袁振亞，袁牧，林繼慧，黃曉潔，朱云霞，宋雪梅

(徐州市婦幼保健院生殖醫(yī)學中心，徐州 221009)

反復種植失敗(RIF)是指在輔助生殖治療周期中，接受多次優(yōu)質胚胎移植均無法成功妊娠[1-2]。RIF在IVF-ET周期中的發(fā)生率高達10%～15%，其中約2/3的發(fā)生原因是子宮內膜不在容受期[3-6]。子宮內膜在特定時期才具有對胚胎的接受能力，稱為種植窗(window of implantation，WOI)，處于WOI的內膜對胚胎具有最佳的容受性[7]。WOI出現(xiàn)的時間存在個體差異，按照統(tǒng)一的標準推算WOI，可能會有部分患者在子宮形態(tài)學和組織學完全正常的情況下，接受優(yōu)質胚胎種植后無法成功妊娠。因此，選擇合適的時機進行胚胎移植是治療RIF、提高IVF-ET臨床妊娠率的一種可行方法。

子宮內膜容受性檢測(Endometrial receptivity testing，ERT)依托下一代測序(next-generation sequencing，NGS)技術，對子宮內膜容受性相關基因表達量進行分析，構建容受前期、容受期和容受后期預測模型。將受檢者NGS結果代入模型，可以預測受檢者當前子宮內膜是否處于容受期。根據ERT預測結果及時調整移植策略，在最佳容受期為受檢者植入胚胎，可顯著提高臨床妊娠率[8-12]。多項ERT臨床試驗研究顯示，接受ERT評估后移植的RIF患者凍融胚胎移植(FET)周期(無論是卵裂期胚胎或囊胚期胚胎)的種植率、臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率均顯著高于未行ERT評估的普通FET周期[13-21]。為進一步評估ERT技術在中國RIF人群中的應用效果，我們對接受ERT評估后RIF患者的FET周期結局進行了回顧分析，探究ERT技術在本地區(qū)RIF患者IVF-ET周期中的應用價值。

資料和方法

一、研究對象

本研究選取2019年1月至2021年12月在徐州市婦幼保健院生殖醫(yī)學中心接受FET的RIF患者和非RIF患者。接受ERT評估后移植的RIF患者納入ERT組(n=60)，沒有接受ERT評估的RIF患者納入非ERT組(n=151)，同期非RIF患者納入非RIF組(n=503)。

納入標準：ERT組和非ERT組患者符合本中心RIF的診斷標準(移植3次及以上或移植高評分卵裂期胚胎數4～6個或高評分囊胚數3個及以上均失敗)；FET周期，采用激素替代周期進行內膜準備，移植1～2枚卵裂期胚胎或1枚囊胚或1枚卵裂期胚胎+1枚囊胚序貫移植；移植胚胎均為優(yōu)質胚胎(優(yōu)質卵裂期胚胎：7CⅡ及以上，碎片率10%及以下；優(yōu)質囊胚：內細胞團和滋養(yǎng)層評級均為B及以上)。

排除標準：FET前子宮內膜厚度小于7 mm；FET前患有復發(fā)性流產；接受胚胎植入前遺傳學檢測(pre-implantation genetic testing，PGT)周期的FET。

ERT技術的臨床應用通過了徐州市婦幼保健院生殖醫(yī)學倫理委員會的醫(yī)療技術臨床應用倫理審查(審查意見號：XFYJL-2021-15)。

二、診療回顧

1.ERT評估模型：中南大學湘雅醫(yī)院和江蘇億康基因科技有限公司合作開發(fā)了基于轉錄組測序的ERT技術(專利號：201910324707.0)，構建了子宮內膜容受前期、容受期、容受后期模型。采集受試者的子宮內膜樣本，提取mRNA進行高通量測序，獲得受試者的子宮內膜轉錄組信息代入模型進行分析，可以客觀、精準地判斷受試者的種植窗是否發(fā)生偏移，推算出受試者子宮內膜最佳容受期，準確率達98.4%，對RIF患者胚胎移植具有重要的臨床指導意義[21]。本研究采用該模型，評估ERT在RIF患者FET中的應用效果。

