景天忠，董瀛謙，張海俠，劉璇

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040)

由于“3R”問(wèn)題，曾經(jīng)風(fēng)光無(wú)限的化學(xué)防治只能作為害蟲(chóng)防治的最后措施來(lái)救急，而近年來(lái)令人矚目的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物(如Bt棉等)也受到抗性問(wèn)題的困擾［1］。但人們尋找害蟲(chóng)控制新方法的步伐從未停止，隨著 RNA干涉(RNA interference，RNAi)技術(shù)在基因功能研究、基因治療等方面的廣泛應(yīng)用，以及RNAi機(jī)制研究的深入，利用RNAi技術(shù)防治害蟲(chóng)成了人們研究的熱點(diǎn)之一［2］。

1 RNAi技術(shù)防治害蟲(chóng)的原理

Fire等首先報(bào)道了外源的dsRNA可使與之同源的線蟲(chóng)內(nèi)源的mRNA沉默，并將這一現(xiàn)象稱為RNA干涉［3］。在此之前這種技術(shù)在植物中稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing)，在真菌中稱為‘quelling’，但在動(dòng)物中卻是一項(xiàng)全新的技術(shù)。目前，RNAi技術(shù)已用于基因組研究中對(duì)基因功能的鑒定、基因敲除(gene knockdown)、癌癥及病毒病的控制。作為一種生物技術(shù)，RNAi在控制農(nóng)林害蟲(chóng)方面也表現(xiàn)出巨大的潛力［4］。

RNAi可分為細(xì)胞自主性的(cell-autonomous)和非細(xì)胞自主性的(noncell-autonomous)。后者又包括系統(tǒng)性RNAi(systemic RNAi)和環(huán)境RNAi(environmental RNAi)［4－5］。對(duì)細(xì)胞自主性 RNAi，沉默過(guò)程僅限于引入或表達(dá) dsRNA的細(xì)胞，且RNAi過(guò)程僅限于單個(gè)細(xì)胞內(nèi)。目前，細(xì)胞自主性RNAi的機(jī)制已經(jīng)比較清楚，即dsRNA被RNase III(即通常稱之為Dicer)切割成21－25個(gè)核苷酸長(zhǎng)的短干涉RNA雙鏈體(short interfering RNA，siRNA)后整合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA induced silencing complex，RISC)上，在丟棄過(guò)客鏈(passenger strand)后，RISC結(jié)合到同源的mRNA上，并將其切斷以阻止翻譯。而非自主性RNAi中，干涉發(fā)生于那些非應(yīng)用dsRNA或非產(chǎn)生dsRNA的組織或細(xì)胞;環(huán)境RNAi指的是細(xì)胞從環(huán)境中吸收dsRNA，因而該過(guò)程也可以發(fā)生于單細(xì)胞的生物。系統(tǒng)性RNAi只能發(fā)生于多細(xì)胞生物，因?yàn)樗粋€(gè)沉默信號(hào)從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到另一個(gè)細(xì)胞或從一個(gè)組織轉(zhuǎn)運(yùn)到另一個(gè)組織的過(guò)程。在多細(xì)胞生物中，環(huán)境RNAi之后可接著發(fā)生系統(tǒng)性RNAi，非細(xì)胞自主性RNAi之后也可接著發(fā)生細(xì)胞自主性RNAi。

應(yīng)用 RNAi防治害蟲(chóng)主要是非細(xì)胞自主式RNAi，即昆蟲(chóng)通過(guò)取食來(lái)內(nèi)化目標(biāo)基因的dsRNA。當(dāng)dsRNA經(jīng)取食到達(dá)昆蟲(chóng)中腸后被昆蟲(chóng)吸收(環(huán)境RNAi)，而被干涉的靶基因位于中腸之外，沉默信號(hào)能通過(guò)細(xì)胞或組織進(jìn)行傳播，起到RNAi的效果(系統(tǒng)性RNAi)。

