徐 濤，李方江，陳立鋒，李會(huì)賢

(1河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北張家口075000;2河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

慢性心力衰竭(簡(jiǎn)稱心衰)發(fā)生發(fā)展的基本機(jī)制是心室重構(gòu)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組能特異降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的鋅依賴性酶家族，在心室重構(gòu)中起重要作用［1］。我們于2009年12月～2011年2月進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)，采用腹主動(dòng)脈結(jié)扎致大鼠心衰模型，觀察芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)心衰大鼠心室重構(gòu)及MMPs表達(dá)的影響，探討芪藶強(qiáng)心膠囊治療心衰大鼠的分子機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康SD大鼠，清潔級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量200～240 g，購(gòu)于河北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(冀)2008-1-003。

1.2 藥物 芪藶強(qiáng)心膠囊，由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供。

1.3 主要試劑與儀器 內(nèi)皮素-1(ET-1)、血管緊張素Ⅱ(Ang-Ⅱ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)放射免疫試劑盒購(gòu)于北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司;所用一抗購(gòu)自Santa Cruz;RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物技術(shù)公司;MMP-2、MMP-9及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.4 動(dòng)物分組與造模 大鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組(S)，模型組(M)，芪藶強(qiáng)心膠囊高、中、低劑量組［1.2、0.6、0.3 g/(kg·d)，QLQXH、QLQXM、QLQXL］。每組12只。藥物以蒸餾水稀釋至所需濃度，給藥體積均為10 mL/kg，給藥途徑為灌胃給藥。

采用腹主動(dòng)脈縮窄法制作心衰大鼠模型［2］。大鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，劍突下腹正中切口，分層打開腹腔，在腎動(dòng)脈分支以上鈍性游離腹主動(dòng)脈，將7號(hào)注射器針頭平行置于腹主動(dòng)脈上，用4號(hào)手術(shù)絲線將腹主動(dòng)脈和注射器一同結(jié)扎，然后緩慢將注射器撤出，關(guān)腹，分層縫合。使大鼠腹主動(dòng)脈直徑縮窄為0.7 mm。假手術(shù)組開腹后將手術(shù)絲線穿過腹主動(dòng)脈，除不縮窄腹主動(dòng)脈外，其他操作與模型組完全相同。術(shù)后4周開始灌胃給藥，1次/d，連續(xù)給藥8周。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的測(cè)定［3］實(shí)驗(yàn)結(jié)束前麻醉大鼠，分離右頸總動(dòng)脈，以0.3%肝素生理鹽水充盈插管，連接BL-420F型生物醫(yī)學(xué)信號(hào)采集處理系統(tǒng)，將插管逆行進(jìn)入左心室后記錄其左心室壓峰值(LVP)、左室舒張末期壓(LVEDP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(+LVdp/dtmax)、左室內(nèi)壓最大下降速率(－LVdp/dtmax)及平均動(dòng)脈壓(MAP)和心率(HR)。

1.5.2 ET-1、Ang-Ⅱ和TNF-α檢測(cè) 頸總動(dòng)脈放血處死大鼠，采用放射免疫分析方法測(cè)定血漿中ET-1、Ang-Ⅱ和TNF-α，操作按說明書進(jìn)行。

1.5.3 左心室指數(shù)測(cè)定 稱取左心室實(shí)際重量，并與體質(zhì)量相除，得到左心室指數(shù)。

1.5.4 RT-PCR方法測(cè)定MMP-2、MMP-9及TIMP-1的mRNA表達(dá) 取大鼠心肌組織，常規(guī)方法提取RNA，按RT-PCR試劑盒要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR擴(kuò)增目的片段，引物序列如下:MMP-2:上游5'-TGGACCCTGAAACCGTGGAT-3'，下游5'-CTGTATTCCCGACCGTTGAAC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度330 bp; MMP-9:上游5'-ACCTCCAACCTCACGGACA-3'，下游5'-ACCACAACTCGTCGTCGTC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度525 bp;TIMP-1:上游 5'-CATCCTCTTGTTGCTATCACTGA-3'，下游 5'-CTGCGGTTCTGGGACTTGT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度279 bp;內(nèi)參照β-actin:上游5'-CAGGGTGTGATGGTGGG-3'，下游 5'-GGAAGAGGATGCGGCAG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度500 bp。PCR反應(yīng)條件為96℃ 4 min預(yù)變性，95℃ 30 s、58℃ 40 s、72℃ 30 s 25個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，掃描成像，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行密度分析。以β-actin作為內(nèi)參照。用各目的基因片段密度值/內(nèi)參照密度值的比值進(jìn)行比較。

1.5.5 明膠酶譜法測(cè)定MMPs活性 制備8% SDS-PAGE分離膠(含0.2%明膠)，上覆4%的濃縮膠，取20 μL處理后的標(biāo)本上樣，40 mA恒流電泳，溫度＜4℃。電泳后凝膠置于洗脫液中振蕩洗脫2次，45 min/次;置漂洗液漂洗2次，20 min/次;置于孵育液中37℃孵育18 h。經(jīng)染色液染色3 h，用脫色液脫色后，MMPs顯示為位于藍(lán)色背景上的透亮帶。凝膠經(jīng)凝膠掃描儀掃描。

2 結(jié)果

2.1 血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果 見表1。

2.2 心室指數(shù)、ET-1、Ang-Ⅱ和TNF-α檢測(cè)結(jié)果見表2。

表1 芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)心衰大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響(±s，n=12)

表1 芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)心衰大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響(±s，n=12)

注:與S組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01;與M組比較，*P＜0.05，△P＜0.01

?