2.激素替代方案準備內膜：月經第2天，ERT組、非ERT組、非RIF組患者使用長效促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a，麗珠醫(yī)藥集團)，隨后使用雌二醇4～6 mg/d連用14 d(雅培，荷蘭)。非ERT組、非RIF組患者使用黃體酮(默克雪蘭諾，英國)轉化5 d(使用第1天定義為P+0)，第6天d(P+5)停用黃體酮，進行FET。ERT組患者第6天(P+5)停用黃體酮，接受內膜活檢，根據ERT結果調整使用黃體酮的轉化時長再行FET。

3.ERT評估：在ERT組患者黃體酮轉化第6天(P+5)使用一次性子宮內膜樣本采樣器(蘇州序康醫(yī)療科技)伸入宮腔抽吸約3 mm大小的活檢樣本，推入RNA樣本保存液(蘇州序康醫(yī)療科技)4℃保存；使用RNeasy Micro Kit試劑盒(Qiagen，德國)進行mRNA提取，使用MALBAC白金微量 RNA 擴增試劑盒(蘇州億康基因科技)進行RNA擴增，使用NGS 通用 Index 試劑盒(Illumina，美國)和Miseq基因測序儀(Illumina，美國)進行mRNA測序；將測序結果代入子宮內膜容受期模型，可判斷患者當前的內膜狀態(tài)(容受前期、容受期或容受后期)，以便調整移植時間，在容受期進行FET[21]。

4.FET：本研究選擇3種胚胎移植策略：(1)1～2枚卵裂期優(yōu)質胚胎；(2)1枚優(yōu)質囊胚；(3)移植1枚卵裂期優(yōu)質胚胎后2～3 d再移植1枚優(yōu)質囊胚(序貫移植)。根據患者IVF周期的實際情況，選擇合適的移植策略進行FET。

三、分析指標

各組患者基礎資料，包括女方年齡、不孕年限、體質量指數(BMI)、基礎激素水平；FET相關資料，包括移植日內膜厚度、移植胚胎數、胚胎種植率(孕囊數/移植胚胎數)、HCG陽性率(HCG陽性FET周期數/FET周期數)、生化妊娠率(生化妊娠FET周期數/FET周期數)、宮內妊娠率(宮內妊娠FET周期數/FET周期數)、異位妊娠率(異位妊娠FET周期數/FET周期數)、流產率(流產FET周期數/獲宮內妊娠FET周期數)、活產率(活產分娩周期數/FET周期數)；ERT組患者種植窗偏移率(種植窗偏移患者數/接受ERT評估患者數)。

四、統(tǒng)計學處理

結 果

一、患者一般資料

本研究共納入了符合標準的患者的714個FET周期。其中，接受ERT評估后移植的RIF患者(ERT組)60周期，未接受ERT評估的RIF患者(非ERT組)151周期，同期非RIF患者(非RIF組)503周期。

各組間女方年齡、不孕年限、BMI、抗苗勒管激素(AMH)水平及基礎激素水平均無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 患者一般資料(-±s)

二、ERT評估結果及相應移植時機調整

ERT組60個周期中有58個周期出現(xiàn)了種植窗的偏移，即在常規(guī)內膜準備情況下，按月經周期推算出的移植時期實際為容受前期，偏移率達到了96.67%(58/60)。容受前期屬于子宮內膜的非容受期，在這個階段對種植胚胎的容受性較差。根據ERT檢測結果，這58個周期的移植時間較常規(guī)移植時間推后1～2 d，而2個種植窗未發(fā)生偏移的周期移植時間不變。

三、FET周期結局

各組間移植日內膜厚度、移植胚胎數、生化妊娠率、異位妊娠率均無顯著差異(P>0.05)。ERT組胚胎種植率、HCG陽性率、宮內妊娠率、活產率均顯著高于非ERT組(P<0.05)，與非RIF組相當(P>0.05)。ERT組流產率顯著低于非ERT組(P<0.05)，且與非RIF組相當(P>0.05)。非ERT組HCG陽性率、宮內妊娠率低于非RIF組，但無顯著差異(P>0.05)。非ERT組流產率顯著高于非RIF組，而胚胎種植率、活產率顯著低于非RIF組(P<0.05)(表2)。