2 昆蟲(chóng)吸收dsRNA的機(jī)制

在線蟲(chóng)中，與非細(xì)胞自主式RNAi有關(guān)的兩個(gè)蛋白質(zhì)已經(jīng)鑒定出來(lái)，分別命名為SID-1和SID-2。SID-1是一個(gè)跨膜蛋白，對(duì)系統(tǒng)性RNAi來(lái)說(shuō)是必需的。其作用可能類似于一個(gè)多聚體，能被動(dòng)運(yùn)輸dsRNA到線蟲(chóng)的細(xì)胞，但對(duì)將dsRNA輸出細(xì)胞來(lái)講，它又是非必需的［6－7］。SID-2 主要發(fā)現(xiàn)于線蟲(chóng)的腸組織中，有助于環(huán)境RNAi［8］。SID-2可能通過(guò)修飾SID-1來(lái)激活轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，或者結(jié)合到來(lái)自環(huán)境的dsRNA上并將dsRNA分發(fā)到SID-1，或者誘導(dǎo)對(duì)dsRNA的內(nèi)吞途徑使SID-1將dsRNA分發(fā)到質(zhì)膜上［5］。因而線蟲(chóng)對(duì)dsRNA的吸收是一種跨膜通道介導(dǎo)的吸收機(jī)制。

在模式昆蟲(chóng)果蠅中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)sid的同源基因，也沒(méi)表現(xiàn)出明顯的系統(tǒng)性RNAi，但其細(xì)胞能夠響應(yīng)環(huán)境RNAi［9］。此外，當(dāng)將果蠅的S2細(xì)胞浸于含有 dsRNA 的培養(yǎng)基中時(shí)可產(chǎn)生 RNAi［10－11］。通過(guò)對(duì)來(lái)自S2細(xì)胞cDNA庫(kù)的2 000個(gè)dsRNA片段進(jìn)行測(cè)試，Miller鑒定出了一個(gè)上調(diào)胞內(nèi)沉默事件的基因——網(wǎng)格蛋白重鏈基因(clathrin heavy chain gene)［10］。該基因是細(xì)胞內(nèi)吞裝置的一個(gè)組成部分，這表明細(xì)胞過(guò)程參與了S2細(xì)胞中的RNAi。而實(shí)驗(yàn)又進(jìn)一步表明，這種內(nèi)吞作用是受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(receptor-mediated endocytosis)(如清道夫受體)［11］。

非細(xì)胞自主式RNAi的dsRNA吸收機(jī)制的研究主要集中在3種分子上:(1)SID-1;(2)清道夫受體;(3)RSD-3。

目前sid的同源基因已在半翅目、鞘翅目、鱗翅目、膜翅目、直翅目以及毛虱目的昆蟲(chóng)發(fā)現(xiàn)［4］。但在蜜蜂Apis mellifera和赤擬谷盜Tribolium castaneum中，SID在dsRNA吸收中的作用截然相反。在蜜蜂中，sid-1基因的表達(dá)恰在靶基因被敲除之前升高［12］，但其表達(dá)與沉默效果之間的直接關(guān)系并未得到證實(shí)。而在赤擬谷盜中，無(wú)論是3個(gè)同源基因單獨(dú)沉默還是一起沉默，RNAi并不受其sid-1基因沉默的影響。但這并不能排除sid-1基因與基因沉默有關(guān)，因?yàn)檫@種現(xiàn)象有可能是由于競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞自主式核心RNA裝置，互補(bǔ)基因減弱了RNAi的效果［13］。更有意思的是有些昆蟲(chóng)的sid-1基因同源物與線蟲(chóng)的tag-130基因的相似性要高于跟sid-1基因的相似性。而在線蟲(chóng)中，tag-130基因卻與系統(tǒng)性RNAi無(wú)關(guān)。這就意味著在這些昆蟲(chóng)中SID-1可能非系統(tǒng)性RNAi或dsRNA吸收所必需［13］，而存在另一個(gè)可能的機(jī)制。在鱗翅目昆蟲(chóng)家蠶中，盡管存在3個(gè)SID-1的同源物，但系統(tǒng)性RNAi還是很難實(shí)現(xiàn)。而在蚊子中盡管不存在SID-1的同源物，但系統(tǒng)性RNAi卻是有可能的［14］。

果蠅中有兩個(gè) C類清道夫受體，SR-CI和Eater，它們結(jié)合于一些革蘭氏陰性或陽(yáng)性菌，介導(dǎo)吞噬作用。但如前所述，它們介導(dǎo)了 S2細(xì)胞對(duì)dsRNA的吸收［11］，但關(guān)于該受體更多的情況還不得而知。在赤擬谷盜和果蠅中還發(fā)現(xiàn)了rsd-3的同源基因［13］，它們含在特異的epsin氨基末端同源域(epsin amino-terminal homology，EATH)，但還不能確定它是否與RNAi有關(guān)。

