王菲，孟彥辰，詹莉芳，張曉磊，張海方，生秀梅，徐順高，黃新祥

近年來，隨著生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，細菌中的非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)作為一類新發(fā)現(xiàn)的基因表達調(diào)控因子，已受到越來越多的關(guān)注［1］。過去長期認為RNA僅是把遺傳信息從DNA帶到蛋白質(zhì)的一個過渡產(chǎn)物，然而目前大量的研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)細菌中一些非編碼小RNA，作為應(yīng)答環(huán)境壓力的調(diào)節(jié)元件［2］，在細菌的物質(zhì)代謝、環(huán)境適應(yīng)、群體感應(yīng)和細菌毒力等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用［3-6］。絕大多數(shù)非編碼小RNA通過與靶mRNA配對，在轉(zhuǎn)錄后水平影響靶基因mRNA的翻譯或(和)穩(wěn)定性，從而調(diào)節(jié)目的基因的表達，影響細胞的多種生理功能［2，7］。在細菌體內(nèi)，這些ncRNA分子的活力主要受控于其胞內(nèi)的水平。對大腸埃希菌和其他一些菌屬的研究表明，核糖核酸酶 E、G、Ⅲ主要參與對 ncRNA水平的調(diào)控［8］。因此，研究ncRNA分子在菌體內(nèi)的水平是更好了解ncRNA作用的前提。

傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi)是一種嚴重的人類腸道致病菌，也是一種重要的研究原核基因表達與調(diào)控的模式生物。本室通過對傷寒沙門菌野生株GIFU10007在普通LB、氧應(yīng)激、高酸、高鹽等不同生長條件下的基因轉(zhuǎn)錄譜分析、測序、生物信息學(xué)預(yù)測和實時定量PCR(qRTPCR)驗證，從中挑選出一個位于基因ftsX和t3957之間的非編碼區(qū)ncRNA分子，命名為T3956。我們通過實時定量PCR分析初步發(fā)現(xiàn)，在傷寒沙門菌RNase E、RNase G、RNaseⅢ三種主要核糖核酸酶的缺陷變異株中，T3956的胞內(nèi)水平在核糖核酸酶G基因(rng)缺陷株中變化較為明顯。因此，本研究擬通過構(gòu)建傷寒沙門菌rng缺陷變異株和rng缺陷回補株，并利用qRT-PCR分析RNase G對傷寒沙門菌胞內(nèi)ncRNA T3956水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 野生型S.Typhi GIFU10007、E.coli SY372λpir和自殺質(zhì)粒pGMB151由日本岐阜大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室饋贈;E.coli DH5α由本室保存;pGEM-T載體為Promega公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑與材料 DNA聚合酶 ExTaq、rTaq、限制性內(nèi)切酶 BamH I、Xho I、BglⅡ、T4DNA連接酶、dNTP、DNase I、實時 PCR 均為 TaKaRa(大連)公司產(chǎn)品;DNA聚合酶pfu、RNase G為Fermentas(上海)公司產(chǎn)品，X-Gal、L-阿拉伯糖、氨芐西林為Sigma(美國)公司產(chǎn)品，TA克隆試劑盒為Promega(北京)公司產(chǎn)品;質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒為Axygen(美國)公司產(chǎn)品;總RNA提取試劑盒為Qiagen(德國)公司產(chǎn)品;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Invitrogen(美國)公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 凝膠成像分析系統(tǒng)(Syngene);PCR擴增儀2720 Thermal Cycler(ABI);核酸檢測儀Speetrophotometer ND-100(NanoDrop);電轉(zhuǎn)化儀Gene Pulsero II(BIO-RAD9);超速冷凍離心機Centifuge 5417R(Eppendorf);熒光定量PCR儀CFX96TMReal-Time System(Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)本室測定的傷寒沙門菌野生株GIFU10007基因組序列信息(未公布)，利用Oligo6軟件設(shè)計rng缺陷株引物、rng缺陷回補株引物和t3956 qRT PCR引物。rng缺陷株引物設(shè)計：依據(jù)GiFU10007基因序列顯示，rng基因全長1 488 bp，在rng基因上游和下游設(shè)計兩對特異性PCR引物F1A/F1B和F2A/F2B，以S.Typhi GIFU10007為模板，擴增出340 bp和728 bp的同源性片段(分別用F1，F(xiàn)2表示)。在F1B、F2A的5'端共有20個堿基互補配對通過PCR用以定向連接F1和F2片段，在F1A、F2B的5'端加BamH I酶切位點用以克隆F1和F2連接片段至自殺質(zhì)粒。rng缺陷回補株引物設(shè)計：在rng基因上下游設(shè)計引物FA，F(xiàn)B，并在5'端分別加上 Xho I及 BglⅡ酶切位點用以連接pBAD/gⅢ載體。t3956 qRT PCR引物設(shè)計：根據(jù)本室對傷寒沙門菌野生株GIFU10007基因組中的t3956基因測序信息，在序列中間設(shè)計一段特異性引物，通過檢測熒光值來觀察該基因的表達情況。所用引物均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Sequences of primers

