焦蒙麗，曹蓉蓉，陳紅艷，郝文芳，董娟娥

西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100

植物次生代謝物因具有獨(dú)特的性質(zhì)而作為藥品、食品添加劑、香料以及其他工業(yè)生產(chǎn)等方面的原料[1]。目前，多采用組織培養(yǎng)調(diào)控的方法來提高目標(biāo)次生代謝物的產(chǎn)量。調(diào)控的方式有多種，如：加速生成目標(biāo)化合物的化學(xué)合成速度、添加誘導(dǎo)子處理、非生物脅迫等[2]。常采用的方法是向高產(chǎn)細(xì)胞系中添加誘導(dǎo)子以提高目標(biāo)次生代謝物的合成積累量[3]。

水楊酸 (Salicylic acid，SA) 是植物體內(nèi)的一種信號(hào)分子，對(duì)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和防御反應(yīng)均具有關(guān)鍵的調(diào)控作用[4-6]。SA主要是通過參與植物體內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控植物次生代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性，從而影響植物次生代謝物合成積累量的變化[7]。苯丙氨酸解氨酶 (Phenylanine ammonia-lyase，PAL) 是位于初生代謝和次生代謝分支處的關(guān)鍵酶[8]，催化植物體內(nèi)多種具有防御功能化合物的形成[1,9-10]，也是合成迷迭香酸(Rosmarinic acid，RA) 分子結(jié)構(gòu)上咖啡?；年P(guān)鍵酶[11-12]。酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (Tyrosine aminotransferase，TAT) 是酪氨酸衍生的植物次生代謝途徑中的限速酶，是合成RA分子結(jié)構(gòu)上4-羥基苯乳酸的關(guān)鍵酶[12-13]。有研究表明，利用SA誘導(dǎo)子誘導(dǎo)后，在植物次生代謝物含量增加的同時(shí)，相應(yīng)的PAL活性也有所上升。如利用一定濃度的SA處理成熟的葡萄，提高了葡萄中總酚的含量，且細(xì)胞中PAL的活性與總酚含量的變化呈正相關(guān)[14]。TAT的活性可以被L-α-aminooxyβ-phenyl-propionic acid (AOPP) 競(jìng)爭(zhēng)性抑制[15]。但目前還不清楚SA誘導(dǎo)是否影響TAT的活性及迷迭香酸的合成積累量。

本研究以丹參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為材料，經(jīng) SA誘導(dǎo)，并利用TAT競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑AOPP處理，考察PAL和TAT的活性變化與迷迭香酸合成積累的關(guān)系，擬從酶學(xué)角度闡明SA誘導(dǎo)植物細(xì)胞合成次生代謝物的作用機(jī)制，為進(jìn)一步利用丹參培養(yǎng)細(xì)胞定向生產(chǎn)RA提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 愈傷組織誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)

將新鮮的丹參種子 (來源于陜西商洛丹參GAP藥源基地) 消毒處理后，在無菌條件下接種于含30 g/L蔗糖、5.5 g/L瓊脂、pH 5.8的MS固體培養(yǎng)基上。在溫度為 (25±2) ℃、光照時(shí)間為12~16 h、光照強(qiáng)度為2 000~3 000 Lx的條件下培養(yǎng)，2個(gè)月后生長(zhǎng)出無菌苗。

將無菌苗上生長(zhǎng)健壯的葉片剪成 0.5 cm× 0.5 cm大小的外植體，接種于MS固體培養(yǎng)基上(含 1.0 mg/L NAA、1.0 mg/L 6-BA、1.0 mg/L 2,4-D)。1個(gè)月后誘導(dǎo)出愈傷組織，每隔20 d繼代培養(yǎng)1次，直到培養(yǎng)細(xì)胞性狀穩(wěn)定。培養(yǎng)條件同上。

