薛茗月，羅星曄，湛志華，陳全斌

（1.桂林師范高等?？茖W校化學與工程技術(shù)系，廣西桂林541001；2.桂林環(huán)保局，廣西桂林541003；3.廣西師范大學資源與環(huán)境學院，廣西桂林541004）

甜茶（Rubus Suavissmus S.Lee，Sweet Tea），是薔薇科懸鉤子屬植物的一個品種、廣西的特產(chǎn)[1]。主產(chǎn)于廣西的柳州、桂林、梧州等地區(qū)，甜茶具有祛痰止咳、清熱、潤肺等功效，廣泛用于保健品、食品和化妝品等領(lǐng)域中[2]。有關(guān)研究表明，鞣花酸具有多種生物活性功能，例如抗氧化功能、抗癌[3]、抗突變性能[4]、能抑制人體免疫缺陷病毒（HIV）的增生[5]；鞣花酸還是一種有效的凝血劑[6]，對多種細菌、病毒都有很好的抑制作用，能防止感染抑制潰瘍[7]。除此之外，鞣花酸還具有降壓、鎮(zhèn)靜，預防骨質(zhì)疏松等多種生理作用[8]。鞣花酸作為一種新型的藥物原料和食品添加劑日益受到人們的重視。李小萍[9]，貝玉祥[10]，周本宏[11]、王予祺等[12]分別對對紅樹莓果、訶子、石榴皮和蛇莓中的鞣花酸含量進行了測定，其中訶子中鞣花酸含量最高，達到了573 mg/kg；李小萍等[13]研究了紅樹莓果重鞣花酸的抗氧化性研究，發(fā)現(xiàn)莓果中的鞣花酸提取物具有較強的還原能力。因此，開展甜茶中鞣花酸的研究，對甜茶植株的化學成分分布、開發(fā)甜茶系列產(chǎn)品、甜茶的推廣應用具有重大意義。近年來，甜茶的研究越來越受到重視，但重點均局限于對甜茶素[14]、黃酮苷[1]及其苷元[14]的提取和測定，甜茶粗體物藥理[15]的研究，而對甜茶中鞣花酸的研究鮮見報道。因此，本文對甜茶中鞣花酸進行抗過敏的研究，為開發(fā)以甜茶為原料的保健品、天然抗過敏性藥物提供理論參考。

1 材料與儀器

1.1 試劑

甲醇（CP）、蒸餾水、無水Na2SO4、石油醚（AR）、氯仿（CP）、乙酸乙酯（CP）、95%工業(yè)酒精、無水Na2SO4。

撲爾敏（批號：070504），廣東南國藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；磷酸組織胺（批號：0609015）：中科院上海生化所東風生化技術(shù)公司產(chǎn)品；醫(yī)用天花粉：市售。4%（g/g）氫氧化鋁凝膠（批號：060308）：廣西南寧制藥企業(yè)集團公司產(chǎn)品；鞣花酸標準品：Sigma-Aldrich 公司；LSA-10大孔吸附樹脂：西安藍深交換吸附材料有限責任公司。

1.2 儀器

722 型光柵分光光度計：上海分析儀器三廠產(chǎn)品；中試型智能控制連續(xù)化多功能超聲波提取組GDCTQ/ZS/3：濟寧金百特電子有限責任公司制造。

1.3 動物

昆明種小鼠，體重18 g～22 g，雌雄各半，清潔級（合格證號：SCXK 桂2003-0003）：廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。小鼠分性別飼養(yǎng)于空調(diào)實驗室內(nèi)，室溫：（22±2）℃，相對濕度：（60±2）%，喂顆粒標準飼料，自由飲水和攝食。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

實驗所得數(shù)據(jù)采用PEMS3.1 統(tǒng)計軟件進行分析，各試驗組與對照組之間采用t 檢驗進行比較。

1.5 鞣花酸的制備

取甜茶根2 kg，碾碎后置入40 L 超聲波提取罐，加20 L 水，加熱至80 ℃，超聲提取1 h，膜過濾，重復一次，合并濾液，濃縮，濾液依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，萃取液用無水Na2SO4脫水，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收部分溶劑，放置，乙酸乙酯萃取液得到黃色顆粒結(jié)晶，堿溶酸沉，經(jīng)水洗、醇洗后，紅外干燥儀中干燥，得黃色顆粒結(jié)晶化合物A（約2.0 g）。