1.2.2 傷寒沙門菌rng缺陷株的制備 傷寒沙門菌rng缺陷變異株的制備過程主要參考文獻［9］。以傷寒沙門菌野生株基因組DNA為模板，用特異性引物F1A/F1B和F2A/F2B分別擴增出rng基因上下游同源性片段F1和F2。由于在F1B、F2A的5'端共有20個堿基互補配對，用酚仿-乙醇法純化后的F1和F2片段共同作為模板通過PCR獲得F1-F2定向連接產(chǎn)物。膠回收F1-F2片段后與pGMET載體連接，熱擊法導(dǎo)入E.coli DH5α，先用BamH I酶切和PCR檢測對疑似陽性克隆質(zhì)粒作初步鑒定，再用DNA序列分析(測序由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司完成)予以進一步鑒定。用BamH I酶切陽性重組pMD18-T質(zhì)粒，膠回收酶切片段(F1-F2)，通過T4DNA連接酶將其連接至自殺質(zhì)粒pGMB151的BamH I酶切位點，用熱擊法導(dǎo)入E.coli SY372λpir，篩選疑似陽性克隆并用BamH I酶切和PCR檢測鑒定。通過試劑盒提取帶有目的片段F1-F2的陽性自殺質(zhì)粒，用電擊法導(dǎo)入傷寒沙門菌野生株，并在5%蔗糖LB平板上進行同源重組。用引物F1A、F2B擴增同源性片段觀察重組現(xiàn)象，將連續(xù)4次傳代完全重組的菌株作為S.Typhi rng缺陷株。

1.2.3 傷寒沙門菌rng基因缺陷回補株的制備根據(jù)傷寒沙門菌野生株基因組序列信息，在rng基因上下游設(shè)計引物FA、FB，并在5'端分別加上Xho I及BglⅡ酶切位點，用高保真的DNA聚合酶pfu擴增出目的片段。純化目的片段后用Xho I及BglⅡ?qū)ζ溥M行雙酶切反應(yīng)，通過T4DNA連接酶將其與經(jīng)同樣酶切的pBAD/gⅢ質(zhì)粒4℃過夜連接。用熱擊法將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α，篩選陽性克隆并用酶切和PCR進行初步鑒定，再用DNA測序分析驗證(測序由上海英駿生物技術(shù)服務(wù)有限公司完成)。試劑盒提取測序正確的陽性克隆質(zhì)粒和空質(zhì)粒pBAD/gⅢ(陰性對照)，分別電擊導(dǎo)入傷寒沙門菌rng缺陷變異株中，命名為rng缺陷回補株 Δrng(pBAD-rng)，空質(zhì)粒對照株 Δrng(pBAD)。

1.2.4 細菌培養(yǎng)及總 RNA提取 分別挑取S.Typhi野生株、rng缺陷株、rng缺陷回補株和空質(zhì)粒株單菌落于1 ml等滲LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩(250 r/min)培養(yǎng)過夜，然后以1∶100分別轉(zhuǎn)接于20 ml等滲LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩(250 r/min)培養(yǎng)至 D(600 nm)值各為0.2，0.8 和1.2，其中培養(yǎng)回補株和回補空質(zhì)粒株的LB液體中需加入L-阿拉伯糖和氨芐西林，終濃度分別為0.5 mg/ml和100 μg/ml。將培養(yǎng)管冰上放置 10 min后離心(4 000 r/min，10 min，4℃)收集菌體，再用TE緩沖液洗菌體1次，離心(4 000 r/min，10 min，4℃)收集菌體。用總RNA提取試劑盒分別提取細菌總RNA，并用無RNA酶的DNA酶 I(37℃ 30 min，80℃ 2 min)消化殘余DNA，用核酸檢測儀檢測RNA，確定其濃度，同時進行瓊脂糖凝膠電泳，分析RNA的質(zhì)量(要求rRNA條帶清晰且無殘余DNA)。

