向志光，佟 巍，劉先菊，張麗芳，李雨函，王艷蓉，劉云波，魏 強(qiáng)

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)中心，北京 100021）

仙臺(tái)病毒是實(shí)驗(yàn)用大鼠和小鼠嚴(yán)格控制的病毒性疾病，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量，因此清潔級(jí)以上實(shí)驗(yàn)大小鼠中必須嚴(yán)格控制［1］。目前在病毒性病原體的檢測(cè)中多采取血清學(xué)方法，在我國(guó)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中也推薦了如免疫熒光法（IFA）、免疫酶法（IEA）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等傳統(tǒng)的血清學(xué)方法［2］。但是目前我國(guó)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的檢測(cè)過(guò)程中多是以各自實(shí)驗(yàn)室自行制備的試劑進(jìn)行檢測(cè)，而檢測(cè)過(guò)程中檢測(cè)試劑的質(zhì)量會(huì)最終影響到檢測(cè)結(jié)果的判定，因此對(duì)現(xiàn)有的檢測(cè)試劑進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化的研究十分必要。

根據(jù)我中心多年的工作積累，我們按照我國(guó)農(nóng)業(yè)部對(duì)于獸醫(yī)診斷制品的要求［3］，對(duì)小鼠仙臺(tái)病毒抗體ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行了較為規(guī)范的研制。

1 材料和方法

1.1 病毒、細(xì)胞等的來(lái)源和種子批、庫(kù)的建立

仙臺(tái)病毒和病毒培養(yǎng)細(xì)胞BHK-21來(lái)自美國(guó)ATCC。培養(yǎng)仙臺(tái)病毒用SPF雞胚來(lái)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞的EMEM培養(yǎng)基來(lái)自美國(guó)ATCC。胎牛血清和其他添加劑為Invitrogen公司產(chǎn)品。100μL仙臺(tái)病毒原液接種SPF雞胚收獲尿囊液，繼續(xù)在雞胚傳代分別混合成批，經(jīng)病毒的種子批純凈性和毒力等檢定分別建立仙臺(tái)病毒的原始種子批，基礎(chǔ)種子批和工作種子批。BHK-21細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)傳代建立相應(yīng)的3層細(xì)胞庫(kù)。

1.2 病毒抗原的生產(chǎn)和純化

以一定毒力的工作種子批病毒接種培養(yǎng)成單層的BHK-21細(xì)胞，培養(yǎng)一定時(shí)間后對(duì)培養(yǎng)物做反復(fù)凍融，經(jīng)56℃30 min對(duì)培養(yǎng)物做滅活處理，經(jīng)連續(xù)的差速離心去除細(xì)胞碎片，收集病毒。病毒經(jīng)超聲處理，離心后的可溶性蛋白組分測(cè)定濃度，作為仙臺(tái)病毒ELISA檢測(cè)中的抗原蛋白進(jìn)行后續(xù)包被。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)血清的制備

以雞胚尿囊液培養(yǎng)的仙臺(tái)病毒多次不同途徑接種6～8周齡SPF級(jí)BALB/C小鼠，最后一次接種一周后收集血清，并作滅活處理［4］。以IFA方法和ELISA方法對(duì)免疫血清做滴度檢測(cè)，IFA滴度大于1∶160的血清可混合成批，對(duì)每批混合血清做IFA滴度測(cè)試使其達(dá)到1∶160以上。批次免疫血清做梯度稀釋后進(jìn)行ELISA檢測(cè)，按照測(cè)定值在1.1～1.6范圍內(nèi)的稀釋度稀釋免疫血清可以做后續(xù)ELISA檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照（陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清）。能夠用IFA方法做陽(yáng)性判定的最低稀釋度免疫血清作為ELISA檢測(cè)的陽(yáng)性臨界判定血清（陽(yáng)性臨界值血清）。普通的SPF小鼠經(jīng)鑒定排除仙臺(tái)病毒感染，血清混合作為陰性對(duì)照（陰性標(biāo)準(zhǔn)血清）。

