汪雪峰，陳思煜，陳 鋒

(浙江中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院1.藥劑科，2.放射科，浙江 杭州 310005)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是一類臨床常見危重癥，嚴重威脅重癥患者的生命，病死率極高，達30% ～50%［1］。引起ALI的原因多種，其中以膿毒癥、重癥肺炎和嚴重創(chuàng)傷等為最主要原因。有研究表明，菌血癥或膿毒癥患者ARDS的發(fā)生率為18% ～38%，但病死率卻高達90%，是引起ARDS死亡的主要原因之一［2］;同時，膿毒癥休克中ARDS的發(fā)病率為37%，脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)達到檢測水平的患者51%出現(xiàn)ARDS，而低于檢測水平的患者只有26%發(fā)展為ARDS，提示血中LPS水平?jīng)Q定ARDS發(fā)生的危險性，LPS是引起ALI/ARDS的重要致病因子。

ALI致病因素多樣，發(fā)病機制復雜。作為多種ALI致病因素的共同通路，肺損傷過程中的炎癥反應失調(diào)控在ALI疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵性作用已經(jīng)得到公認［3］。隨著失控的炎癥反應引發(fā)多器官功能紊亂綜合征理論的出現(xiàn)，對ALI的認識轉(zhuǎn)向?qū)ρ装Y發(fā)生、調(diào)控，參與炎癥的炎癥細胞和細胞因子則成為研究的熱點，這些細胞和細胞因子、炎癥介質(zhì)構(gòu)成了ALI炎癥反應和免疫調(diào)節(jié)的“細胞網(wǎng)絡”和“細胞因子網(wǎng)絡”在其發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。復雜的發(fā)病機制為藥物治療提供了可能的靶點，對此也進行了相當多的探索。目前醫(yī)學界針對ALI中的相關(guān)通路研究逐漸增多，尤其cAMP活化交換蛋白Epac/Rap1這一信號通路正成為國內(nèi)外許多學者的研究熱點。本文就ALI/ARDS中氣道炎癥及Epac/Rap1信號通路在ALI中的研究現(xiàn)狀作一綜述。

1 ALI/ARDS的病因及發(fā)病機制

ALI/ARDS病理特征是肺泡毛細血管屏障損傷、通透性增加而使富含蛋白的液體流入肺泡，引起肺不張，通氣/血流比例失調(diào)而導致呼吸衰竭。在LPS性ALI/ARDS中，LPS對微血管內(nèi)皮的直接損傷作用對疾病的發(fā)生也起到重要的作用。Anjum等［4］研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導的肺微血管內(nèi)皮細胞單層通透性增高與F肌動蛋白解聚密切相關(guān)，并且使肺腎上腺素受體出現(xiàn)明顯下調(diào)，顯示LPS對肺微血管內(nèi)皮細胞有直接的損傷作用。Okajima等［5］發(fā)現(xiàn)肺血管內(nèi)皮細胞可被直接激活，通過產(chǎn)生氧化亞氮和前列腺素，調(diào)節(jié)炎性反應而損傷肺組織。LPS刺激30 min后，即可觀察到內(nèi)皮細胞收縮，胞膜皺縮，細胞間連接松解，間裂形成，通透性增加。這種微血管通透性的增加出現(xiàn)在炎性細胞因子如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、白細胞介素 1(interleukin-1，IL-1)的血漿峰值及黏附分子表達之前?？梢?，LPS可直接損傷肺泡毛細血管屏障引起ALI/ARDS的發(fā)生。

細胞內(nèi)炎癥信號通路的激活是ALI炎癥反應的核心事件，炎癥信號通路的失調(diào)控以及炎癥因子平衡紊亂則是ALI發(fā)生和發(fā)展的重要原因。目前發(fā)現(xiàn)ALI發(fā)病過程中的多種理化因素刺激均能夠激活細胞內(nèi)炎癥信號通路。一些病原體源性物質(zhì)如LPS等能夠識別細胞膜上一類跨膜蛋白Toll樣受體而激活胞內(nèi)炎癥信號通路［6］，并通過多種信號轉(zhuǎn)導途徑及相關(guān)受體造成肺損傷、抑制炎癥等是ALI/ARDS治療的主要作用手段。