1.2.5 RNA逆轉(zhuǎn)錄與實時定量PCR(qRT-PCR)采用上述方法提取細菌總RNA后用特異性引物逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。逆轉(zhuǎn)錄體系和條件：4 μg總 RNA，4 μl特異性引物 t3965FB，1 μl dNTP 和 4 μl無 RNA 酶的ddH2O混合后65℃作用5 min，冰浴1 min，再加入 5 × Fs 緩沖液 4 μl，0.1 mol/L DTT 1 μl，RNase OUT 1 μl，SuperScript Ⅲ 1 μl，總體積 20 μl，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為25℃10 min，50℃50 min，70℃15 min。然后按照TaKaRa公司的實時定量PCR試劑盒操作說明進行實驗。qRT-PCR的反應(yīng)體系：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 1 μl，t3956 上下游引物各 1 μl，混合物(含有 ExTaq DNA聚合酶、dNTP、PCR緩沖液和SYBR Green)17 μl。實驗重復(fù)3次，每次設(shè)置平行對照組，得到的qRT-PCR結(jié)果用One-way ANOVA進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 成功制備傷寒沙門菌rng缺陷變異株

以S.Typhi野生株GIFU10007的基因組DNA為模板，用特異性引物F1A/F1B和F2A/F2B進行PCR擴增，獲得了rng基因上、下游同源性片段F1和F2，分別為340 bp和728 bp(圖1a)。通過PCR得到長度約1 068 bp的F1-F2定向連接片段后進行TA克隆，對篩選得到的陽性克隆經(jīng)酶切和PCR鑒定后，再進行DNA測序分析，結(jié)果顯示F1-F2連接產(chǎn)物序列與S.Typhi野生株GIFU10007的rng基因序列一致。將F1-F2片段成功克隆至自殺質(zhì)粒后(圖1b)，提取帶有目的片段的自殺質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)入S.Typhi野生株GIFU10007，然后在5%蔗糖LB平板上進行同源重組，得到僅有缺失972 bp的小片段菌株后，在普通LB平板上連續(xù)4次傳代均只有小片段出現(xiàn)(圖1c)，表明S.Typhi rng缺陷變異株制備成功。

圖1 傷寒沙門菌rng基因缺陷變異株的制備Fig 1 Preparation of the rng deleted mutant of S.Typhi

2.2 成功制備傷寒沙門菌rng缺陷回補株

以野生株基因組DNA為模板，用引物FA/FB進行PCR擴增，獲得rng基因回補片段大約1 588 bp(圖2a)。將擴增的目的片段經(jīng)雙酶切后與表達載體pBAD/gⅢ進行連接，熱擊導(dǎo)入 E.coli DH5α中，對疑似陽性克隆進行酶切和 PCR鑒定后(圖2b)，再經(jīng)DNA測序分析驗證，測序結(jié)果顯示插入的回補片段與目的基因完全一致。試劑盒提取測序正確的陽性克隆質(zhì)粒和空質(zhì)粒pBAD/gⅢ(陰性對照)，分別電擊導(dǎo)入傷寒沙門菌rng缺陷變異株中，用目的基因特異性引物FA/FB對回補株進行PCR擴增，結(jié)果顯示在回補株中獲得了目的基因的特異片段(圖2c)，說明含rng基因的載體成功轉(zhuǎn)入缺陷株中，即S.Typhi rng缺陷回補株制備成功。