1.4 ELISA反應(yīng)板體系的優(yōu)化

分別以不同濃度的抗原蛋白包被ELISA平板，測(cè)定梯度稀釋的免疫血清，選擇最優(yōu)的抗原包被濃度。測(cè)定不同反應(yīng)條件（反應(yīng)溫度）對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的影響。確定最優(yōu)反應(yīng)條件。

1.5 樣品的檢測(cè)

對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)血清和待檢樣品做1∶40倍稀釋100μL，加入預(yù)先水化的ELISA孔中，每個(gè)樣品做復(fù)孔，留空白孔做對(duì)照，37℃孵育1 h；扣除孵育液，PBST洗板3次后加入酶標(biāo)記物，37℃孵育1 h；扣除孵育液，PBST洗板3次后加入酶底物液，室溫孵育10 min以內(nèi)，待陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清顯色至OD600讀值至0.8加入終止液終止顯色反應(yīng)，OD450讀值檢測(cè)。陽(yáng)性臨界血清測(cè)量值作為陽(yáng)性樣品判定標(biāo)準(zhǔn)；陰性標(biāo)準(zhǔn)血清測(cè)量值加0.15做陰性樣品判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 IFA和Westernblot對(duì)于結(jié)果的驗(yàn)證

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的IFA方法制備仙臺(tái)病毒感染細(xì)胞的抗原玻片，進(jìn)行IFA方法檢測(cè)。使用包被ELISA平板的抗原蛋白行SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)至NC膜上和1∶100稀釋的血清樣本進(jìn)行雜交，使用酶標(biāo)記二抗顯示特異條帶，ECL發(fā)光顯影。

1.7 檢測(cè)體系的質(zhì)量控制

對(duì)ELISA試劑盒的生產(chǎn)、保存、使用等環(huán)節(jié)進(jìn)行質(zhì)量控制。關(guān)鍵質(zhì)控點(diǎn)包括：抗原蛋白的純度測(cè)定；酶標(biāo)板批內(nèi)批間的穩(wěn)定性檢測(cè)；標(biāo)準(zhǔn)血清的批次滴度測(cè)定；檢測(cè)體系中空白孔、陰性標(biāo)準(zhǔn)血清、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清、陽(yáng)性臨界濃度血清測(cè)量值范圍做限定。

2 結(jié)果

2.1 仙臺(tái)病毒種子批和BHK-21細(xì)胞庫(kù)的建立和鑒定

將500μL仙臺(tái)病毒原液接種5只SPF雞胚收獲尿囊液混合成批，作為原始病毒的種子批，在雞胚繼續(xù)傳代混合成批，分別制備基礎(chǔ)種子批和工作種子批，使用血凝法對(duì)病毒的毒力進(jìn)行測(cè)定，血凝毒力達(dá)到要求的1∶128以上。3層種子批通過(guò)了無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、病毒的特征性血凝抑制實(shí)驗(yàn)，達(dá)到農(nóng)業(yè)部對(duì)于病毒的種子批純凈性和毒力等檢定的要求。BHK-21細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)分別建立了原始細(xì)胞庫(kù)、基礎(chǔ)細(xì)胞庫(kù)、工作細(xì)胞庫(kù)，通過(guò)了農(nóng)業(yè)部要求的檢驗(yàn)。每3個(gè)月對(duì)病毒種子批進(jìn)行毒力測(cè)定，發(fā)現(xiàn)病毒保存6個(gè)月內(nèi)毒力無(wú)明顯變化，細(xì)胞庫(kù)6個(gè)月復(fù)蘇測(cè)定細(xì)胞復(fù)蘇效率未發(fā)現(xiàn)明顯變化。建立了病毒種子批和細(xì)胞庫(kù)的保藏管理和更新維護(hù)的體系，以滿足后續(xù)試劑盒的長(zhǎng)期生產(chǎn)需求。

