毛 俊，張晴晴，李連宏，王 波，范姝君，于曉棠

(大連醫(yī)科大學(xué)中日臨床病理中心，遼寧大連116044)

2003年Al-Hajj等［1］利用體外致瘤實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)乳腺癌干細(xì)胞的存在，并確定其特異細(xì)胞表型為，其中的細(xì)胞亞群最低僅200個(gè)腫瘤細(xì)胞即可使NOD/SCID小鼠致瘤，并且從重建的乳腺癌組織中分離出的細(xì)胞還能再次在NOD/SCID鼠體內(nèi)重建出乳腺癌組織。2007年Ginestier等［2］研究發(fā)現(xiàn)只需要500個(gè)細(xì)胞表型乙醛脫氫酶(ALDH1A1)陽性的乳腺癌細(xì)胞即可在裸鼠體內(nèi)形成異質(zhì)瘤，其中細(xì)胞亞群僅20個(gè)就能形成乳腺腫瘤，為乳腺癌干細(xì)胞研究提供了新的標(biāo)志物。多項(xiàng)研究表明，乳腺癌干細(xì)胞與乳腺癌的治療及預(yù)后密切相關(guān)，可能是化療失敗以及腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段和多基因改變的過程［3］。表皮生長因子(EGF)是一種重要的調(diào)控細(xì)胞生長的因子，可以保持干細(xì)胞持續(xù)增殖的狀態(tài)。我們通過檢查正常乳腺和乳腺癌組織中EGF和ALDH1A1的表達(dá)情況，探討EGF在乳腺癌干細(xì)胞發(fā)生發(fā)展中可能的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2008年1月～2011年7月收治的乳腺癌患者45例，其中組織學(xué)分型高中分化(Ⅰ～Ⅱ級)22例、低分化(Ⅲ級)23例，患者手術(shù)前均未接受任何治療，年齡31～62歲、平均47歲。正常乳腺組織取自同期24例乳腺增生患者，年齡42～65歲、平均52歲。手術(shù)標(biāo)本采集后立即置入液氮冷凍，然后－80℃冰箱備用。所有診斷均經(jīng)病理檢查證實(shí)。

1.2 主要試劑 鼠抗人EGF單抗購置于Santa公司，兔抗人ALDH1A1購于Abcam公司，總RNA提取試劑TRIzol購于Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Takara公司。

1.3 細(xì)胞總RNA提取和RT-PCR 首先將凍存的組織勻漿，按照TRIzol試劑說明書提取總RNA。利用Prime5軟件設(shè)計(jì)并由大連寶生物公司合成引物。EGF上 游 引 物 為 5'-TATCATTCTGTTGCCAGTAGTTTC-3'，下游為 5'-AAGTTGTCTTTCTAAATCCACCC-3';ALDH1A1上游引物為5'-AATGGCATGATTCAGTGAGTGGC-3'，下游為 5'-GAGGAGTTTGCTCTGCTGGTTTG-3';內(nèi)參為β-actin，上游引物為5'-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3'，下游為5'-CACCTTCACCGCTTCAGTTT-3'，產(chǎn)物大小為306 bp。紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和濃度，然后按照 Reverse Transcription System試劑盒(KATARA)操作合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為:95℃ 5 min、95℃30 s、51℃30 s、72℃30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用QUANTITY ONE軟件分析電泳條帶與內(nèi)參的灰度值，以與內(nèi)參β-actin的比值代表EGF與ALDH1A1的相對表達(dá)量。

1.4 免疫組織化學(xué)方法檢測EGF與ALDH1A1蛋白的表達(dá) 乳腺組織標(biāo)本于4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋后按4 μm厚連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精連續(xù)脫水。按SABC顯色試劑盒(北京中杉金橋)步驟操作，EGF與ALDH1A1一抗?jié)舛葹?∶100，DAB顯色，顯微鏡下觀察并拍照。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒反應(yīng)為陽性。

1.5 染色結(jié)果判斷 陽性染色細(xì)胞呈淺棕色或棕黃色。EGF和ALDH1A1蛋白主要在胞質(zhì)中表達(dá)。采用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)和IMAGE PRO-PLUS 5.0圖像分析軟件，對每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)不重復(fù)的陽性反應(yīng)視野照相，計(jì)算平均光密度(aIOD)值，aIOD值與陽性區(qū)域的面積和著色深淺呈正比，即aIOD值越大，代表蛋白含量越高。依次記錄測量結(jié)果，aIOD≥0.5定性為陽性表達(dá)，aIOD＜0.5為陰性表達(dá)［4］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組均數(shù)比較用 t檢驗(yàn)，非參數(shù)檢驗(yàn)及Spearman作相關(guān)性分析。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測結(jié)果 正常乳腺組織、乳腺癌組織中EGF mRNA表達(dá)水平分別為0.57±0.02、1.14 ±0.21(P＜0.01)，ALDH1A1 mRNA表達(dá)水平分別為0.54±0.07、1.27±0.17(P＜0.01)，見圖1。

圖1 RT-PCR檢測EGF和ALDH1A1的mRNA表達(dá)

