張興虎 錢曉明 齊玉琴 萬文輝 趙東寶

樹突狀細胞(DC)是已知體內(nèi)功能最強的一類抗原提呈細胞(APC)，其最大的特點就是能有效刺激原始T細胞，誘導(dǎo)初次免疫應(yīng)答，也能促進B細胞生成抗體及自然殺傷(NK)細胞的激活，處于機體內(nèi)免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)［1-3］。應(yīng)用粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細胞介素4(IL-4)體外可以誘導(dǎo)人外周血單核細胞生成DC(MoDC)，并具有極強的刺激T細胞增殖的能力［4-5］。而胸腺肽α1是一種具有多種效應(yīng)的免疫增強劑，其除了可以增強NK細胞的能力外，還可以明顯促進同種T細胞的增殖［6］。本研究主要是觀察≥80歲老年人在應(yīng)用胸腺肽α1后，外周血單核細胞培養(yǎng)所得到的DC生長、活力、存活時間及刺激T細胞增殖情況的改變。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備DC培養(yǎng)基CellGro-DC購自德國CellGenix公司;rhGM-CSF、rhIL-4購自上海飛捷公司;絲裂霉素C購自日本Kyowa Hakko kogyo公司;淋巴細胞分離液購自天津TBD公司;DMSO購自美國Sigma公司;倒置顯微鏡(Zeiss Axiovert 40)、MTT(噻唑藍)購自上海生工公司。

1.2 試驗對象選取老年人30例，年齡80～96歲，平均(85.6±4.5)歲，其中男22例，女8例。排除腫瘤、糖尿病、慢性感染、自身免疫性疾病、服用免疫抑制劑，并未接受過免疫增強劑的治療。

1.3 治療方法給予胸腺肽α1注射劑1.6 mg皮下注射，每周2次，療程為1月。

1.4 DC體外培養(yǎng)在治療前后分別將新鮮的抗凝外周血各20 ml，經(jīng)淋巴細胞分離液梯度離心(20℃，400 g，20 min)，取界面細胞，放入50 ml離心管中，用PBS懸浮細胞，離心(200 g，10 min)洗細胞3次，用Cell-Gro-DC培養(yǎng)基懸浮細胞，加入24孔板，每孔2.5×106細胞/ml培養(yǎng)基，置37℃、5%二氧化碳孵箱(Thermo-Forma)培養(yǎng)2 h后，吸棄上清，用預(yù)熱的培養(yǎng)基輕輕洗培養(yǎng)板去除非貼壁細胞，即獲得貼壁的單核細胞，每孔加1 ml CellGro-DC樹突狀細胞培養(yǎng)基，rhGM-CSF 100 ng/ml，rhIL-4 4500 U/ml，置37℃、5%二氧化碳孵箱培養(yǎng)，培養(yǎng)第3天每孔補加上述培養(yǎng)基1 ml及細胞因子，培養(yǎng)第7天收集懸浮細胞，即為DC。

1.5 DC形態(tài)觀察通過倒置顯微鏡每天觀察細胞活力、數(shù)量及形態(tài)變化。

1.6 混合淋巴細胞反應(yīng)首先用淋巴細胞分離液分離正常人外周血單個核細胞，置37℃培養(yǎng)2 h后去除貼壁細胞，非貼壁細胞用10%AB血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液懸浮，制備獲得同種淋巴細胞，96孔板每孔加入同種淋巴細胞5×105。DC用含10%AB血清的RPMI 1640懸浮為5×106細胞/ml，加入絲裂霉素C 25 μg/ml，37℃孵育45 min，RPMI液洗3次，用含10%AB血清的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮細胞，按DC∶T細胞不同比例(1∶10，1∶30，1∶90，1∶270)，將滅活的DC加入96孔板中與同種異體T淋巴細胞混合，每組設(shè)3個復(fù)孔，終體積為200 μl，另取3孔只加淋巴細胞而不加DC細胞，作為背景對照。置于37℃、5%二氧化碳孵箱培養(yǎng)96 h，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl，繼續(xù)孵育4 h，1500 r/min，離心5 min，吸去孔內(nèi)液體，每孔加DMSO 200 μl，震蕩搖勻后在37℃放置0.5 h待甲臢結(jié)晶完全溶解后，用自動光譜測讀儀(molecular device)測定光密度(A)值(570 nm)，結(jié)果用3孔均值表示。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件包進行t檢驗比較治療前后的差異，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DC體外培養(yǎng)生成的情況通過對≥80歲老年人胸腺肽α1治療前后外周血DC體外培養(yǎng)的觀察，發(fā)現(xiàn)治療前DC在培養(yǎng)過程中細胞逐漸死亡，培養(yǎng)孔中的細胞量逐漸較少，培養(yǎng)至第7天部分細胞死亡，留有少量單核樣細胞及懸浮的樹突狀形態(tài)的細胞，最終獲得的DC數(shù)量較少(圖1A)，其中有8例未能培養(yǎng)出DC。而治療后培養(yǎng)細胞的活力保持較好，至第7天全部獲得數(shù)量較多的DC(圖1B)。

圖1 體外培養(yǎng)第7天時生成DC的形態(tài)(×100)