2.2 病毒抗原的生產(chǎn)和純化工藝研究

以不同劑量的仙臺(tái)病毒接種培養(yǎng)成單層的BHK-21細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血凝滴度低于1∶64的仙臺(tái)病毒雞胚尿囊液培養(yǎng)物感染BHK細(xì)胞在1周以內(nèi)不能很好的引起細(xì)胞病變，測(cè)試血凝滴度低于1∶32；當(dāng)血凝滴度高于1∶512時(shí)細(xì)胞病變發(fā)生迅速（小于24 h），但血凝滴度未能達(dá)到1∶64；使用血凝滴度1∶128的仙臺(tái)病毒培養(yǎng)物感染BHK-21細(xì)胞，在60～84 h間細(xì)胞培養(yǎng)物中病毒的滴度處于增殖狀態(tài)，而之后的時(shí)間段病毒滴度下降，在更換培養(yǎng)基后滴度有少量提高。

圖1 不同劑量仙臺(tái)病毒接種BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)病毒血凝滴度變化Fig.1 HI changes of Sendai virus cultured in BHK-21 cells with different inoculation doses

對(duì)病毒細(xì)胞培養(yǎng)物做反復(fù)凍融，經(jīng)56℃30 min對(duì)培養(yǎng)物做滅活處理，做后續(xù)抗原蛋白純化。直接使用細(xì)胞培養(yǎng)物作為ELISA抗原，結(jié)果顯示抗原特異性差；使用10000 rpm低溫離心30 m in能有效去除細(xì)胞碎片，在經(jīng)過(guò)35000 rpm低溫離心3 h收集病毒顆粒。直接使用病毒顆粒進(jìn)行ELISA平板包被，和對(duì)照血清的反應(yīng)結(jié)果顯示不同孔之間檢測(cè)數(shù)值存在差異，差值較大。對(duì)病毒顆粒進(jìn)行超聲處理，收集可溶性抗原蛋白進(jìn)行平板包被，平板孔與孔之見(jiàn)差異極小，適用于ELISA抗原生產(chǎn)（具體數(shù)據(jù)另文報(bào)告）。因此確定為病毒抗原生產(chǎn)工藝。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)血清的制備

每批50只國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)合格的6周齡SPF級(jí) BALB/c小鼠，使用SeV雞胚尿囊液，濃度為100 TCID50/100μL，先后以一次腹腔、2次滴鼻的方式每隔一周進(jìn)行一次接種。最后一次免疫后第10天，尾尖采血，56℃30 min滅活，5000 rpm/min離心20 m in后取上清測(cè)定抗體IFA效價(jià)。效價(jià)高于1∶160認(rèn)為免疫合格進(jìn)行后續(xù)采血。對(duì)同一批次的免疫血清進(jìn)行檢驗(yàn)。每批混合血清做IFA滴度測(cè)試，3批次免疫血清均達(dá)到1∶320。

混合成批的免疫血清從1∶40開(kāi)始進(jìn)行倍比稀釋至1∶40960將稀釋好的血清加入用已包被有SeV抗原的ELISA板中，根據(jù)ELISA反應(yīng)條件進(jìn)行操作，最后在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。測(cè)定值在1.1～1.6范圍內(nèi)的稀釋度為1∶640左右，對(duì)3批次免疫血清做1∶16倍稀釋后作為陽(yáng)性對(duì)照。再做1∶40稀釋達(dá)到1∶640，多次測(cè)量OD450吸光度在1.1～1.6范圍內(nèi)。檢測(cè)吸光度達(dá)到合理范圍，可以做后續(xù)ELISA檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照（陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清）。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清再進(jìn)行8倍稀釋后可以被IFA方法做陽(yáng)性判定。繼續(xù)稀釋不能做IFA法陽(yáng)性判定。因此將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清做8被稀釋可做ELISA檢測(cè)的陽(yáng)性臨界判定血清（陽(yáng)性臨界值血清）。普通的SPF小鼠經(jīng)鑒定排除仙臺(tái)病毒感染，血清混合成批作為陰性對(duì)照（陰性標(biāo)準(zhǔn)血清）。

