con)相比，tBHP(150 μmol/L)組的ROS水平和MDA水平顯著增加、SOD活性顯著下降(P<0.05)；與tBHP組相比，ADP+ tBHP組的ROS水平和MDA水平顯著下降、SOD活性顯著上升(P<0.05)；T-AOC水平在各組之間無顯著性變化(P>0.05)(圖2)。

A：不同濃度ADP對細(xì)胞活力的影響；B：各組細(xì)胞的雌二醇水平；C：各組細(xì)胞的孕酮水平；D：各組細(xì)胞芳香化酶蛋白的Western Blot圖譜；E：各組細(xì)胞芳香化酶蛋白表達水平。與Con組比較，*P<0.05；與FSK組比較，#P<0.05。圖1 ADP對 KGN細(xì)胞活力及雌激素合成的影響

A：各組細(xì)胞的DCFH-DA染色熒光顯微鏡成像；B～E：各組細(xì)胞的氧化應(yīng)激指標(biāo)水平。與Con組比較，*P<0.05；與tBHP組比較，#P<0.05。圖2 各組細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平比較

三、ADP可抑制tBHP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與空白對照組(Con)相比，ADP組細(xì)胞凋亡水平顯著下降，而tBHP組的細(xì)胞凋亡水平顯著上升(P<0.05)；與 tBHP組相比，ADP+tBHP組的凋亡水平顯著下降(P<0.05)，接近于空白對照水平(P>0.05)(圖3)。

四、ADP能上調(diào)SOD1蛋白的表達

為研究ADP對于抗氧化蛋白表達水平的影響，我們檢測了KGN細(xì)胞中兩種SOD亞型的表達：銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD即SOD1)和錳超氧化物歧化酶(MnSOD或SOD2)。實驗結(jié)果表明，與空白對照(Con)組相比，ADP組的SOD1蛋白水平顯著升高(P<0.05)，而SOD2的蛋白水平無顯著性變化(P>0.05)(圖4)。

A：各組細(xì)胞的流式細(xì)胞檢測圖；B：各組的細(xì)胞凋亡水平。與Con組比較，*P<0.05；與tBHP組比較，#P<0.05。圖3 各組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡水平比較

A：兩組細(xì)胞表達SOD蛋白的Western Blot圖；B：兩組細(xì)胞的SOD1蛋白和SOD2蛋白表達水平。與Con組比較，*P<0.05。圖4 ADP組與空白對照組的SOD蛋白表達水平比較

討 論

臨床上PCOS與低ADP水平和高氧化應(yīng)激水平相關(guān)。然而，PCOS中ADP與氧化應(yīng)激的關(guān)系尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，ADP可通過增強SOD1表達和SOD活性，抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的KGN細(xì)胞凋亡。此外，我們發(fā)現(xiàn)ADP可能通過芳香化酶相關(guān)途徑影響雌二醇和孕酮的合成。

ROS的過量產(chǎn)生會激活氧化應(yīng)激，進而損害細(xì)胞活力，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。雙酚A[13]、鎘[14]、小檗堿[15]等均可以通過ROS積累而誘導(dǎo)KGN細(xì)胞凋亡。在小鼠骨樣細(xì)胞(MLO-Y4)中，ADP可以降低ROS水平，并抑制骨細(xì)胞凋亡[16]。與以往研究結(jié)果相一致，本研究發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，tBHP處理可以導(dǎo)致KGN細(xì)胞中MDA水平增加和SOD活性下降，導(dǎo)致KGN細(xì)胞的凋亡；與tBHP處理組相比，聯(lián)合ADP處理后可以顯著下調(diào)MDA水平，并上調(diào)SOD活性。單獨ADP處理即可降低KGN細(xì)胞凋亡水平，在一定程度上表明ADP可能作為抗ROS因子或ROS清除劑以緩解氧化應(yīng)激，從而在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起保護劑的作用。