1.2 誘導(dǎo)子和抑制劑處理

將繼代培養(yǎng)3次性狀穩(wěn)定的愈傷組織再次繼代培養(yǎng)12 d，轉(zhuǎn)接到含25 mL MS液體培養(yǎng)基 (無生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和瓊脂) 的50 mL的三角瓶中，在轉(zhuǎn)速為125 r/min、溫度為25 ℃的條件下黑暗懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)6 d后，在生長(zhǎng)狀況一致的培養(yǎng)細(xì)胞中分別用誘導(dǎo)子 (SA) 和抑制劑 (AOPP) 處理。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別在處理后的1、4、6、8、24 h收獲培養(yǎng)物進(jìn)行次生代謝物含量和酶活性檢測(cè)。

1.3 酶活性檢測(cè)

1.3.1 PAL活性的測(cè)定

取新鮮的細(xì)胞，用蒸餾水將材料表面沖洗干凈后，快速用吸水紙吸干表面水分。稱取 1.0 g材料放入預(yù)冷的研缽中，加入5 mL 4 ℃下預(yù)冷的提取介質(zhì) (50 mmol/L硼酸緩沖液、5.0 mmol/L巰基乙醇、1.0 mmol/L EDTA-Na2、5%甘油、5% PVP，pH 8.8)，冰浴下迅速研磨勻漿后，定容至8 mL。4 ℃、10 000 r/min離心15 min，上清液用于酶活性測(cè)定[16]。酶的檢測(cè)體系包括：酶液0.5 mL、硼酸緩沖液 (pH 8.8) 2 mL、L-苯丙氨酸 (0.02 mol/L) 1 mL和蒸餾水1 mL。將酶的檢測(cè)體系于37 ℃水浴中保溫60 min后加入0.2 mL的6 mmol/L HCl終止反應(yīng)。在290 nm下測(cè)定吸光度，以每分鐘OD值變化0.01為1個(gè)酶活單位 (U)。酶活性按以下公式計(jì)算：

式中，Vt為提取粗酶液總體積 (mL)，v為反應(yīng)液總體積 (mL)，Vs為測(cè)定時(shí)取用粗酶液體積(mL)，F(xiàn)W為樣品鮮重 (g)，t為反應(yīng)時(shí)間 (h)。

1.3.2 TAT活性的測(cè)定

取新鮮細(xì)胞，用蒸餾水將材料表面沖洗干凈后，快速用吸水紙吸干表面水分。稱取0.5 g材料放入預(yù)冷的研缽中，加入3 mL 4 ℃下預(yù)冷的提取介質(zhì) (0.1 mol/L磷酸緩沖液、0.1 mmol/L的EDTA、80 mmol/L的α-酮戊二酸、0.2 mmol/L的VB6和1 mmol/L的DTT，pH 7.3)，冰浴下迅速研磨勻漿后，定容至5 mL。4 ℃、10 000 r/min離心15 min，保留上清液，用于酶活性檢測(cè)[16]。酶活性的測(cè)定體系包括：酶液0.5 mL、0.2 mol/L磷酸緩沖液 (pH 7.6) 3 mL、17 mmol/L的α-酮戊二酸0.2 mL、88 mmol/L酪氨酸0.2 mL、0.2 mmol/L的VB60.1 mL。將檢測(cè)體系于37 ℃水浴中保溫30 min后加入0.5 mL 10 mmol/L的NaOH，繼續(xù)在37 ℃條件下水浴30 min。反應(yīng)液于331 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值，以每分鐘OD值變化0.01為一個(gè)酶活單位 (U)。

式中，Vt為提取粗酶液總體積 (mL)，v為反應(yīng)液總體積 (mL)，Vs為測(cè)定時(shí)取用粗酶液體積(mL)，F(xiàn)W為樣品鮮重 (g)，t為反應(yīng)時(shí)間 (h)。

1.4 RA含量檢測(cè)

采用超聲波提取法提取RA[17]。精密稱取在47 ℃下真空干燥的丹參細(xì)胞培養(yǎng)物干粉0.05 g，加入 70%甲醇水溶液 1 mL，用超聲波提取45 min，8 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾，待檢測(cè)。