2.4 ELISA反應(yīng)板體系的優(yōu)化

將抗原稀釋成10μg/m L、5μg/m L、2.5μg/ m L、1.25μg/m L蛋白濃度，小鼠抗SeV免疫血清從1∶40開(kāi)始倍比稀釋，進(jìn)行間接ELISA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，包被抗原為1.25μg/m L時(shí)為最適抗原包被濃度。

對(duì)于30份標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行檢測(cè)，選擇不同的血清孵育溫度，以及不同二抗孵育反應(yīng)的溫度分析標(biāo)準(zhǔn)樣品在不同條件下的檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同反應(yīng)溫度的變化影響到ELISA檢測(cè)讀數(shù)，也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定。控制反應(yīng)溫度在37℃，反應(yīng)1 h可以保證免疫反應(yīng)的充分進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為穩(wěn)定。因此確定血清樣本的反應(yīng)溫度和二抗的反應(yīng)溫度均在37℃，各自反應(yīng)1 h可作為試劑盒檢測(cè)的最適條件。

2.5 小鼠血清樣品測(cè)試ELISA試劑盒

來(lái)源清晰的SPF級(jí)小鼠血清樣本、仙臺(tái)病毒免疫小鼠血清和其它方法測(cè)定仙臺(tái)病毒陽(yáng)性小鼠血清樣本的作為測(cè)試樣本，測(cè)定多批次小鼠仙臺(tái)病毒ELISA檢測(cè)試劑盒陰性樣本的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：513份SPF小鼠血清ELISA檢測(cè)OD450均值在3次實(shí)驗(yàn)中分別為0.043±0.035；0.056±0.045； 0.067±0.052；IFA法判定的仙臺(tái)病毒陽(yáng)性的免疫血清的臨界濃度在ELISA檢測(cè)中OD450的測(cè)量值在0.3～0.45之間變動(dòng)；672份待測(cè)血清樣本使用陰性對(duì)照測(cè)量均值+0.15（3倍標(biāo)準(zhǔn)差）作為陰性樣本的判定標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)得試劑盒的特異性高于99.7％；使用仙臺(tái)病毒陽(yáng)性的免疫血清的臨界濃度在ELISA檢測(cè)中OD450的測(cè)量值作為陽(yáng)性樣本的判定標(biāo)準(zhǔn)，敏感性高于99.5％。

2.6 IFA和Westernblot對(duì)于結(jié)果的驗(yàn)證

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的IFA方法制備仙臺(tái)病毒感染細(xì)胞的抗原玻片，進(jìn)行IFA方法檢測(cè)。小鼠仙臺(tái)病毒ELISA檢測(cè)試劑盒與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)IFA方法的符合率為98.33％；將ELISA檢測(cè)結(jié)果處于2個(gè)臨界濃度之間的血清進(jìn)行Western blot檢測(cè)，在被檢的10份血清中有6份存在陽(yáng)性條帶。

2.7 ELISA試劑盒的質(zhì)量控制

3批次抗原蛋白行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至NC膜和免疫血清進(jìn)行雜交，結(jié)果如圖3所示：3批抗原蛋白均顯示出主要抗原蛋白條帶，無(wú)明顯雜帶存在。符合此標(biāo)準(zhǔn)的抗原蛋白可以進(jìn)行后續(xù)抗原包被工作。