SOD能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，是抗氧化酶防御ROS的第一道和最重要的防線[9]。我們前面的研究結(jié)果表明，添加ADP可抑制tBHP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，并上調(diào)細(xì)胞中總SOD活性。為了進一步探討ADP調(diào)控氧化應(yīng)激的分子機制，我們檢測了KGN細(xì)胞中兩種SOD亞型(SOD1和SOD2)的表達，發(fā)現(xiàn)ADP上調(diào)SOD1蛋白表達水平，但對SOD2表達無顯著影響。結(jié)果提示ADP的抗氧化能力可能是通過上調(diào)SOD1的表達來實現(xiàn)的。此外，在不同細(xì)胞類型，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞[17]中同樣發(fā)現(xiàn)，多種物質(zhì)可以通過靶向SOD1發(fā)揮抗氧化作用而參與細(xì)胞凋亡[18-19]。

ADP是脂肪組織分泌的一種脂肪因子，與健康個體的肥胖程度呈負(fù)相關(guān)[20-21]。ADP水平降低最明顯的后果可能是胰島素敏感性降低[22-23]。本研究顯示，低濃度ADP(0.05 μg/ml)可增強FSK促KGN細(xì)胞生成孕酮和雌二醇的作用；同時檢測到ADP處理后芳香化酶蛋白水平升高。在人顆粒細(xì)胞中，在FSH或IGF-1濃度為5 μg/ml時，ADP可增強孕酮和雌二醇的分泌[24-25]。此外，小鼠ADP基因的缺失會干擾激素發(fā)生、卵泡發(fā)育并降低生育力[26]。因此，了解ADP通過芳香化酶影響性激素的合成有利于探索ADP對卵巢功能影響，進而有助于研究PCOS的發(fā)病機制。

PCOS患者ADP水平較低可能與氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA水平及GSH-PX活性有關(guān)。PCOS患者的氧化和抗氧化平衡被破壞。ROS和氧化應(yīng)激提高了誘導(dǎo)PCOS的發(fā)生和細(xì)胞周期阻滯幾率，導(dǎo)致卵母細(xì)胞凋亡[27]。我們的研究結(jié)果表明，ADP可以通過上調(diào)KGN細(xì)胞中SOD1的表達作為活性氧清除劑；ADP可降低氧化應(yīng)激水平，挽救tBHP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。ROS的過量產(chǎn)生會激活氧化應(yīng)激，進而破壞胰島素信號傳導(dǎo)，觸發(fā)絲氨酸/蘇氨酸激酶的激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[28]。此外，ADP通過抑制氧化應(yīng)激激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[27]，從而降低膿毒癥引起的細(xì)胞凋亡。有研究顯示ADP誘導(dǎo)A549人肺泡上皮細(xì)胞脂質(zhì)過氧化增加，并以時間和劑量依賴的方式降低細(xì)胞活力[29]，本研究研究結(jié)果相反，這種差異可能是由于細(xì)胞系的不同以及藥物劑量和實驗方法的不同。在本研究中，低濃度ADP足以抑制tBHP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和KGN細(xì)胞凋亡。

高雄激素血癥是PCOS的臨床特征之一。有研究報道，在H2O2處理的大鼠肝細(xì)胞(BRL-3A)中，脫氫表雄酮(DHEA)可提高抗氧化酶活性，減少ROS生成[29]。在人卵巢顆粒細(xì)胞(HO-23)中，脫氫表雄酮可以恢復(fù)饑餓誘導(dǎo)的ROS生成。因此，PCOS患者，氧化應(yīng)激的過度產(chǎn)生可能是由于人卵泡液中SOD活性的降低[30]。細(xì)胞中抗氧化酶SOD能保護細(xì)胞免受自由基的破壞，SOD催化O2-分解生成H2O2和O2，其速率是生理pH條件下自發(fā)分解的104倍。我們的結(jié)果提示，ADP的抗氧化能力是通過靶向調(diào)控SOD來實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究利用KGN為細(xì)胞模型，分析ADP對KGN細(xì)胞中雌激素合成、氧化應(yīng)激水平和細(xì)胞凋亡的影響。研究結(jié)果表明，ADP可以增強芳香化酶的表達，促進KGN細(xì)胞中雌激素合成；此外，ADP通過提高SOD1的表達和SOD的活性，抑制tBHP誘導(dǎo)的KGN細(xì)胞的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。本研究為探索ADP改善卵巢功能，緩解PCOS的內(nèi)在機制提供了一定參考。