表2 芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)心衰大鼠心室指數(shù)、ET-1、Ang-Ⅱ和TNF-α的影響(±s，n=12)

表2 芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)心衰大鼠心室指數(shù)、ET-1、Ang-Ⅱ和TNF-α的影響(±s，n=12)

注:與S組比較，#P＜0.01;與M組比較，*P＜0.05，△P＜0.01

?

2.3 MMP-2、MMP-9、及TIMP-1檢測(cè)結(jié)果 見表3。

表3 芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)心衰大鼠MMP-2、MMP-9及TIMP-1 mRNA表達(dá)的影響(±s，n=5)

表3 芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)心衰大鼠MMP-2、MMP-9及TIMP-1 mRNA表達(dá)的影響(±s，n=5)

注:與S組比較，△P＜0.01;與M組比較，*P＜0.01

?

2.4 MMPs活性 與S組比較，M組MMP-2、MMP-9活性均顯著增加，與M組比較，芪藶強(qiáng)心組MMP-2、MMP-9活性均顯著下降。見圖1。

圖1 各組大鼠MMPs活性明膠酶譜圖

3 討論

慢性心衰發(fā)生發(fā)展的根本機(jī)制是神經(jīng)內(nèi)分泌長(zhǎng)期激活導(dǎo)致的心室重構(gòu)［3］，建立腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)造成后負(fù)荷過重的心衰模型對(duì)于研究心肌肥厚演變、心室重構(gòu)具有重要價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明模型組大鼠與假手術(shù)組比較，血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)LVP、LVEDP、+LVdp/dtmax明顯上升，MAP、HE明顯降低，提示大鼠心功能障礙，心衰模型建立成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，芪藶強(qiáng)心膠囊能改善心衰大鼠的血流動(dòng)力學(xué)，同時(shí)能夠顯著降低大鼠血漿中ET-1、Ang-Ⅱ和TNF-α的含量，而這些因子是心室重構(gòu)的關(guān)鍵因素。Ang-Ⅱ與其受體結(jié)合后，引起細(xì)胞異常增殖、體積增大，導(dǎo)致心肌肥厚，降低心臟順應(yīng)性，增加僵硬度，形成心室重構(gòu);ET-1可以直接引起分子和細(xì)胞變化而導(dǎo)致心肌肥厚，又能刺激Ang-Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)锳ng-Ⅱ，致使增強(qiáng)的Ang-Ⅱ引起醛固酮分泌而影響心室重構(gòu); TNF-α可引起心肌細(xì)胞數(shù)目減少，同時(shí)使心臟中膠原含量增加，促進(jìn)心室重構(gòu)［5，6］。因此認(rèn)為芪藶強(qiáng)心膠囊能夠改善心衰大鼠的心功能，抑制心室重構(gòu)，延緩心衰的發(fā)生。

MMPs家族是一個(gè)內(nèi)源性鋅依賴酶家族，可降解除多糖以外所有細(xì)胞外基質(zhì)成分［7］。研究發(fā)現(xiàn)慢性心衰時(shí)各種刺激因素導(dǎo)致MMPs活性升高，而TIMPs活性降低，MMPs/TIMPs平衡失調(diào)，正常的膠原蛋白被升高的MMPs降解并被缺乏連接結(jié)構(gòu)的纖維性間質(zhì)所取代，心臟纖維膠原網(wǎng)絡(luò)被破壞，最終導(dǎo)致左室擴(kuò)張及球型變［8］。MMP-2、MMP-9作為MMPs家族分布最廣的兩種亞型，參與了多種心臟疾病的病理過程，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示心衰大鼠模型組MMP-2、MMP-9、TIMP-1表達(dá)均顯著增加，明膠酶譜法結(jié)果觀察到MMP-2、MMP-9活性均顯著增加，而給予芪藶強(qiáng)心膠囊治療組的大鼠MMP-2、MMP-9表達(dá)降低，TIMP-1表達(dá)升高，MMP-2、MMP-9活性降低，提示芪藶強(qiáng)心膠囊能抑制 MMPs活性，調(diào)節(jié)MMPs/TIMPs平衡，改善心室重構(gòu)。

綜上所述，芪藶強(qiáng)心膠囊可通過抑制MMPs活性、調(diào)節(jié)MMPs/TIMPs平衡改善心衰大鼠的心功能，抑制心室重構(gòu)，延緩心衰的發(fā)生。

［1］Huang CX，Yuan MJ，Huang H，et al.Ghrelin inhibits post-infarct myocardial remodeling and improves cardiac function through antiinflammation effect［J］.Peptides，2009，30(12):2286-2291.

［2］朱丹，郭艷紅，于海奕，等.兩種早期心衰大鼠模型的建立和心功能的比較［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19(9):20-24.

［3］馬力，劉杰，初楠，等.慢性心力衰竭大鼠心肌肥厚指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)［J］.山東醫(yī)藥，2010，50(39):20-22.

［4］Spinale FG.Matrix metalloproteinases:regulation and dysregulation in the failing heart［J］.Circ Res，2002，90(5):520-530.

［5］王江，田穎，祝善俊，等.心力衰竭大鼠心肌組織腫瘤壞死因子-α的變化［J］.中國(guó)臨床康復(fù)，2004，8(21):4214-4215.

［6］張善堂，王欽茂，陳禮明，等.參麥注射液對(duì)實(shí)驗(yàn)性心力衰竭大鼠左室舒縮性能及血漿AngⅡ、ET和ANP的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2001，8(1):21-24.

［7］Gallagher GL，Jackson CJ，Hunyor SN.Myocardial extracellular matrix remodeling in ischemic heart failure［J］.Front Biosci，2007，1(12):1410-1419.

［8］張?chǎng)?，劉瀚旻，楊永健.基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制物-1與左心室重構(gòu)的關(guān)系［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38(1):160-161.