表2 患者FET周期結局[(-±s)，%]

四、不同移植策略的FET周期結局

1.移植1～2枚優(yōu)質卵裂期胚胎：ERT組、非ERT組與非RIF組分別有32周期、74周期、218周期移植1～2枚優(yōu)質卵裂期胚胎。各組間移植日內膜厚度、移植胚胎數、HCG陽性率、異位妊娠率無顯著差異(P>0.05)。ERT組種植率、宮內妊娠率、活產率顯著高于非ERT組(P<0.05)，且與非RIF組相當(P>0.05)。ERT組流產率顯著低于非ERT組與非RIF組(P<0.05)。ERT組生化妊娠率顯著低于非ERT組(P<0.05)，且與非RIF組相當(P>0.05)。非ERT組胚胎種植率、宮內妊娠率、活產率顯著低于非RIF組，而生化妊娠率、流產率顯著高于非RIF組(P<0.05)(表3)。

2.移植1枚優(yōu)質囊胚：ERT組、非ERT組與非RIF組分別有18周期、44周期、161周期移植了1枚優(yōu)質囊胚。各組移植日內膜厚度、移植胚胎數、生化妊娠率、異位妊娠率、流產率均無顯著差異(P>0.05)。ERT組種植率、HCG陽性率、宮內妊娠率均顯著高于非ERT組與非RIF組(P<0.05)。ERT組活產率顯著高于非ERT組(P<0.05)，與非RIF組相當(P>0.05)。非ERT組HCG陽性率、宮內妊娠率、活產率低于非RIF組，但無顯著差異(P>0.05)。非ERT組胚胎種植率顯著低于非RIF組(P<0.05)(表4)。

表3 移植卵裂期胚胎的FET結局比較[(-±s)，(%)]

表4 移植單個囊胚的FET結局比較[(-±s)，(%)]

續(xù)表

3.序貫移植1枚優(yōu)質卵裂胚+1枚優(yōu)質囊胚：ERT組、非ERT組、非RIF組分別有10周期、33周期、124周期移植了1枚優(yōu)質卵裂期胚胎+1枚優(yōu)質囊胚。各組間移植日內膜厚度、移植胚胎數、生化妊娠率、異位妊娠率均無顯著差異(P>0.05)。ERT組HCG陽性率、宮內妊娠率顯著高于非ERT組與非RIF組(P<0.05)。ERT組種植率高于非ERT組，但無顯著差異(P>0.05)，且均顯著低于非RIF組(P<0.05)。ERT組活產率顯著高于非ERT組(P<0.05)，與非RIF組相當(P>0.05)。ERT組流產率顯著低于非ERT組(P<0.05)，但均顯著高于非RIF組(P<0.05)。非ERT組HCG陽性率、宮內妊娠率低于非RIF組，但均無顯著差異(P>0.05)。非ERT組活產率顯著低于非RIF組(P<0.05)(表5)。

五、ERT組宮內妊娠分析

ERT組有40個FET周期獲得了宮內妊娠，其基礎激素水平、女方年齡、移植胚胎數、BMI、不孕年限、移植日內膜厚度、移植1枚囊胚FET周期數占比、序貫移植FET周期數占比與20個未獲宮內妊娠的FET周期均無顯著差異(P>0.05)；未獲宮內妊娠的ERT組患者移植卵裂期胚胎的FET周期數占比顯著高于獲得宮內妊娠的患者(P<0.05)(表6)。

表5 移植卵裂期胚胎+囊胚的FET結局比較[(-±s)，(%)]

表6 ERT組獲宮內妊娠與未獲宮內妊娠患者一般資料比較[(-±s)，n(%)]