在有些生物如線蟲(chóng)Caenorhabditis elegans中，RNAi應(yīng)答是系統(tǒng)性的。昆蟲(chóng)中也表現(xiàn)為系統(tǒng)性，但在果蠅中卻并非表現(xiàn)為強(qiáng)健的系統(tǒng)性應(yīng)答。人們急于尋求研究系統(tǒng)性RNAi應(yīng)答的模式昆蟲(chóng)，鞘翅目昆蟲(chóng)Trbolium是一個(gè)候選者。目前，通過(guò)對(duì)Trbolium基因組的研究，Tomoysu等已鑒定出核心RNAi基因，以及與系統(tǒng)性 RNAi應(yīng)答有關(guān)的基因［13］，如與線蟲(chóng) sid-1同源的基因以及 tag-130基因。該機(jī)制的研究可能影響利用RNAi技術(shù)進(jìn)行害蟲(chóng)防治的方法。

3 RNAi技術(shù)防治害蟲(chóng)的優(yōu)勢(shì)

RNAi技術(shù)防治害蟲(chóng)具有兩方面的優(yōu)勢(shì):一方面是防治對(duì)象的特異性極高，不會(huì)對(duì)其他昆蟲(chóng)特別是害蟲(chóng)天敵產(chǎn)生負(fù)面影響，有利于害蟲(chóng)生物防治和綜合治理體系的實(shí)施。Whyard等利用喂食小于40 nt雙鏈RNA的方法，選擇不同物種特異性的序列片段，發(fā)現(xiàn)可以特異性殺死目標(biāo)害蟲(chóng)而對(duì)近緣物種沒(méi)有影響［15］。這一研究結(jié)果表明，根據(jù)害蟲(chóng)基因序列的特異性，可以設(shè)計(jì)專一性基因沉默技術(shù)。另一方面由于RNA分子的不穩(wěn)定性，不會(huì)出現(xiàn)殘留污染問(wèn)題，因此對(duì)環(huán)境生態(tài)安全和食品安全沒(méi)有影響，具有很高的安全性。

4 RNAi技術(shù)防治害蟲(chóng)的實(shí)施方法

4.1 注射 向黃曲條跳甲phyllotreta striolata蛹注射Psor1基因的dsRNA后，其mRNA的轉(zhuǎn)錄水平下降，且黃曲條跳甲對(duì)寄主植物的嗜好性下降［16］。Ghanim等將長(zhǎng)的dsRNA注射于粉虱Bemisia tabaci體腔內(nèi)，結(jié)果表明與這些dsRNA同源的、特異地表達(dá)于中腸和唾腺的基因的表達(dá)下降到70%［17］。Tang等向甜菜夜蛾Spodoptera exigua注射兩種貯存蛋白hexamerin 1和storage protein 1的dsRNA，204 h后昆蟲(chóng)的生存率僅分別為38.7% 和24.3%，顯著低于對(duì)照［18］。

4.2 喂食 Huvenne和Smagghe綜述了近年來(lái)通過(guò)飼喂進(jìn)行RNAi的昆蟲(chóng)［4］，這些昆蟲(chóng)分屬于鞘翅目、雙翅目、膜翅目、等翅目、半翅目和直翅目。連續(xù)取食0.5 mg/mL海藻糖磷酸合成酶(trehalose phosphate synthase，TPS)dsRNA的褐飛虱 Nilaparvata lugens在2，4，7和10 d的累計(jì)存活率分別下降到75.56%，64.44%，55.56%和40.00%，顯著低于對(duì)照，表明海藻糖磷酸合成酶也可用于害蟲(chóng)防治［19］。Zhou等通過(guò)飼喂法沉默了白蟻Reticulitermes flavipes的兩個(gè)基因，其中一個(gè)是消化纖維素的酶，另一個(gè)是貯存蛋白hexamerin，結(jié)果是顯著地影響白蟻的形態(tài)發(fā)育和死亡率［20］。Kumar等用化學(xué)合成的乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)的 siRNA直接飼喂棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera的幼蟲(chóng)，結(jié)果棉鈴蟲(chóng)的AChE被沉默，死亡率增加，生長(zhǎng)受到抑制，蛹重下降，畸形同時(shí)產(chǎn)卵力下降［21］。Griebler等通過(guò)注射和飼喂法研究了影響昆蟲(chóng)JH合成的兩個(gè)神經(jīng)肽——促咽側(cè)體神經(jīng)肽和抑咽側(cè)體神經(jīng)肽，基因被抑制后，草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda幼蟲(chóng)中JH的滴度升高，幼蟲(chóng)期延長(zhǎng)［22］。

