張靈 馮美江

帕金森病(PD)是老年人最常見的疾病之一。PD是一種慢性進行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以黑質致密部多巴胺能神經(jīng)元減少為其主要病理特征。隨著對PD發(fā)病機制研究的不斷深入，人們越來越認識到以小膠質細胞活化為主的免疫炎癥在PD發(fā)生及發(fā)展中的重要作用［1］。此外，近年來的研究表明，心肌梗死和神經(jīng)系統(tǒng)損傷后熱休克蛋白60(Hsp60)可從細胞內釋放到細胞外，通過免疫炎癥反應進一步加重神經(jīng)損傷［2］。本研究將初步探討Hsp60在6羥基多巴(6-OHDA)誘導的帕金森細胞模型中的定位表達變化及其可能意義。

1 材料和方法

1.1 細胞、試劑和儀器PC12(腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系)細胞由中國科學院上海細胞庫提供。6-OHDA、維生素C(VitC)、二甲基亞砜(DMSO)、DMEM高糖培養(yǎng)基(達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基)、胰蛋白酶購自Sigma公司。胎牛血清購自Gibco公司，抗-Hsp60抗體購自Santa Cruz公司。熒光二抗、煙酸己可堿(Hoechst，用以染核)、Bio二抗購自Jackson公司。熒光倒置顯微鏡為Leica公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：用含10%的胎牛血清、100 μg/ml青霉素/鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，隔天換液。待細胞進入對數(shù)生長期后，用0.25%的胰蛋白酶消化后，以2×105/ml密度接種于底面積25 cm2的培養(yǎng)瓶(15 ml/瓶)。

1.2.2 免疫印記(Western Blot)檢測：孵育24 h后，實驗組和對照組分別加入含0.2%VitC的6-OHDA溶液(終濃度為100 μmol/L)和0.2%VitC溶液(終濃度為0.002%)，分別繼續(xù)孵育3 h、6 h、12 h、24 h、48 h后吸去培養(yǎng)液，加入細胞裂解液裂解細胞，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后轉至硝酸纖維素膜上，經(jīng)與抗-Hsp60抗體(稀釋濃度為1∶500)和相應的二抗(稀釋濃度為1∶1000)孵育，再用ECL試劑盒顯示蛋白。各時間點收取的培養(yǎng)液上清離心后同上步驟孵育完一抗，后加生物素二抗放大，用ECL試劑盒顯示蛋白。

1.2.3 細胞免疫熒光：將PC12細胞接種到放有小圓片的24孔板，孵育24 h后，實驗組和正常對照組分別加入含0.2%VitC的6-OHDA溶液(終濃度為100 μmol/L)和0.2%VitC溶液(終濃度為0.002%)，分別繼續(xù)孵育3 h、6 h、12 h、24 h、48 h后吸去培養(yǎng)液，細胞多聚甲醛固定，10%驢血清封閉后與抗-Hsp60抗體(稀釋濃度為1∶100)和相應的二抗(稀釋濃度為1∶1000)及Hoechst(稀釋濃度為1∶800)孵育，用熒光倒置顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，各實驗組間比較用單因素方差分析(one way ANOVA)，每組數(shù)據(jù)來自至少3次重復實驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PC12細胞蛋白表達變化隨著6-OHDA作用時間延長，Hsp60在PC12細胞中的表達呈現(xiàn)降低的趨勢，24 h和48 h時間點的蛋白表達與正常對照組相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 Hsp60在PC12細胞中的表達水平

2.2 細胞免疫熒光結果細胞免疫熒光顯示，Hsp60在正常PC12細胞的胞漿中表達，模型組的PC12在6-OHDA作用下胞體逐漸變小、皺縮，胞核不均勻高亮染色。Hsp60表達信號成環(huán)形并且相對于正常對照組有明顯減少趨勢，這與細胞蛋白的表達結果一致，見圖2。

圖2 細胞免疫熒光檢測Hsp60在PC12細胞胞漿中表達水平

2.3 培養(yǎng)上清液中Hsp60表達變化Hsp60在正常對照組的培養(yǎng)上清液中檢測不到表達信號，而在模型組則可明確檢測到表達信號，并且隨著時間延長呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，24 h和48 h時間點的Hsp60表達與3 h時間點的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖3。

圖3 培養(yǎng)上清液中Hsp60蛋白表達水平

3 討論

PD是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性病，在≥65歲的人群中發(fā)病率約為1.7%。PD主要表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強直、運動遲緩、姿勢步態(tài)異常等，嚴重影響老年人生活質量。但因PD發(fā)病機制尚不明確，目前臨床上針對該病主要是對癥治療［3-4］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PD黑質多巴胺能神經(jīng)元的減少往往伴隨著小膠質細胞的持續(xù)活化［5］。多巴胺能神經(jīng)元損傷可釋放損傷因子，某些損傷因子在胞外可以與小膠質細胞表面受體結合從而活化小膠質細胞。目前認為，以小膠質細胞活化為主要特征的免疫炎癥反應在PD的發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮至關重要的作用［6-7］。

熱休克蛋白(Hsps)是一種應激蛋白，Hsp60是Hsps家族中的重要一員。最初研究認為，Hsp60作為線粒體蛋白主要表達在胞漿［8］。近年來，Hsp60的細胞外作用已引起高度重視并成為研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)，心衰時Hsp60可轉位到胞膜［9］，細胞外的Hsp60可通過活化Toll樣受體4(TLR-4)介導心肌細胞的凋亡［10］。Hsp60還可被瀕死細胞和壞死細胞釋放到胞外，作為損傷信號發(fā)揮胞外作用［11］。腫瘤細胞也可分泌Hsp60從而發(fā)揮胞外作用［12］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，損傷的神經(jīng)元可釋放Hsp60到胞外，細胞外的Hsp60可通過TLR-4-Myd88信號通路活化小膠質細胞［2］，從而引發(fā)免疫炎癥反應。在PD，小膠質細胞持續(xù)過度活化可產生大量炎癥因子，如TNF-α、IL-1、IL-6和iNOS［13-15］。這些炎癥因子可能通過氧化應激和引發(fā)凋亡級聯(lián)反應進一步加重神經(jīng)元的損害［16］。

本研究表明，6-OHDA作用24 h和48 h后，PC12細胞內Hsp60的表達與正常對照組相比明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而培養(yǎng)上清液中可明確檢測到Hsp60表達，且隨時間延長而表達逐漸增多。我們的研究結果有力地證實了Hsp60在PD細胞模型中可被釋放到胞外。我們推測，釋放到細胞外的Hsp60可能通過某種機制參與活化小膠質細胞并導致多巴胺能神經(jīng)元的進一步損傷，從而參與PD的發(fā)生與發(fā)展。

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