色譜條件：色譜柱：WondaSil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水-磷酸 (35∶65∶0.1，V/V/V)，流動(dòng)相使用前進(jìn)行過濾和脫氣處理；檢測(cè)波長(zhǎng)：285 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

式中：C為樣品中迷迭香酸的含量 (mg/g，DW)；x為樣品的峰面積；0.05為樣品的干重 (g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SA對(duì)丹參培養(yǎng)細(xì)胞中RA積累量的影響

不同濃度的SA (6.25、12.5和25.0 mg/L) 誘導(dǎo)后丹參培養(yǎng)細(xì)胞中 RA的含量變化如圖 1所示。濃度為6.25 mg/L的處理組，在SA誘導(dǎo)8 h時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞中 RA的積累量達(dá)到峰值(5.914 mg/g DW)，隨后RA的積累量有所減少，但仍略高于對(duì)照組。濃度為12.5 mg/L的處理組，在SA誘導(dǎo)4 h后，培養(yǎng)細(xì)胞中RA的積累量明顯增高，在誘導(dǎo) 24 h時(shí)達(dá)到峰值 (6.113 mg/g DW)。濃度為25 mg/L的處理組，在SA誘導(dǎo)6 h時(shí)，RA 積累量明顯增高，24 h達(dá)到峰值(5.227 mg/g DW)?？傮w來看，6.25 mg/L的SA可在較短的時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)丹參培養(yǎng)細(xì)胞合成較多的 RA，且對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒有造成傷害 (數(shù)據(jù)未顯示)。因此，在后續(xù)的試驗(yàn)中均以6.25 mg/L的SA作為誘導(dǎo)子。

圖1 不同濃度SA對(duì)丹參細(xì)胞中RA積累量的影響Fig. 1 Effects of SA in different concentrations on the accumulation of RA in S. miltiorrhiza cell cultures.

2.2 AOPP對(duì)丹參培養(yǎng)細(xì)胞中RA積累量的影響

AOPP對(duì)丹參培養(yǎng)細(xì)胞中RA積累量的影響如圖2所示。用濃度為0.1 μmol/L的AOPP處理丹參培養(yǎng)細(xì)胞4 h時(shí)，與對(duì)照相比，細(xì)胞中RA的合成積累量有所下降；處理6 h時(shí)，RA的積累量明顯下降 (僅為SA單獨(dú)處理的76%)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制效果。處理24 h時(shí)，AOPP對(duì)RA合成的抑制作用逐漸解除，此時(shí)RA的積累量與對(duì)照組和SA誘導(dǎo)組無顯著差異。

2.3 AOPP與 SA共處理對(duì)丹參培養(yǎng)細(xì)胞中RA積累量的影響

AOPP和SA共處理對(duì)丹參細(xì)胞中RA積累量的影響如圖3所示。0.1 μmol/L的AOPP處理1 h后再利用6.25 mg/L的SA誘導(dǎo)，誘導(dǎo)1~6 h時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，AOPP抑制組RA的積累量逐漸降低，SA誘導(dǎo)組和共處理組(AOPP+SA) 培養(yǎng)細(xì)胞中 RA的積累量逐漸升高；處理24 h時(shí)，AOPP處理組的RA積累量與對(duì)照無顯著差異，而共處理組的RA積累量顯著高于SA誘導(dǎo)組和AOPP單獨(dú)處理組。

圖2 AOPP對(duì)丹參細(xì)胞中RA積累量的影響Fig. 2 Effects of AOPP on the accumulation of RA in S. miltiorrhiza cell cultures.

圖3 AOPP和SA共處理對(duì)丹參細(xì)胞中RA積累量的影響Fig. 3 Effects of AOPP and SA on the accumulation of RA in S. miltiorrhiza cell culture.