2 Epac/Rap1信號通路在ALI中的作用機制

2.1 Epac/Rap1信號通路的發(fā)現(xiàn)

cAMP作為細胞內(nèi)第二信使對于正確轉(zhuǎn)導細胞內(nèi)外的各種信息至關(guān)重要，是多種信號轉(zhuǎn)導過程中的關(guān)鍵因子。有學者研究發(fā)現(xiàn)，增高細胞內(nèi)的cAMP水平能明顯增加肺血管內(nèi)皮細胞的保護性，改善凝血酶、LPS等多種因素引起的ALI/ARDS肺內(nèi)皮細胞的功能障礙。一般認為cAMP的絕大多數(shù)功能是通過蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)實現(xiàn)的，但進一步深入研究發(fā)現(xiàn)，通過PKA抑制劑(PKI)抑制cAMP依賴性蛋白激酶PKA，細胞內(nèi)高濃度的cAMP依然能發(fā)揮對內(nèi)皮細胞的保護作用［7］，提示cAMP非PKA依賴性信號通路的存在，這條新的信號通路參與高濃度的cAMP激活并產(chǎn)生與PKA相類似的效應。

8-Pcpt-2'-O-Me-cAMP是cAMP的一個同源物，它可以特異地激活Epac，而不影響PKA的活性。利用這一人工合成物，研究者已將Epac蛋白定位在cAMP介入的信號轉(zhuǎn)導途徑的一個非常重要的位置上。例如，Epac已被證明介入了細胞增殖過程;VE-/鈣黏素介導的細胞間的連結(jié)的形成過程;整合蛋白介導的細胞核基質(zhì)的附著過程;胰島素的分泌過程以及鈉質(zhì)子泵交換活性的調(diào)控過程。

2.2 Epac/Rap1信號通路與肺部炎癥

近期研究發(fā)現(xiàn)，Epac在調(diào)節(jié)肺部的氣道炎癥和細胞增殖方面是一個新的效應器［10］，并且發(fā)現(xiàn)Epac在肺部的多種細胞中都有表達，如內(nèi)皮細胞，成纖維細胞和肺泡巨噬細胞等，并在這些細胞的免疫應答過程中發(fā)揮重要作用，如在大鼠肺纖維化模型中，Epac1呈先下降后升高趨勢，Epac2呈持續(xù)下降趨勢，提示 Epac可能參與了肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程［11］。

Epac作為Rap1特異的GEF，能直接與cAMP結(jié)合而被活化，進而激活GTP酶 Rap1，通過Rap1途徑發(fā)揮許多生物學效應。如激活的Rap1在整合素介導的細胞黏附［12］、鈣黏素介導的細胞整合形成和內(nèi)皮細胞膜的調(diào)節(jié)等多個過程中起作用［13-14］，Rap1的激活誘導 Rac特定的 GEF小分子Tiam1和Vav2在細胞膜外圍聚集［12，15］，進而激活小分子 GTP酶Rac，活化的Rac反過來刺激效應信號激酶1型蛋白激酶A(protein kinase 1，PKA1)及細胞骨架，和細胞連接相關(guān)的下游效應器，誘導肌動蛋白細胞骨架的黏著斑和黏合帶的重排，增加單層EC的屏障功能［13，16-19］。Epac蛋白在這些細胞中如何表達以及外界刺激引起的機體病理生理的改變是否引起Epac的相應的表達改變還不是很清楚，雖然已經(jīng)明確炎癥因子能夠改變Epac的表達，但具體機制也尚未研究清楚［20］。

Helms等［21］在研究頂膜和基底膜外側(cè)多巴胺對肺泡Ⅱ型細胞單層頂膜高選擇性鈉通道的影響時發(fā)現(xiàn)，多巴胺通過cAMP/Epac/Rapl途徑增加鈉通道開放率，增強ENaC活性，而非cAMP-PKA途徑，此途徑通過肺泡Ⅱ型細胞的多巴胺D1受體而不是β受體。實驗中Cpt-2-O-Me-cAMP(能選擇性結(jié)合和激活Epac，而不激活PKA)可增加ENaC開放率，可被多巴胺 D1受體拮抗劑(SCH-23390)、Src抑制劑(PPP2)、PI3K抑制劑(LY-294002)、MEK 拮抗劑 U0126、磷脂酶A2抑制劑、蛋白磷酸酶抑制劑所阻斷;但不能被多巴胺D2受體拮抗劑、PKA抑制劑阻斷。同時cAMP-Epac-Rap1可激活DARPP32(多巴胺和cAMP調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白)，引起DARPP32磷酸化，阻斷多巴胺對ENaC活性，還通過MAPK途徑增強鈉泵活性，引起肺水清除增加。

