李燕凌，張 文，張新宇，李大志

（1.湖南省蔬菜研究所，湖南 長沙 410125；2.湖南農業(yè)大學園藝園林學院，湖南 長沙 410128）

番茄潰瘍?。╞acterial canker of tomato）是由密歇根棒形桿菌密歇根亞種（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，Cmm）引起的一種毀滅性細菌病害。該病害自從1909年首次在美國溫室番茄上發(fā)現(xiàn)以來，發(fā)生頻繁，主要通過帶菌種子和種苗遠距離傳播，現(xiàn)已廣泛分布于世界各番茄產區(qū)，我國于1985年首次在北京市發(fā)現(xiàn)番茄潰瘍病并報道。我國已成為世界上最重要的番茄制種基地之一，隨著國際間日益頻繁的種質交換和種子貿易，近年來番茄潰瘍病成為我國番茄生產的巨大潛在威脅。湖南高溫高濕的氣候條件更適宜于病害的流行，該病害一般于5～7月發(fā)生，湖南城步縣等高山地區(qū)主要在7～8月爆發(fā)[1]，嚴重發(fā)病的地區(qū)番茄減產達25%～75%。目前，生產上還沒有快速有效的防治辦法，但番茄潰瘍病的快速檢測和鑒定已有大量研究[2-7]。

幾十年來，生產上對番茄潰瘍病采用過化學防治、生物防治和農業(yè)措施防治，但均收效甚微，抗病育種或許是徹底根治該病害的最佳途徑。國內外的專家大多采用常規(guī)手段進行抗病育種，從本屬或近緣屬作物中尋找抗性資源，這樣可以盡快育出抗病品種。龍葵（Solanum.nigrum L）與番茄同屬茄科茄屬，是湖南地區(qū)普遍生長的一種野草，湖南省蔬菜研究所課題組前期對龍葵進行了調查以及病原菌接種鑒定，研究表明龍葵對番茄潰瘍病高抗。筆者以感病番茄98-1為母本、茄科茄屬龍葵為父本進行雜交育種，進行了四代回交和一代自交及SSR鑒定，以期獲得對番茄潰瘍病具有抗性的雜交后代群體及與番茄潰瘍病抗性相關的SSR標記。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 母本：番茄98-1，從臺灣引進，定植于湖南省蔬菜研究所；父本：龍葵，從野外采集，定植于湖南省蔬菜研究所示范園。

1.1.2 引物序列 從http://www.gramene.org和http://www.ncbi.nlm.nih.gov/網站獲得110對SSR引物信息，由北京鼎國生物有限公司合成。試驗所采用的引物序列信息如表1所示。

表1 部分SSR引物序列

1.2 方法

1.2.1 番茄育種 用番茄98-1作輪回親本，四代回交，再自交一代。2007年4月在龍葵開花前采集花粉，對其進行干燥和保存；5月在番茄花藥成熟但花朵未開放時，進行去雄并授以龍葵花粉，然后套袋；7月收種后立即播種，然后用番茄98-1作輪回父本和F1（98-1×龍葵）。2008年、2009年共回交四代，2010年自交一代，選取1 000份生長健壯、植物學形態(tài)較好的材料進行SSR鑒定和病理學接種鑒定。育種技術路線如圖1所示。

圖1 番茄育種技術路線

1.2.2 總DNA的提取及濃度檢測 在植株上直接取葉子，用簡化的CTAB法[8]提取總DNA。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測純度，用微量紫外分光光度儀測（ND-1000）檢測所提取DNA的濃度。

1.2.3 PCR擴增 以提取的總DNA為模板，進行PCR 擴增，反應體系：10×Buffer（含 Mg2+）2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，10 μmol/L 引物 1 μL，模板DNA 20 ng，Taq DNA polymerase 1U，補充 ddH2O至 25 μL。反應條件：94℃預變性 5 min；94℃變性 1 min，55℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測 采用1×TAE（Tris-冰乙酸-EDTA，pH值8.0）電泳緩沖液，用1.0%的瓊脂糖凝膠作為載體，以λDNA/HindⅢ為Marker，每孔點 6 μL（DNA 5 μL，溴酚蘭 1 μL），在 100 V 電壓，70 mA電流條件下電泳1 h，EB（溴化乙錠）染色20 min，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