2.2 免疫組化結(jié)果 EGF、ALDH1A1均為胞質(zhì)著色。24例正常乳腺組織中有5例(20.8%)EGF陽性，45例乳腺癌組織中有34例(75.6%)EGF陽性，兩組比較P＜0.01。24例正常乳腺組織中有4例(16.7%)ALDH1A1陽性，45例乳腺癌組織中有29例(64.4%)ALDH1A1陽性，兩組比較P＜0.01。見插頁Ⅰ圖1。

2.3 乳腺癌組織中EGF與ALDH1A1表達(dá)相關(guān)性在45例乳腺癌組織中有24例(53.3%)EGF、ALDH1A1均為陽性表達(dá)，相關(guān)分析顯示，EGF和ALDH1A1的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.302，P＜0.05)。

2.4 乳腺癌組織中EGF與ALDH1A1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 EGF和ALDH1A1的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

EGF是1962年首次在小鼠的下頜下腺中發(fā)現(xiàn)的一種小分子蛋白，1975年從人尿中提出人EGF (hEGF)。EGF可以促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂及糖、蛋白質(zhì)、DNA及RNA合成，可通過傳導(dǎo)信號啟動與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因，使靜止細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞分裂期，從而使細(xì)胞增殖［5］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EGF在乳腺癌組織中基因和蛋白的表達(dá)明顯高于正常乳腺組織，提示EGF對乳腺癌的發(fā)生起重要作用。

ALDH1是乙醛脫氫酶家族成員之一，是將細(xì)胞內(nèi)乙醛氧化為乙酸的細(xì)胞溶質(zhì)酶，參與多種組織的分化與基因表達(dá)，同時(shí)也在正常干細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞生長和分化的中起重要作用［6，7］。研究表明，ALDH1在乳腺干細(xì)胞、造血干細(xì)胞以及神經(jīng)干細(xì)胞等細(xì)胞中高表達(dá)，ALDH1現(xiàn)已被認(rèn)為是乳腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、肺癌、結(jié)直腸癌干細(xì)胞的通用標(biāo)記物［2，8～11］，它是目前癌干細(xì)胞標(biāo)記物研究熱點(diǎn)之一，特別是作為乳腺癌干細(xì)胞的標(biāo)記物。2007年Ginestier等［2］首次利用ALDH1在乳腺癌實(shí)體組織中分選出乳腺癌干細(xì)胞，他們比較ALDH1+和ALDH1－細(xì)胞兩組細(xì)胞亞群的腫瘤形成實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，500個(gè)ALDH1+細(xì)胞就能形成腫瘤，而即使用50 000個(gè) ALDH1－細(xì)胞也不會形成腫瘤，說明ALDH1+細(xì)胞具有很高的致瘤能力。當(dāng)對臨床樣本進(jìn)行免疫組化檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)，ALDH1+乳腺癌干細(xì)胞與basa-like型以及HER2過表達(dá)型乳腺癌均相關(guān)，而basal-like型和HER2過表達(dá)型在乳腺癌所有基因亞型中存活期最短，預(yù)后最差［12］，所以ALDH1+乳腺癌患者預(yù)后較差。提示ALDH1是一種可應(yīng)用于檢測癌干細(xì)胞的重要標(biāo)記物，而且用這種簡單的標(biāo)記物可評估腫瘤患者預(yù)后。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ALDH1A1在乳腺癌組織中基因和蛋白水平明顯高于正常乳腺組織，ALDH1A1蛋白的表達(dá)與乳腺癌組織學(xué)分型表達(dá)存在正相關(guān)，與年齡、腫瘤大小淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)及PR無明顯相關(guān)性。

目前研究認(rèn)為，EGF作為一種重要的生長因子，許多因素都可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生，并通過不同的方式激活表皮生長因子受體(EGFR)信號傳導(dǎo)途徑。多數(shù)EGFR具有酪氨酸激酶活性，并通過這一機(jī)制對干細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控。研究中發(fā)現(xiàn)［13］，EGF與EGFR結(jié)合后，活化有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)反應(yīng)，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子-3(STAT-3)將信號傳遞至細(xì)胞核，激活受體特異性酪氨酸激酶，導(dǎo)致自身和蛋白底物磷酸化，進(jìn)而激活Na+/H+交換，并引起干細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增高，致使干細(xì)胞DNA合成增加。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)EGF可調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細(xì)胞分裂增殖，加入EGF可使Brd2U標(biāo)記的神經(jīng)前體細(xì)胞明顯增加。胚胎鼠的視網(wǎng)膜前體細(xì)胞在EGF作用下可分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞［14］。Ponti等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在無血清培養(yǎng)基中添加EFG能顯著提高乳腺癌干細(xì)胞球的比例。在我們的研究中，乳腺癌組織中EGF與ALDH1A1的表達(dá)存在正相關(guān)，由此我們推測，EGF的過表達(dá)促進(jìn)了乳腺癌干細(xì)胞的增殖。在隨著EGF在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制進(jìn)一步揭示，我們可以推斷EGF可能成為乳腺癌干細(xì)胞治療的一個(gè)靶點(diǎn)。

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