左思 楊偉萍 韋長元 葉新青

乳腺癌是全身性疾病，其死亡主要原因是浸潤播散和遠處轉移，而轉移的主要途徑為淋巴結轉移。前哨淋巴結為區(qū)域淋巴引流中最先遭遇腫瘤細胞并最先發(fā)生轉移的第一站淋巴結，其病理學結果能準確預測腋窩淋巴結的轉移狀態(tài)，但對于直徑＜2 mm的微小轉移灶常規(guī)病理HE染色難以檢出，致前哨淋巴結活檢(SLNB)結果假陰性而漏診。本實驗應用免疫組化SP法檢測細胞角蛋白19(cytokerantin-19，CK19)和人乳腺球蛋白(human mammaglobin，hMAM)在乳腺癌陰性前哨淋巴結中的表達情況，討論兩者表達差異及與臨床病理因素的關系，為臨床提供治療依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院2009年2月至2010年2月臨床及病理資料齊全的60例乳腺癌患者，前哨淋巴結活檢均未發(fā)現轉移的蠟塊為研究標本?；颊呔鶠榕?，臨床檢查均無腋窩淋巴結腫大，年齡27～75歲，平均(50.38±11.24)歲，美藍染色法檢出35例，美藍染色聯合同位素示蹤法檢出25例。臨床TNM分期均為T1～T2 N0M0，其中T1期34例，T2期26例。外上象限26例，外下象限15例，內上象限11例，內下象限8例。病理類型浸潤性導管癌52例，浸潤性小葉癌5例，黏液腺癌3例。分子分型Luminal A型23例，Luminal B型13例，HER2過表達型15例，Basal-like型6例和正常乳腺樣型3例。所有患者術前均未經放療、化療或內分泌治療。

1.2 CK19和hMAM檢測方法每個石蠟標本連續(xù)切片3張，每張厚4 μm，切片間隔20～25 μm。采用免疫組化SP法，CK19、hMAM試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司，操作步驟按試劑盒說明書進行，每批染色用已知陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 染色標準CK19表達于胞漿，每張乳腺癌前哨淋巴結切片胞漿中未出現棕黃色顆粒計為陰性，胞漿中出現棕黃色顆粒計為陽性。hMAM表達于胞漿，陽性細胞數和染色程度乘積進行評分劃分等級，染色強度評分0分為無色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。陽性細胞所占百分比＜25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，＞75%為4分，兩者相乘0分為(-)，1～3分為(+)，4～6分為(++)，8～12分為(+++)。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。統(tǒng)計分析采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

60例乳腺癌陰性前哨淋巴結CK19和hMAM檢測結果，hMAM表達2例，陽性檢出率為3.3%。CK19除了hMAM陽性2例外，另外檢出6例，陽性檢出率為13.3%。hMAM表達2例，1例(+)，1例(++)，CK19表達8例。經單因素分析，CK19表達與腫瘤T分期有關(P＜0.05)，與患者的年齡、月經狀況、定位方法、腫瘤位置、病理類型、雌激素受體(ER)表達、孕激素受體(PR)表達、CerbB-2表達、Ki-67表達和分子分型均無相關(P＞0.05);hMAM表達與以上臨床病理因素均無相關(P＞0.05)。見表1。

表1 乳腺癌患者陰性前哨淋巴結中CK19和hMAM的表達及與臨床病理因素的關系(n，%)

3 討論

前哨淋巴結是乳腺癌發(fā)生轉移的第一站淋巴結，它的組織學特征能準確預測腋窩淋巴結是否有轉移，現認為乳腺癌SLNB陰性，則無需行腋窩淋巴結清掃(ALND)，對腋窩淋巴結陰性的乳腺癌患者行ALND，并不能提高其總體生存率和延長無病生存期［1］。這對乳腺癌患者來說可以減小手術創(chuàng)傷、促進術后上肢功能恢復并提高術后生活質量。同時，若對無腋窩淋巴結轉移的患者行ALND，破壞腋窩淋巴結的免疫屏障作用，更易于隱藏的癌灶向遠處轉移［2］。所以前哨淋巴結病理檢查結果至關重要。但常規(guī)病理學檢測前哨淋巴結陰性尚不能認為腋窩淋巴結無轉移，因為常規(guī)病理HE染色對直徑＜2 mm微小轉移灶較難檢出，有研究報道常規(guī)病檢前哨淋巴結陰性患者，5年內仍有30%出現復發(fā)、轉移［3］。這可能是前哨淋巴結早期出現微轉移，常規(guī)病檢呈假陰性而漏診所致。統(tǒng)計發(fā)現，連續(xù)或多層切片HE染色、免疫組化、RT-PCR檢測均可顯著提高前哨淋巴結敏感性，而RT-PCR檢測敏感性更高，并且少量切片即可診斷微轉移，前兩者聯合可使微轉移檢出率提高9%～47%［4-5］。連續(xù)切片工作煩瑣和費時，在臨床應用難以開展。本實驗標本為蠟塊，所以采用免疫組化對陰性前哨淋巴結進行檢測，以提高微轉移檢出率。