2.4 SA對(duì)PAL和TAT活性的影響

利用不同濃度的SA (6.25、12.5和25 mg/L)誘導(dǎo)子處理丹參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞中 TAT和PAL的活性變化如圖4所示。SA誘導(dǎo)后，濃度最低的6.25 mg/L處理組培養(yǎng)細(xì)胞中TAT (圖4A)和PAL (圖4B) 的活性分別在1 h和4 h出現(xiàn)峰值；誘導(dǎo)濃度為12.5 mg/L時(shí)，TAT和PAL的活性分別在4 h和24 h出現(xiàn)峰值；誘導(dǎo)濃度為25 mg/L時(shí)，TAT和PAL分別在4 h和8 h出現(xiàn)最高值?？梢钥闯觯谶x定的范圍內(nèi)，SA的濃度越低，誘導(dǎo)酶活性的峰值出現(xiàn)得越早。

2.5 AOPP對(duì)PAL和TAT活性的影響

圖5為AOPP對(duì)丹參培養(yǎng)細(xì)胞中PAL和TAT活性的影響。從圖5A可見，濃度為0.1 μmol/L的AOPP處理1 h后，對(duì)TAT的抑制效果明顯；處理4 h后，AOPP對(duì)TAT的抑制作用逐漸解除；處理6 h后，AOPP對(duì)TAT的抑制作用完全解除；處理24 h后的TAT活性與對(duì)照組無顯著差異。

圖4 不同濃度SA對(duì)丹參細(xì)胞中TAT (A) 和PAL (B) 活性的影響Fig. 4 Time course of TAT (A) and PAL (B) activities after SA treatment.

圖5 0.1 μmol/LAOPP對(duì)丹參細(xì)胞中TAT (A) 和PAL (B) 活性的影響Fig. 5 Time course of TAT (A) and PAL (B) activities after 0.1 μmol/L AOPP treatment.

從圖5B可見，0.1 μmol/L的AOPP處理1 h后，丹參培養(yǎng)細(xì)胞中PAL的活性開始下降；處理6 h時(shí)，PAL的活性下降至最低，為對(duì)照的44%；處理24 h時(shí)，PAL的活性與對(duì)照組無顯著差異，說明AOPP對(duì)PAL的抑制作用直到24 h后才能解除。

2.6 AOPP與SA誘導(dǎo)子共處理對(duì)酶活性的影響

圖6為用0.1 μmol/L的AOPP預(yù)先對(duì)丹參培養(yǎng)細(xì)胞處理1 h后，再添加6.25 mg/L的SA處理對(duì)TAT (圖6A) 和PAL (圖6B) 活性的影響。如圖6A所示，在共處理1 h后，丹參培養(yǎng)細(xì)胞TAT的活性顯著低于SA誘導(dǎo)組和對(duì)照組，但顯著高于AOPP單獨(dú)處理組；共處理4 h時(shí)，TAT活性與對(duì)照組無顯著差異，但顯著高于SA誘導(dǎo)組和AOPP單獨(dú)處理組；共處理6 h后，TAT活性顯著高于SA誘導(dǎo)組，但低于AOPP單獨(dú)處理組和對(duì)照組。

由圖6B可見，在1 h時(shí)，SA單獨(dú)處理、AOPP單獨(dú)處理、AOPP和SA共處理后的丹參培養(yǎng)細(xì)胞中PAL的活性均顯著低于對(duì)照組；在4 h時(shí)，SA處理顯著提高了PAL的活性，AOPP處理顯著抑制了PAL的活性；6 h時(shí)，AOPP處理后的PAL活性降到最低。處理6 h時(shí)AOPP對(duì)PAL的抑制效果最強(qiáng)，導(dǎo)致共處理后的PAL活性顯著低于對(duì)照；24 h時(shí)，隨著AOPP對(duì)PAL活性抑制作用的解除，SA和AOPP共處理組的PAL的活性也顯著升高，并高于對(duì)照組。

圖6 AOPP與SA共處理對(duì)丹參細(xì)胞TAT (A) 和PAL (B) 活性的影響Fig. 6 Time course of TAT (A) and PAL (B) activities after co-treatment of SA and AOPP.