1.2.5 抗病鑒定 （1）田間接種鑒定：菌種來源于湖南省植物保護研究所，接種室選于封閉的玻璃溫室，接種的植株用紗網隔離。（2）SSR鑒定：每回交一代進行鑒定，從BC4I1的不同株系中選出1 000株高抗的單株，從葉中提取DNA，以98-1作對照，進行PCR擴增，瓊脂糖電泳檢測，尋找差異帶。

1.2.6 抗病材料的獲得 2008年春在湖南省蔬菜研究所日光溫室播種BC1代，進行了分子標記輔助選擇和抗病鑒定，選中25株植株分別進行回交并單株收種，BC2、BC3只進行田間接種鑒定，按株系收取高抗植株。2010年春將BC4播種于日光溫室大棚，進行SSR抗病鑒定，同時進行自交，從不同的株系中選出抗病且性狀好的單株取樣并留種。

2 結果與分析

2.1 具有抗性的雜交后代群體及其基因相關標記的獲得

利用SSR標記對親本和105個BC1群體進行篩選，最終獲得1個與龍葵抗?jié)儾』蛳嚓P的標記—CAT01（上游序列:GCTTTCGATCCCTCCACATA，下游序列：GATCCCTACAATCCTTGGTCC），擴增片段大小為810 bp左右（圖2），其中25株雜種后代含有該標記。利用該25株子代與母本進行回交，通過接種潰瘍病菌，田間抗病鑒定篩選出5株抗病的單株，后陸續(xù)進行3次回交得到BC2、BC3和BC4群體。在BC4不同的株系中選出1 000株含有標記的植株，從這些植株中篩選出80株性狀好的單株進行抗病性鑒定與自交，最終得到34個抗病且性狀優(yōu)良的株系。如圖3所示，對BC1群體中34株進行SSR分子標記篩選，樣品中有8株擴增出與抗性相關的條帶，分別位于第1、5、9、10、11、13、18、20 泳道，都是復合帶，說明母本里也含有抗性基因，可能是沒有表達的隱性基因。

2.2 轉育過程中抗病反應及農藝性狀的變化

2.2.1 抗病反應的變化 對雜交后代接種番茄潰瘍病菌，觀察發(fā)現(xiàn)BC1、BC2代表現(xiàn)為中感，有番茄潰瘍病的典型病斑。但到了BC4代，部分植株表現(xiàn)為中抗和高抗，在接種處出現(xiàn)過敏性反應癥狀，接近龍葵對潰瘍病的抗性。

2.2.2 果形的變化 BC1代時果形還主要接近龍葵，BC3代開始接近番茄，但是也有龍葵型的，BC4代的果型已經接近回交親本98-1，近小番茄。

2.2.3 植株高度的變化 BC1、BC2植株接近龍葵，高約60 cm，BC4開始大幅度增高，植株高度接近番茄。

3 討論與結論

通過遠緣雜交可以將龍葵對潰瘍病的抗性介導給番茄，為防治番茄潰瘍病害提供了參考。通過分子標記輔助選擇，可以更準確、更省力的選擇目標性狀，尤其是多基因控制的性狀。該研究以感病番茄98-1為母本、茄科茄屬龍葵為父本進行雜交育種，經過四代回交和一代自交，獲得了對番茄潰瘍病具有抗性的雜交后代群體，并得到了1個與番茄潰瘍病抗性相關的SSR標記—CAT01。

經過幾年轉育，研究發(fā)現(xiàn)番茄抗?jié)兓蚴怯啥嗷蚩刂频?，SSR分子標記只代表其1個基因的某個片段或與其中1個抗病基因連鎖的片段，但沒有該標記一定不具備抗性。因此，在后代中大量淘汰沒有該標記的單株，可減少研究者的工作量，再通過田間鑒定確定真實抗病的單株，自交純化獲得高抗植株。

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