討 論

RIF是人類輔助生殖領域中亟待解決的重要問題，其發(fā)生原因繁雜且仍未完全被闡明，主要包括胚胎因素、免疫因素及宮腔因素等。多種免疫因子參與了胚胎種植和發(fā)育的過程，在RIF發(fā)生中發(fā)揮重要作用，但目前對于RIF患者是否應使用免疫治療仍存在爭議[22-23]。相比較于卵裂期胚胎，囊胚擁有更好的發(fā)育潛能和移植結局，可獲得更高的臨床妊娠率[24-25]。臨床上，可采用PGT技術幫助篩選整倍體胚胎移植，降低因胚胎染色體異常導致種植失敗、胚胎停育或自然流產的發(fā)生率，提高臨床妊娠率[26]。

子宮內膜的容受狀態(tài)對FET結局具有重要影響[21]。排除宮腔解剖學異常的因素，如果多次優(yōu)質胚胎移植、甚至通過PGT技術獲得整倍體胚胎移植后仍未獲得成功妊娠，就需要考慮在胚胎移植時子宮內膜是否處于最佳容受期[27-28]。臨床上通過改良促排卵方案、移植前宮腔搔刮、宮腔鏡糾正內膜形態(tài)、移植前宮腔灌注HCG等可改善子宮內膜容受性，提高RIF患者胚胎種植率和臨床妊娠率[29]。本研究結果證明，接受了ERT評估的RIF患者FET的胚胎種植率、宮內妊娠率與活產率均顯著高于未接受ERT的RIF患者，且相當于非RIF患者，這與前期ERT研究[21，30]結果一致。

雖然結果顯示ERT評估對RIF患者的FET結局具有顯著改善作用，但本項研究存在局限性。接受ERT評估的RIF患者樣本量較小，仍需更大樣本量驗證ERT評估對RIF患者FET結局的影響。此外，有一部分RIF患者經過ERT評估后仍未成功獲得臨床妊娠的情況值得關注。ERT是一種根據子宮內膜轉錄因子的變化特征判斷胚胎最佳種植時期的技術，其本質上并不能改善患者的子宮內膜容受性，對于本身子宮內膜容受狀態(tài)較差的患者作用不佳。本研究發(fā)現(xiàn)，相比獲得宮內妊娠的ERT組RIF患者，未獲宮內妊娠的ERT組RIF患者移植卵裂期胚胎的FET周期占比較高(65.00% vs. 47.50%，P<0.05)。比較ERT組三種移植策略的FET結局，僅移植卵裂期胚胎獲得的宮內妊娠率(59.38%)低于移植單個囊胚(72.22%)和序貫移植(80.00%)的宮內妊娠率，提示經ERT評估的RIF患者采用單個囊胚移植和序貫移植的策略可能獲得更佳的FET結局，但仍需要更多臨床研究和基礎實驗進一步探討。

RIF在IVF治療中的發(fā)生率可達10%～15%，其復雜的病因決定了治療方法的多樣化，需要針對不同病患人群選擇合適的治療方案，這正是目前輔助生殖領域面臨的挑戰(zhàn)。本研究中患者平均年齡較小(≤33歲)，通過ERT評估后移植獲得了較好的FET結局，但ERT對高齡RIF患者的效果仍需進一步探究。相比低齡人群，高齡RIF患者面臨的主要問題可能是卵巢儲備差、卵巢功能低反應、胚胎質量差、胚胎非整倍體率高等客觀不利因素，經IVF周期獲得的可用胚胎更少。多個移植周期均失敗，給RIF患者帶來了經濟和身體上的雙重打擊。在子宮內膜最佳容受期完成胚胎移植，對于避免浪費珍貴胚胎、保存患者生育力至關重要。因此，對于RIF患者，應以ERT技術為保障，精準定位最佳容受期，同時根據實際情況可結合PGT技術篩選整倍體胚胎，以期獲得最佳FET結局。ERT技術可為RIF患者制定移植策略提供指導和依據，在RIF患者的IVF-ET周期中有廣泛的應用前景和重要的臨床應用價值。