圖2 傷寒沙門菌rng基因缺陷回補株的制備Fig 2 Rescue of rng in the rng deleted mutant of S.Typhi

2.3 qRT-PCR分析RNase G對胞內(nèi)T3956水平的影響

為探討RNase G對傷寒沙門菌ncRNA T3956表達的影響，我們分別提取傷寒沙門菌D(600 nm)值為0.2，0.8 和1.2 時的總 RNA，并用 qRT-PCR 分析各時相野生株、rng缺陷株、回補株和空質(zhì)粒株中T3956的水平。結(jié)果(圖3)顯示，當(dāng)細菌處于對數(shù)早期即D(600 nm)為0.2時，各菌株的胞內(nèi)T3956水平并無顯著差異;當(dāng)D(600 nm)為0.8及1.2即對數(shù)生長中后期和穩(wěn)態(tài)期時，rng缺陷株的T3956胞內(nèi)水平均較野生株明顯增加(P＜0.01)。在各時相中，回補株與野生株之間、空質(zhì)粒菌株與缺陷株之間的T3956胞內(nèi)水平相似。結(jié)果表明，在傷寒沙門菌中RNase G可影響胞內(nèi)ncRNA T3956的水平，并且在細菌對數(shù)生長中后期和穩(wěn)態(tài)期時RNase G對T3956水平的影響更為明顯。

3 討論

核糖核酸酶類對ncRNA的成熟、降解和胞內(nèi)水平起著重要的調(diào)控作用。目前，在大腸埃希菌中已發(fā)現(xiàn)的核糖核酸酶類有20多種［10］。在細菌中主要的核糖核酸酶有RNase E、RNase G和RNaseⅢ。RNase E是主要作用于單鏈RNA的核糖核酸內(nèi)切酶，其羧基末端還可以與其他的酶類連接組裝成降解復(fù)合體，參與許多小RNA的降解［11］。RNase G由rng基因編碼，與RNase E起催化作用的氨基末端具有同源性。同RNase E一樣，RNase G主要降解單鏈RNA，并且多水解5'末端含有單磷酸基團的RNA和富含AU堿基的區(qū)域［12］。在大腸埃希菌中，RNase G和RNase E共同參與16S rRNA 5'端的成熟加工。盡管RNase G與RNase E的氨基末端具有同源性，但是兩者作用的酶切位點并不完全一致［13］。RNaseⅢ是一種作用于雙鏈RNA的核糖核酸內(nèi)切酶，對sRNA和靶mRNA配對的雙鏈區(qū)進行切割，可以同時降解sRNA和其配對的靶mRNA［14］。另外，參與小RNA調(diào)控的核糖核酸外切酶還有聚核甘酸磷酸化酶(PolynucleotidePhosphorylase，PNPase)和聚腺苷酸聚合酶(PolyA polymerase I，PAP I)。PNPase和RNase E一起參與組成降解體，參與小RNA降解［15］。PAP I的多聚腺苷化作用可以影響大腸埃希菌GlmY sRNA的穩(wěn)定性［16］。

圖3 qRT-PCR分析傷寒沙門菌核糖核酸酶G對非編碼RNA的影響Fig 3 qRT-PCR was performed to analyze the influence of RNaseG on the cellular level of non-coding RNA T3956 in S.Typhi.

在原核生物中，非編碼小RNA的胞內(nèi)水平和生理作用往往受到多種核糖核酸酶的共同調(diào)控，不同核糖核酸酶的作用方式也各不相同［17］。例如，對鼠傷寒沙門菌的一種非編碼小RNA MicA的研究表明，其胞內(nèi)周轉(zhuǎn)調(diào)控涉及兩種不同的作用機制，當(dāng)MicA與靶mRNA配對后，RNaseⅢ可以同時降解MicA sRNA和靶mRNA，而對于未配對的MicA sRNA來說，RNase E則是參與游離MicA降解的主要因子，同時RNase E還可以招募其他因子如PNPase來參與游離MicA的周轉(zhuǎn)，控制MicA sRNA的胞內(nèi)水平［18］。這些核糖核酸酶共同參與調(diào)控MicA sRNA轉(zhuǎn)錄后的水平，使其達到最適的水平，從而發(fā)揮對靶mRNA的調(diào)節(jié)作用。