2.2 DC的體外存活時間培養(yǎng)至第7天獲得的DC體外繼續(xù)培養(yǎng)，治療前DC繼續(xù)培養(yǎng)2 d后全部死亡，而治療后DC體外繼續(xù)培養(yǎng)可以保持存活5～7 d。

2.3 同種T淋巴細胞刺激能力測定刺激同種T淋巴細胞增殖能力的高低直接反映了DC的功能狀況。治療前DC刺激同種T淋巴細胞增殖能力較弱，在刺激細胞：反應(yīng)細胞(S∶R)比值為1∶10時A值為0.79±0.11，而治療后A值為1.23±0.22，治療前后具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。

3 討論

DC在先天性和獲得性免疫中扮演了重要的角色。DC是體內(nèi)功能最強和最活躍的專職APC，體內(nèi)分布廣泛，亞群復(fù)雜，能捕獲、處理和提呈抗原，并參與淋巴細胞激活、生長和分化，在天然免疫和獲得性免疫中均發(fā)揮著極其重要的作用，它是識別病原體侵入的第一道防線。機體的免疫識別首先由DC捕獲、加工和處理抗原，再將抗原提呈給T、B淋巴細胞，從而引發(fā)一系列免疫應(yīng)答，在體內(nèi)發(fā)揮強大的免疫監(jiān)視功能。

增齡引起的DC功能的下降減弱了機體免疫防御及免疫監(jiān)視作用，致使老年人容易患感染、腫瘤和自身免疫性疾病。老年人DC攝取抗原能力的下降減弱了它對抗原的加工和提呈，進而也影響了它激活T細胞的能力。然而目前人們對DC在免疫衰老中所起的作用還不是十分清楚。

胸腺肽α1是一種重要的免疫調(diào)節(jié)劑，能誘導(dǎo)T細胞的分化，促進T淋巴細胞亞群發(fā)育并活化等各種免疫效應(yīng)，臨床上主要用于免疫缺陷癥和自身免疫性疾病的治療。本研究從另一途徑研究其對機體免疫增強作用。有實驗研究表明直腸腫瘤小鼠模型接受胸腺肽α1加IL-2治療后，其外周血單核細胞的數(shù)量明顯增多［7］，≥80歲老年人較普通老年人外周血培養(yǎng)的DC體外的生長活力、T細胞刺激能力明顯降低［8］。本研究顯示，≥80歲老年人應(yīng)用胸腺肽α1后DC的活力和對同種T淋巴細胞的增殖作用明顯增強，可能的原因就是胸腺肽α1增強了外周血單核細胞的活性和(或)增多了其數(shù)量，具體的作用機制有待于進一步研究。文獻中尚沒有血型對DC刺激同種T淋巴細胞增殖能力有影響的相關(guān)報道。

本試驗發(fā)現(xiàn)胸腺肽α1治療后高齡老年人DC的體外培養(yǎng)存活時間延長，細胞活力明顯上升，培養(yǎng)獲得的DC數(shù)量明顯增多，刺激同種異體T淋巴細胞反應(yīng)的能力也出現(xiàn)了一定程度的上升。

當今世界人口老齡化是一個發(fā)展趨勢，并且≥80歲老年人群在老年人群中所占的比例越來越大，≥80歲老年人的免疫功能低下致使感染性疾病的發(fā)病率明顯增加，已嚴重影響了他們的生命質(zhì)量，如何減少感染性疾病的發(fā)生率，提高他們的生活質(zhì)量已成為當今老年病學(xué)的一個重要的研究課題。本研究結(jié)果為進一步探究老年免疫衰老的發(fā)病機制及有效干預(yù)提供了一個可靠的實驗理論依據(jù)。

［1］López-Bravo M，Ardavín C.In vivo induction of immune responses to pathogens by conventional dendritic cells［J］.Immunity，2008，29(3)：343-351.

［2］Wu L，Liu YJ.Development of dendritic-cell lineages［J］.Immunity，2007，26(6)：741-750.

［3］Steinman RM，Banchereau J.Taking dendritic cells into medicine［J］.Nature，2007，449(7161)：419-426.

［4］Sallusto F，Lanzavecchia A.Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factorα［J］.J Exp Med，1994，179(4)：1109-1118.

［5］朱學(xué)軍，曹雪濤，于益芝，等.人外周血樹突狀細胞的體外擴增及鑒定［J］.中國腫瘤生物治療雜志，1997，4(4)：302-306.

［6］Yao Q，Doan LX，Zhang R，et al.Thymosin-α1 modulates dendritic cell differentiation and functional maturation from human peripheral blood CD14+monocytes［J］.Immun Lett，2007，110(2)：110-120.

［7］Rasi G，Silecchhia G，Sinabaldi-Vallebona P，et al.Antitumor effect of combined treatment with thymosin alpha 1 and interleukin-2 after 5-fluorouracil in liver metastases from colorectal caner in rats［J］.Int J Cancer，1994，57(5)：701-705.

［8］張興虎，黃方，萬文輝，等.老年人外周血樹突狀細胞的體外培養(yǎng)及功能研究［J］.實用老年醫(yī)學(xué)，2009，23(4)：270-272.