2.3 Epac/Rap1信號通路在ALI發(fā)病中的作用

Epac的發(fā)現(xiàn)促使人們重新審視cAMP的不同生物學效應的下游機制，Epac不僅能協(xié)同或拮抗PKA的作用，而且能獨立介導cAMP的生物學效應。cAMP在體內(nèi)和體外能很明顯地誘導Epac對Rap1的鳥苷酸交換能力［22-25］，Birukova等［24］在機械通氣所導致的ALI模型中發(fā)現(xiàn)，伊洛前列素對ALI中受損的肺血管內(nèi)皮細胞通透性的保護作用不僅僅是通過cAMP濃度升高激活PKA通路來實現(xiàn)的，還發(fā)現(xiàn)了非依賴PKA的新的信號通路Epac-Rap1-Tiam1/Vav2的存在。他們認為，在凝血酶所導致的急性肺損傷模型中，Epac/Rap和PKA兩條信號通路也是同時存在的［23］，但在LPS和TNFα刺激誘導肺損傷動物模型中，發(fā)現(xiàn)心鈉素能明顯提高細胞內(nèi)cAMP濃度，保護血管內(nèi)皮，基于前期其他模型中的研究，提示LPS和TNFα可能通過Epac/Rap1和 PKA兩條信號通路發(fā)揮作用，但是到目前為止，尚未證實在LPS誘導的ALI模型中cAMP是否通過Epac/Rap1這條通路起作用。

在ALI中cAMP/Epac/Rap1信號通路參與并行使許多類型細胞的功能，包括細胞分泌、細胞間黏附和連接、細胞凋亡、細胞增殖和分化等［26-27］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Epac/Rap1信號通路在多種類型細胞中都參與調(diào)節(jié)細胞的遷移、整合蛋白介導的細胞黏附等［28］。最近，Lyle等［29］報道 cAMP介導的Epac/Rap1在穩(wěn)定黏著斑的基礎上調(diào)節(jié)上皮細胞的遷移和抑制細胞膜的突起，可能是通過調(diào)節(jié)細胞骨架的整合素之間的相互作用。有趣的是，最近的證據(jù)顯示，Epac和Rap蛋白可調(diào)節(jié)在鈣黏素重新分布的基礎上的內(nèi)皮細胞連接的形成。事實上，Epac和Rap調(diào)節(jié)細胞和細胞外基質(zhì)蛋白、纖連蛋白的接觸和黏連，在多種細胞系中，這個過程涉及細胞骨架動力學和細胞間黏附與遷移的調(diào)制。Epac/Rap1信號通路與層連蛋白-5關(guān)系密切，因為層連蛋白-5在肺部炎癥中是生長因子誘導的侵入性生長的一個顯著轉(zhuǎn)接器。更重要的是，EPAC參與的抗炎是通過抑制NF-κB和調(diào)節(jié)炎癥基因的表達，Epac/Rap1信號通路調(diào)節(jié)抑制因子-3和IL-6受體等。在LPS誘導的 ALI中，Epac通過 PKB/Akt和 GSK-3減少IFN-β的產(chǎn)生［30］，但在肺泡巨噬細胞中并不改變巨噬細胞炎性蛋白質(zhì)1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)和MIP-1β的產(chǎn)生，然而，在RAW264.7細胞系中，小鼠肺泡巨噬細胞中Epac的激活可增加前炎癥因子IL-1β和IL-6的產(chǎn)生。這些數(shù)據(jù)表明，在不同的細胞類型中，Epac可增加或減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，但在這些不同類型的細胞中Epac/Rap1信號通路調(diào)節(jié)的炎癥機制還有待進一步的研究。

3 結(jié)語

Epac是一類新的cAMP下游效應分子，能與cAMP直接結(jié)合的GEF。肺血管內(nèi)皮細胞通透性的改變在ALI中具重要地位，而Epac在肺血管通透性上起重要作用，有文獻報道Epac/Rap1通路介導PGE2誘導的血管內(nèi)皮通透性增加。我們前期在LPS誘導的ALI小鼠模型中，采用蛋白印跡實驗，結(jié)果表明，Epac1在 LPS誘導的 ALI中表達是下調(diào)的，而Epac2在肺內(nèi)不表達(未發(fā)表)。提示 cAMP-Epac-Rap1-Tiam1/Vav2-Rac1在LPS誘導的ALI的發(fā)病機制中可能存在顯著的意義。

綜上所述，Epac/Rap1信號通路在ALI/ARDS發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)Epac-Rap1信號通路可能成為ALI/ARDS的治療新靶點，但是ALI/ARDS致病因素多樣，發(fā)病機制復雜，對于其中的信號通路調(diào)節(jié)，研究證明多種相關(guān)蛋白質(zhì)和生物小分子均可參與信號調(diào)節(jié)，深入了解這些分子間的作用機制對于我們尋找最佳靶點、選擇合適的激動劑和抑制劑進行疾病治療至關(guān)重要，有待于進一步研究。

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