為了測(cè)定小鼠仙臺(tái)病毒ELISA檢測(cè)試劑盒批間和批內(nèi)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性，測(cè)定同一樣品的在不同批次產(chǎn)品測(cè)試結(jié)果的變異率，以及批間和批內(nèi)的測(cè)試變異對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的影響，隨機(jī)抽取3批ELISA平板樣品，每批樣品隨機(jī)抽取6塊ELISA平板，使用同一組測(cè)試血清樣品30份，在每個(gè)測(cè)試平板上測(cè)試，并做復(fù)孔。統(tǒng)計(jì)測(cè)試結(jié)果在不同批次和批內(nèi)的變異率，同時(shí)計(jì)算測(cè)試的敏感性和特異性，評(píng)價(jià)批內(nèi)結(jié)果的變異率和批間結(jié)果的變異率對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：用IFA方法測(cè)定30份血清樣品，其中5份為陽(yáng)性，25份為陰性血清樣品。使用ELISA方法測(cè)定陽(yáng)性樣本為5份，陰性樣本為25份。不同批次和批內(nèi)不同試劑盒平板不影響檢測(cè)結(jié)果的判定。陰性樣本OD450測(cè)定數(shù)值的批內(nèi)變異率小于5％，批間變異率小于5％（圖4）；陽(yáng)性樣本OD450測(cè)定數(shù)值的批內(nèi)變異率小于5％，批間變異率小于10％（圖5）。

圖3 3批抗原和標(biāo)準(zhǔn)免疫血清雜交的結(jié)果Fig.3 Western blot reaction of 3 batches antigens with standardized immune serum

圖4 25份陰性樣本測(cè)試ELISA試劑盒批內(nèi)變異率和批間變異率Fig.4 The variability of 3 batches ELISA kitstested by 25 SeV negative sera

圖5 5份陽(yáng)性樣本測(cè)試ELISA試劑盒批內(nèi)變異率和批間變異率Fig.5 The variability of 3 batches ELISA kitstested by 5 SeV positive sera

混合制備的小鼠仙臺(tái)病毒陰性血清ELISA檢測(cè)多次重復(fù)試驗(yàn)OD450的測(cè)量值在0.1以下；對(duì)3個(gè)批次的免疫血清的批次滴度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖6所示，進(jìn)行倍比稀釋用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，3批次免疫血清測(cè)量值重復(fù)性較好。

圖6 3批仙臺(tái)病毒免疫血清用ELISA方法做質(zhì)控檢驗(yàn)Fig.6 The quality control tests of 3 batches SeV immune sera

3 討論

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)作為較為常規(guī)的血清學(xué)檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，對(duì)設(shè)備要求不高，樣品檢測(cè)通量較大，目前在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量控制方面應(yīng)用前景廣闊。但是作為一種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的診斷用試劑，其質(zhì)量的穩(wěn)定性十分重要。在ELISA試劑盒的質(zhì)量控制中最為關(guān)鍵的問(wèn)題包括抗原的質(zhì)量，生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，參比血清的穩(wěn)定性等，因此本文就我中心研發(fā)小鼠仙臺(tái)病毒ELISA試劑盒過(guò)程中的質(zhì)控技術(shù)做了闡述。

包被抗原是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的重要因素。天然抗原目前仍是最具代表性的抗原物質(zhì)，因此我們?cè)诒驹噭┖械拈_(kāi)發(fā)中首選天然病毒抗原?？紤]到生產(chǎn)成本和生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，本試劑盒采用BHK-21細(xì)胞作為病毒擴(kuò)大培養(yǎng)的載體，和雞胚來(lái)源的病毒相比，該方法排除了雞胚蛋白對(duì)于實(shí)驗(yàn)的干擾（結(jié)果未展示），生產(chǎn)工藝穩(wěn)定。在病毒抗原生產(chǎn)中感染用仙臺(tái)病毒的接種劑量有一定的范圍要求。當(dāng)病毒接種劑量過(guò)低時(shí)，短時(shí)間內(nèi)不能很好的引起細(xì)胞的病變，一方面影響了病毒的增長(zhǎng)，對(duì)于生產(chǎn)的病毒的質(zhì)量產(chǎn)生影響；同時(shí)病毒生產(chǎn)的周期過(guò)長(zhǎng)，不利于病毒培養(yǎng)的條件控制，也提高了生產(chǎn)的成本。而病毒接種劑量過(guò)高導(dǎo)致被感染細(xì)胞病變速度過(guò)快，同樣影響了病毒的質(zhì)量，使得病毒的生長(zhǎng)不完全，而細(xì)胞破碎嚴(yán)重。適當(dāng)接種劑量的仙臺(tái)病毒（在本研究中選擇了血凝滴度1：128的接種劑量）可以在感染細(xì)胞2～3 d的時(shí)間范圍出現(xiàn)病毒的快速增長(zhǎng)，病毒的培養(yǎng)較為穩(wěn)定，在接種后72 h收獲病毒，符合試劑盒病毒生產(chǎn)的需要，可以作為最適的培養(yǎng)條件。