4.3 轉(zhuǎn)基因 Baum等報(bào)道了具有突破性的研究工作，即通過(guò)使昆蟲(chóng)取食表達(dá)dsRNA的植物來(lái)控制害蟲(chóng)［23］。能夠在液泡產(chǎn)生H+ATPase dsRNA的轉(zhuǎn)基因玉米可降低玉米根螢葉甲Diabrotica virgifera virgifera的危害。含有棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera細(xì)胞色素P450基因的轉(zhuǎn)基因植物煙草Nicotiana tabacum和擬南芥Arabidopsis thaliana，可降低棉鈴蟲(chóng)細(xì)胞色素P450基因的表達(dá)，并抑制幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)［24］。甜菜夜蛾取食了通過(guò)大腸桿菌Escherichia coli表達(dá)的幾丁質(zhì)酶合成基因A(SeCHSA)的dsRNA后，其5齡幼蟲(chóng)、預(yù)蛹和蛹的平均存活率顯著低于對(duì)照，取食后靶基因的轉(zhuǎn)錄水平、組織結(jié)構(gòu)和存活率均呈劑量依賴的模式［25］。

5 存在的問(wèn)題及展望

使用RNAi技術(shù)防治害蟲(chóng)還面臨著一些問(wèn)題。首先是靶基因沉默后能否對(duì)害蟲(chóng)產(chǎn)生致死效應(yīng)。例如用表達(dá)Nlsid-1和Nlaub兩個(gè)基因siRNA的轉(zhuǎn)基因的水稻飼喂褐飛虱后，這兩個(gè)基因在中腸中的表達(dá)下降，然而害蟲(chóng)并不表現(xiàn)出明顯的致死效應(yīng)［26］。因此，在設(shè)計(jì)RNAi防治技術(shù)方案時(shí)，特別是在轉(zhuǎn)基因時(shí)必須注意對(duì)目標(biāo)基因的選擇。RNAi的致死效應(yīng)還與劑量有關(guān)，使用轉(zhuǎn)基因的植物可持續(xù)產(chǎn)生siRNA，但其只能表達(dá)一種固定的siRNA。通過(guò)噴灑的方法來(lái)應(yīng)用RNAi技術(shù)則可隨時(shí)更換目標(biāo)dsRNA，但這種方法容易受到dsRNA產(chǎn)量及成本的限制。傳統(tǒng)的體外轉(zhuǎn)錄方法或者化學(xué)合成法均不能滿足實(shí)際生產(chǎn)的需要。Bao和Cagan以及Yin等開(kāi)發(fā)出了dsRNA的原核表達(dá)系統(tǒng)［27－28］，在降低成本的同時(shí)可大量生產(chǎn)目標(biāo)dsRNA用于害蟲(chóng)防治。在將目標(biāo)dsRNA引入昆蟲(chóng)的應(yīng)用技術(shù)上，除噴灑、轉(zhuǎn)基因等常規(guī)方法外，一些新的方法也在研究開(kāi)發(fā)之中。如Gu等利用濃核病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)使白紋伊蚊Aedes albopictus幼蟲(chóng)V-ATPase基因的表達(dá)下降了 70%［29］。

綜上可以看出，利用RNAi原理防治害蟲(chóng)的技術(shù)還處于實(shí)驗(yàn)階段，要成為主流的害蟲(chóng)防治技術(shù)尚需時(shí)日。但人們?cè)谠撗芯款I(lǐng)域中取得的成果卻是日新月異。因此有理由相信利用RNAi技術(shù)防治害蟲(chóng)的未來(lái)是一片光明。

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