3 討論

研究證明，水楊酸 (SA) 作為誘導(dǎo)子可誘導(dǎo)多種植物次生代謝物合成積累量的增加[1,14,18-19]。一定濃度的水楊酸誘導(dǎo)子可以通過改變植物次生代謝物合成途徑中關(guān)鍵酶的活性來提高次生代謝物的合成積累量[7,14]。本研究中，6.25~25.0 mg/L的SA均可誘導(dǎo)丹參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中迷迭香酸 (RA) 積累量的增加，但低濃度(6.25~12.5 mg/L) SA誘導(dǎo)的RA積累量較高，誘導(dǎo)達(dá)到峰值所需要的時(shí)間也較短，說明水楊酸對(duì)迷迭香酸的誘導(dǎo)具有最佳濃度型的特征。進(jìn)一步從酶學(xué)角度分析，植物體中的迷迭香酸主要由苯丙氨酸代謝途徑衍生的咖啡酸和酪氨酸代謝途徑衍生的 4-羥基苯乳酸經(jīng)過迷迭香酸合成酶縮合而成，苯丙氨酸解氨酶 (PAL) 和酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (TAT) 分別為這兩條代謝途徑上的關(guān)鍵酶[12,20]。通過考察 SA誘導(dǎo)子、TAT的抑制劑(AOPP)、SA和AOPP共處理后丹參培養(yǎng)細(xì)胞中PAL和TAT的活性變化和相應(yīng)RA積累量的變化發(fā)現(xiàn)，添加6.25 mg/L的SA誘導(dǎo)后，在RA大量積累的前期，PAL和TAT的活性在處理后4 h時(shí)均顯著提高；處理后的6~24 h，PAL的活性均顯著高于對(duì)照，但 TAT的活性逐漸顯著低于對(duì)照。進(jìn)一步用AOPP處理發(fā)現(xiàn)，在RA積累量減少的同時(shí)，PAL和TAT的活性均有所降低；AOPP對(duì)TAT活性的抑制作用在6 h后就可以解除，但對(duì)PAL活性的抑制作用在24 h才可解除。以上結(jié)果說明，在丹參培養(yǎng)細(xì)胞中，AOPP在作為TAT競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的同時(shí)也可以作為PAL的抑制劑，與對(duì)鷹嘴豆[22]和草莓[23]的研究結(jié)果一致。此外，研究發(fā)現(xiàn)AOPP對(duì)丹參培養(yǎng)細(xì)胞TAT的抑制作用沒有對(duì) PAL的敏感。這一結(jié)果與對(duì)綠豆[15]和彩葉草Coleus blumei[21]的研究一致，AOPP沒有對(duì)綠豆中的 TAT起到明顯的抑制作用[15]，對(duì)彩葉草 TAT活性的抑制作用也不敏感[21]。其主要原因可能是由于TAT具有植物種屬特異性[15]。

當(dāng)用AOPP和SA共同處理丹參培養(yǎng)細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，共處理組的細(xì)胞中RA的積累量比單獨(dú)使用SA處理組的低，但比單獨(dú)使用AOPP處理組的高。同時(shí)，PAL的活性與RA的含量之間表現(xiàn)出明顯的正相關(guān)性。由此推測(cè)，在丹參培養(yǎng)細(xì)胞RA的生物合成過程中，PAL的酶促作用比TAT的明顯。這一結(jié)果與對(duì)紫草 Lithospermum erythrorhizon的研究結(jié)果相吻合[11,13]。在用酵母誘導(dǎo)子誘導(dǎo)紫草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，誘導(dǎo)后 PAL活性的增加與RA積累量成正相關(guān)[11]；以茉莉酸甲酯為誘導(dǎo)子誘導(dǎo)紫草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，PAL的活性在RA積累量增加之前也相應(yīng)地表現(xiàn)出增高的趨勢(shì)[13]。迄今為止，龐大的次生代謝合成途徑中仍有許許多多的謎團(tuán)尚未解開，對(duì)代謝途徑的影響因素非常龐雜，究竟哪種酶在丹參RA代謝途徑起到更為關(guān)鍵的作用，仍需要進(jìn)一步運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)的手段進(jìn)行更深層次探討。

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