仙臺(tái)病毒作為顆粒性抗原，大小在100 nm以上，對(duì)于酶標(biāo)板表面的吸附性較差。本研究中將病毒抗原做超聲處理，收集可溶性成分進(jìn)行酶標(biāo)板的抗原包被，結(jié)果顯示包被孔之見(jiàn)差異較小，有效的提高了抗原包被的穩(wěn)定性。而對(duì)于抗原純度的控制我們采用了免疫印記的方法對(duì)于主要抗原帶型進(jìn)行了鑒定。通過(guò)此種質(zhì)控手段，本試劑盒的批間檢測(cè)結(jié)果的變異率控制在較低水平。

通過(guò)對(duì)大量檢測(cè)樣品的測(cè)試，我們發(fā)現(xiàn)SPF級(jí)動(dòng)物的血清檢測(cè)數(shù)據(jù)多控制在0.2以下。而不同實(shí)驗(yàn)對(duì)此標(biāo)準(zhǔn)會(huì)有一定影響，例如顯色時(shí)間和顯色程度，因此我們采取陰性參比血清的檢測(cè)結(jié)果加0.15作為陰性判定標(biāo)準(zhǔn)。以此標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大量樣品做多次檢測(cè)，檢測(cè)的特異性達(dá)到99％以上。因此在檢測(cè)過(guò)程中低于此標(biāo)準(zhǔn)的樣品可做陰性判定。而高于此標(biāo)準(zhǔn)的血清樣品，仍有少量不能用IFA和Western blot等其他方法做陽(yáng)性判定，而高于IFA法臨界濃度的樣品，在陽(yáng)性結(jié)果的判定上有較高的一致性。可以看出對(duì)于小鼠仙臺(tái)病毒的檢測(cè)最為靈敏的方法為ELISA方法，其次為Western blot，而IFA方法靈敏度相對(duì)較低。因此在本試劑盒中增設(shè)了陽(yáng)性臨界濃度血清判定指標(biāo)，當(dāng)ELISA檢測(cè)結(jié)果高于此標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，使用其他方法可對(duì)此樣品做出一致的判斷。而低于此標(biāo)準(zhǔn)高于陰性判定標(biāo)準(zhǔn)的樣品，其來(lái)源動(dòng)物的種群需要做進(jìn)一步的檢測(cè)。我們對(duì)仙臺(tái)病毒感染小鼠也做了消長(zhǎng)規(guī)律的研究，在感染一周后就可以用ELISA試劑盒檢測(cè)抗仙臺(tái)病毒的抗體，而感染3個(gè)月后抗仙臺(tái)病毒抗體的水品任然維持在高位，因此目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于實(shí)驗(yàn)小鼠仙臺(tái)病毒檢測(cè)周期的要求是合理的。

［1］國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)，GB14922.2 -2001.

［2］國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物仙臺(tái)病毒檢測(cè)方法，GB/T 14926.23 -2001.

［3］獸醫(yī)診斷制品注冊(cè)分類及注冊(cè)資料要求。農(nóng)業(yè)部公告第442號(hào)發(fā)布.

［4］侯麗波，謝軍芳，佟巍，等.小鼠仙臺(tái)病毒標(biāo)準(zhǔn)化血清的制備及鑒定［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，18（9）：57-59.