2 鞣花酸的鑒定

采用KBr 壓片法，在波數(shù)為4 000 cm-1～400 cm-1范圍分別對鞣花酸對照品（標準樣品）和樣品A 進行掃描，其譜圖見圖1。

鞣花酸標樣的主要吸收峰[IR（KBr）/cm-1]：3 555，1 698，1 621，1 582，1 511，1 448，1 390，1 335，1 259，1195，1115，1059，922，882，758。其中3555cm-1為O-H伸縮振動頻率，1 698 cm-1為C=O 的伸縮振動頻率，1 621，1 582，1 511，1 448 是苯的C=C 伸縮振動峰。

樣品A 的主要吸收峰[IR（KBr）/ cm-1]：3 559，1 695，1 618，1 582，1 511，1 451，1 395，1 346，1 257，1 195，1 111，1 056，922，882，757。樣品A 與鞣花酸對照品的紅外譜圖譜峰的重合性較好，各峰波數(shù)基本一致，并與文獻[13]相符。因此，制備得到的黃色顆粒結(jié)晶物A 為鞣花酸。

3 鞣花酸抗過敏對比試驗

3.1 對小鼠被動皮膚過敏試驗[16]

抗原：醫(yī)用天花粉。佐劑：4%氫氧化鋁凝膠。臨用時用0.01 g 天花粉溶于4 mL 氫氧化鋁凝膠中。致敏，健康小鼠10 只，體重18 g～22 g，將上述天花粉氫氧化鋁凝膠混懸液腳掌注射，兩只后腳掌各注入0.05mL，共注射0.1 mL。15 d 后，斷頭取血，離心取抗血清備用。

被動皮膚過敏：另取小鼠60 只，體重18 g～22 g，雌雄各半。隨機分為正常對照組，撲爾敏（4 mg/kg）組，鞣花酸大小劑量（200、100 mg/kg）組，每組10只。每天灌胃給藥1 次，正常對照組給予等體積蒸餾水，連續(xù)給予5 d。取上述血清（10 只致敏小鼠的混合抗血清）加生理鹽水稀釋成1 ∶5，每只鼠腹壁皮內(nèi)注射兩個點（相距0.2 cm），每點0.03 mL。并再連續(xù)給藥2 d，于末次給藥12 h 后，每只小鼠進行抗原攻擊，尾靜脈注射天花粉（2.5 mg/mL，用1%伊文思藍-生理鹽水配制）0.2 mL/只，20 min 后處死動物，剪下腹部藍斑皮膚（0.5 g），剪碎，浸泡于丙酮生理鹽水溶液（7 ∶3）5 mL 中48 h，離心（3 000 r/min）15 min 取上清液，用分光光度計于610 nm波長處測定吸收度（OD），并作組間比較，評價藥物的抗過敏作用，結(jié)果見表1。

表1 鞣花酸對小鼠被動皮膚過敏反應的影響Table 1 The effect of ellagic acid and crude extracts of Rubus Suavissimus S.Leeon the passive skin allergy of mice

結(jié)果表明，鞣花酸樣品和陽性藥撲爾敏能顯著抑制小鼠被動皮膚通透性，減少腹部藍斑皮膚浸出液的光密度值，提示鞣花酸樣品具有很強的抗皮膚過敏作用，強弱對比順序如下：鞣花酸樣品＞撲爾敏。

3.2 對組胺致小鼠毛細血管通透性增高的作用[17]

取小鼠60 只，雌雄各半，隨機分為正常對照組，撲爾敏（4 mg/kg）組，鞣花酸大小劑量（200、100 mg/kg）組，每組10 只。每天灌胃給藥1 次，正常對照組給予等體積蒸餾水，連續(xù)給予5 d。于末次給藥30 min 后，腹部皮內(nèi)注射組胺10 μg/mL，形成一小皮丘，立即尾靜脈注射0.5%伊文思藍0.0l mL/g，30 min 后處死動物，用直徑0.8 cm 的打孔器打下兩片藍染皮片，放入3 mL生理鹽水-丙酮（3 ∶7）混合液中，在37 ℃恒溫水浴鍋中放置24 h，浸出液離心，取上清液，用721 型分光光度計（610 nm）測吸光度，結(jié)果見表2。

表2 鞣花酸對組胺致小鼠毛細血管通透性增高的影響Table 2 The effect of ellagic acid and crude extracts of Rubus Suavissimus S.Lee on mice which induced increase of capillary permeability by histamine