CK19和hMAM均在正常乳腺細胞和乳腺癌細胞中表達，而在間葉組織來源的淋巴結、外周血、骨髓等中不表達，因此可以作為乳腺癌的良好標志物來進行微轉移灶的檢測［6-7］。CK19是乳腺癌淋巴結隱匿轉移癌檢測的可靠基因標志之一，在上皮性腫瘤患者的前哨淋巴結中檢測到CK19的表達，即表明有播散的腫瘤細胞的存在。張濤等［8］報道用CK19前哨淋巴結微轉移檢出率約64.7%，且微轉移與腫瘤大小、CerbB-2等因素表達相關。本實驗采用免疫組化方法對60例乳腺癌陰性前哨淋巴結行CK19和hMAM檢測。本實驗中CK19微轉移檢出率為13.3%(8/60)，從表1中得知，經單因素分析CK19的表達僅與T分期即乳腺腫瘤的大小相關，與其他臨床病理因素均不相關，本實驗的研究對象為臨床檢查無腋窩淋巴結腫大的早期乳腺癌患者，均處于T1～T2 N0M0，同樣證實腫瘤大小與微轉移相關，這也符合腫瘤的侵襲轉移特性隨著瘤體積增大而增強，臨床分期越晚，遠處轉移率越高的規(guī)律，所以腫瘤的大小可用作評估該類患者微轉移的風險指標。所以當乳腺癌腫瘤直徑＞2 cm時，應注意陰性前哨淋巴結微轉移情況。

CerbB-2基因是在乳腺癌中增殖表達的原癌基因，已證實在乳腺癌中CerbB-2的高表達可表現出較強的侵襲性，也提示有較高的轉移潛能，所以這類患者腫瘤惡性程度高且易出現復發(fā)和轉移。但本研究中微轉移與CerbB-2的表達無相關，這可能和本研究中Luminal B型及HER2過表達型例數較多、CerbB-2表達比例較高有關。國內學者從乳腺癌患者骨髓和外周血中檢測CK19等微轉移，同樣發(fā)現乳腺癌微轉移與腫瘤大小及臨床分期等臨床病理因素相關［9-10］。所以檢測前哨淋巴結中CK19可發(fā)現更早期微轉移病灶，如聯合外周血或骨髓中微轉移檢測，將會更好地早期發(fā)現微轉移。

William等［11］檢測了HE染色陰性的淋巴結中hMAM陽性表達率為33%(112/344)，且hMAM的陽性表達與組織學分級分期、St.Gallen危險度均呈正相關(P值分別0.0255與0.022)。本實驗結果hMAM的檢出率為3.33%(2/60)，表達強度(+)～(++)，且表達與以上臨床病理因素均不相關。在本試驗中hMAM這一指標檢出率低，表達強度偏低，與William的結果差距較大，可能與本組中的病例數偏少和標本有關。由于本研究的標本為蠟塊而非新鮮組織，并且前哨淋巴結于術中均接受快速冰凍病理檢查，冰凍剩余組經常規(guī)處理接受常規(guī)HE染色，由于兩次檢測需獲得最大平面，致使剩余組織量明顯減少，并且每個蠟塊僅切片3張，也是本實驗陽性檢測較少的原因。所以hMAM用于陰性前哨淋巴結微轉移檢測的靈敏度可能需要大樣本實驗才能明確。

Cox等［12］回顧分析2408例乳腺癌患者，發(fā)現微轉移后具有重要的預后意義。總之，快速正確地診斷前哨淋巴結微轉移，對乳腺癌患者手術方式，術后治療、預后生存等均至關重要。雖然本試驗樣本例數較少，但仍能檢測到微轉移的存在，所以開展常規(guī)病檢陰性前哨淋巴結微轉移檢測有較好的臨床應用意義。

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