本文研究了傷寒沙門菌RNase G對胞內(nèi)ncRNA T3956水平的影響，實時定量PCR結(jié)果表明RNase G可以影響胞內(nèi)ncRNA T3956的水平，并且在細菌的對數(shù)生長中后期和穩(wěn)態(tài)期作用更加明顯，提示傷寒沙門菌中的RNase G對ncRNA T3956的胞內(nèi)水平和周轉(zhuǎn)更新發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，這對研究ncRNA T3956的生理功能有著重要的意義。但RNase G對T3956發(fā)揮降解作用的具體酶切位點和作用機制尚不清楚，以及有無其它的核糖核酸酶共同參與對胞內(nèi)ncRNA水平的調(diào)控，還有待進一步的研究。

［1］Vogel J，Sharma CM.How to find small non-coding RNAs in bacteria［J］.Biol Chem，2005，386(12)：1219-1238.

［2］Storz G，Opdyke JA，Zhang A.Controlling mRNA stability and translation with small non-coding RNAs［J］.Curr Opin Microbiol，2004，7(2)：140-144.

［3］Grke B，Vogel J.Noncoding RNA control of the making and breaking of sugars［J］.Genes Dev，2008，22(21)：2914-2925.

［4］Mass E，Gottesman S.A small RNA regulates the expression of genes involved in iron metabolism in Escherichia coli［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(7)：4620-4625.

［5］Lenz DH，Mok KC，Lilley BN，et al.The small RNA chaperone Hfq and multiple small RNAs control quorum sensing in Vibrio harvevi and Vibrio cholerae［J］.Cell，2004，118(1)：69-82.

［6］Romby P，Vandenesch F，Wagner EG.The role of RNAs in the regulation of virulence-gene expression［J］.Curr Opin Microbiol，2006，9(2)：229-236.

［7］Guillier M，Gottesman S.Remodelling of the Escherichia coli outer membrane by two small regulatory RNAs［J］.Mol Microbiol，2006，59(1)：231-247.

［8］Viegas SC，Pfeiffer V，Sittka A，et al.Characterization of the role of ribonucleases in salmonella small RNA decay［J］.Nucleic Acids Res，2007，35(22)：7651-7664.

［9］茅凌翔，朱超望，黃新祥，等.傷寒沙門菌phoP基因缺陷變異株的制備［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2007，17(2)：145-149.

［10］Arraiano CM，Andrade JM，Dominques S，et al.The critical role of RNA processing and degradation in the con-trol of gene expression［J］.FEMS Microbiol Rev，2010，34(5)：883-923.

［11］Carpousis，AJ，Van Houwe G，Ehretsmann C，et al.Copuri cation of E.coli RNAase E and PNPase：evidence for a specific association between two enzymes important in RNA processing and degradation［J］.Cell，1994，76(5)：889-900.

［12］Jiang X，Belasco JG.Catalytic activation of multimeric RNase E and RNase G by 5'-monophosphorylated RNA［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(25)：9211-9216.

［13］Tock MR，Walsh AP，Carroll G，et al.The CafA protein required for the 5'-maturation of 16S rRNA is a 5'-end-dependent ribonuclease that has context-dependent broad sequence specificity［J］.J Biol Chem，2000，275(12)：8726-8732.

［14］Afonyushkin T，Vecerek B，Moll I，et al.Both RNase E and RNase III control the stability of sodB mRNA upon translational inhibition by the small regulatory RNA RyhB［J］.Nucleic Acids Res，2005，33(5)：1678-1689.

［15］Andrade JM，Arraiano CM.PNPase is a key player in the regulation of small RNAs that control the expression of outer membrane proteins［J］.RNA，2008，14(3)：543-551.

［16］Reichenbach B，Maes A，Kalamorz F，et al.The small RNA GlmY acts upstream of the sRNA GlmZ in the activation of glmS expression and is subject to regulation by polyadenylation in Escherichia coli［J］.Nucleic Acids Res，2008，36(8)：2570-2580.

［17］Viegas SC，Arraiano CM.Regulating the regulators：How ribonucleases dictate the rules in the control of small noncoding RNAs［J］.RNA Biol，2008，5(4)：230-243.

［18］Viegas SC，Silva IJ，Saramago M，et al.Regulation of the small regulatory RNA MicA by ribonuclease III：a targetdependent pathway［J］.Nucleic Acids Res，2011，39(7)：2918-2930.