結(jié)果表明，鞣花酸大小劑量組均能明顯減少大鼠藍斑皮膚的光密度值，顯示抑制組胺致小鼠毛細血管通透性增高，提示鞣花酸對組織胺引起的皮膚毛細血管通透性的過敏反應具有很強的抑制作用。

3.3 對二硝基氯苯所致遲發(fā)型皮膚過敏反應的影響[18]

取小鼠60 只，雌雄各半。隨機分為正常對照組，撲爾敏（4 mg/kg）組，鞣花酸大小劑量（200、100 mg/kg）組，每組10 只。各組小鼠腹部用電推剪去毛（3×3 cm），用1%2，4-二硝基氯苯（DNCB）丙酮液50 μL 涂于小鼠腹腔皮膚致敏，致敏前一天灌胃給藥，連續(xù)9 d，致敏后7 d 以1%DNCB 涂右耳攻擊，24 h 后脫頸椎處死，剪取左右耳相同部位，用直徑為8 mm 的打孔器打下圓耳片稱重，以兩耳片重量差值（腫脹度）為指標，評價藥物的抗過敏反應。結(jié)果見表3。

表3 鞣花酸對二硝基氯苯所致遲發(fā)型皮膚過敏反應的影響（x±s）Table 6 The effect of ellagic acid and crude extracts of Rubus Suavissimus S.Lee on the skin allergy which caused by the impact of dinitrochlorobenzene delayed

結(jié)果表明，鞣花酸大小劑量組均能明顯減少二硝基氯苯致敏小鼠耳朵重量，減少腫脹度，提示其對二硝基氯苯所致遲發(fā)型皮膚過敏具有很強的抑制作用。

3.4 磷酸組織胺引起的豚鼠致癢反應模型的影響[18-19]

取60 只豚鼠，體重350 g～500 g，雌雄各半，隨機分為正常對照組，陽性藥撲爾敏（4 mg/kg）組，鞣花酸大小劑量（200、100 mg/kg）組，每組10 只。于實驗前1 h 剪去右后腿部毛并用砂紙擦傷皮膚，面積約2 cm2。各組給藥或生理鹽水30 min 后，用0.05%磷酸組織胺50 μL，涂抹擦傷皮膚，3 min 內(nèi)豚鼠如不出現(xiàn)舔擦傷皮膚動作，再涂抹一次組織胺，如此重復操作，直至出現(xiàn)為止，記錄涂抹組織胺次數(shù)及累積用量，結(jié)果見表4。

表4 鞣花酸對組織胺所致豚鼠皮膚致癢的影響（x±s）Table 4 The effect of ellagic acid and crude extracts of Rubus Suavissimus S.Lee on the itch skin of guinea pig which caused by histamine

結(jié)果表明，鞣花酸大小劑量組均能明顯增加涂抹豚鼠組織胺次數(shù)及累積用量，提示其具有明顯抑制磷酸組織胺引起的豚鼠致癢作用。

4 結(jié)果與討論

研究表明，被動皮膚過敏是由Ig E 類抗體所介導而引起的I 型變態(tài)反應性病癥，其臨床常見疾病有過敏性休克、支氣管哮喘、過敏性鼻炎、蕁麻疹等。小鼠同種被動皮膚過敏試驗，是小鼠致敏后用同種抗原攻擊，可引起肥大細胞脫顆粒，釋放過敏介質(zhì)（組織胺、慢反應物質(zhì)、5-羥色胺等），使皮膚局部血管的通透性增加，在抗原攻擊的同時加入伊文思藍染料，根據(jù)局部皮膚染料滲出的多少，判斷血管通透性的變化，為篩選抗過敏作用藥物的有效方法。皮內(nèi)注射過敏介質(zhì)（如組織胺），使皮膚局部血管的通透性增加，同時靜脈給予伊文思藍，用比色法測定，根據(jù)染料的通透量反映毛細血管通透性大小，可直接反應出藥物是否有拮抗過敏介質(zhì)的作用。

鞣花酸能顯著降低被動皮膚過敏小鼠皮膚藍斑的光密度值；以及能明顯拮抗過敏介質(zhì)組織胺所致的小鼠毛細血管通透性增加；明顯抑制二硝基氯苯所致遲發(fā)型皮膚過敏反應；抑制磷酸組織胺引起的豚鼠致癢反應。綜上所述，鞣花酸在多種致敏動物模型實驗中證實，具有顯著的抗過敏作用，為鞣花酸進一步的研究與開發(fā)提供了實驗參考。

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