施和平，王云靈，曾寶強，陳利華

1 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室，廣東 廣州 510631

2 香港教育學(xué)院科學(xué)與環(huán)境學(xué)系，香港 新界

鎘 (Cd) 雖不是植物生長必需的微量元素，但由于其移動性強、被植物吸收利用和累積后，不僅可影響植物的產(chǎn)量和品質(zhì)，導(dǎo)致植物生長被抑制或產(chǎn)生毒害；而且也易通過食物鏈進(jìn)入人和動物體內(nèi)富集來危及人和動物健康，是目前土壤和水體環(huán)境中最受關(guān)注的、毒性最強的重金屬元素之一，而且Cd污染問題已成為威脅土壤生態(tài)安全和制約農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個重要因素[1]。因而，如何治理和控制重金屬Cd污染，尋找降低Cd毒害或修復(fù)被Cd污染環(huán)境的有效方法，一直是國內(nèi)外環(huán)境科學(xué)研究的熱點與難點。根既是植物吸收礦質(zhì)離子的最主要器官，也是鎘最直接、最嚴(yán)重的受害器官之一。有研究表明，利用植物尤其是重金屬蓄積植物的根系對土壤和水體中某種重金屬污染元素具有特殊的吸收富集和轉(zhuǎn)化能力，不失為治理重金屬污染，實現(xiàn)生態(tài)修復(fù)的高效而廉價的有效方法之一[2]。與對照根(自然根) 相比，由發(fā)根農(nóng)桿菌 Agrobacterium rhizogenes感染植物細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的毛狀根，由于具有產(chǎn)生分枝側(cè)根能力很強、可快速自主生長，根系極發(fā)達(dá)及具有很大的吸收面積；近年相繼有人利用可離體自主快速生長的毛狀根來吸收重金屬離子Ni和Cd[3]，或根濾重金屬鈾以修復(fù)被放射性金屬元素鈾污染的環(huán)境[4]，以及利用毛狀根迅速吸收和轉(zhuǎn)化廢水中的2,4-D等污染物[5]。但到目前為止，國內(nèi)外少見利用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的毛狀根或其再生植株來開展對重金屬污染物修復(fù)的更多研究報道。南美蟛蜞菊Wedelia trilobata (L.) A.S.Hitche是華南地區(qū)常見的用作園林綠化的耐陰地被植物和護(hù)坡植物，并具有較強的對有害金屬元素的吸附積累作用[6]，但因其植物根系不發(fā)達(dá)，目前仍未見大量利用該植物進(jìn)行環(huán)境修復(fù)的研究報道。我們曾用發(fā)根農(nóng)桿菌獲得了可自主生長的南美蟛蜞菊毛狀根[7]；而開展其毛狀根對重金屬鎘的吸收和鎘耐受能力的研究，是今后開發(fā)利用生長迅速，且根系發(fā)達(dá)的南美蟛蜞菊毛狀根系及其再生植株進(jìn)行重金屬鎘污染環(huán)境生物修復(fù)的前提。但至今為止，未見有關(guān)重金屬 Cd對南美蟛蜞菊毛狀根生長和毒害的影響及其對 Cd吸收的任何報道。

鈣 (Ca) 是植物生長發(fā)育必需的大量元素。已有研究表明，Ca可以與Cd競爭植物根系上吸收位點，降低植物含Cd量[8]；而外源Ca可以增強植物對許多非生物逆境的適應(yīng)性，減輕逆境對植物所造成的傷害[9]。但到目前為止，少見有關(guān)Cd和Ca結(jié)合對毛狀根生長或毒害影響的系統(tǒng)研究報道。

本研究以發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的可在無激素培養(yǎng)基上自主生長的南美蟛蜞菊毛狀根為材料，來探討重金屬Cd及其與Ca結(jié)合對南美蟛蜞菊毛狀根生長、抗氧化酶活性以及吸收 Cd影響的生理機理，旨在為今后開展利用生長迅速的具發(fā)達(dá)根系的南美蟛蜞菊毛狀根及其再生植株來凈化被重金屬Cd污染的水體和土壤環(huán)境奠定實驗技術(shù)基礎(chǔ)和提供可能性。

1 材料與方法

1.1 植物材料

采用由含農(nóng)桿堿型野生 Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834遺傳轉(zhuǎn)化南美蟛蜞菊葉片外植體所產(chǎn)生的、能在MS培養(yǎng)基上自主快速生長并已繼代培養(yǎng)的毛狀根，其誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)見歐少云等的方法[7]。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

在探討培養(yǎng)基中Cd濃度對南美蟛蜞菊毛狀根生長、抗氧化酶活性的影響時，采用添加不同濃度Cd (以CdCl2的形式加入) 的液體MS培養(yǎng)基，其中 Cd濃度分別為 0、10、50、100、300 μmol/L；而在探討Cd與Ca組合對南美蟛蜞菊毛狀根生長及酶活性的影響時，采用 200、300 μmol/L Cd和10、20、30 mmol/L Ca組合的MS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；在探討培養(yǎng)基中Cd濃度及其與 Ca組合對南美蟛蜞菊毛狀根吸收及吸附 Cd的影響時，分別采用 100 μmol/L或300 μmol/L Cd和10、20、30 mmol/L Ca組合的MS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。以上所有培養(yǎng)基在滅菌前pH值調(diào)至5.8~6.0，經(jīng)121 ℃高溫濕熱滅菌后待用。每250 mL錐形瓶中盛50 mL液體培養(yǎng)基，定量接種南美蟛蜞菊毛狀根后，將培養(yǎng)瓶置于搖床上，于 (25±2) ℃下振蕩培養(yǎng)。

1.3 Cd對南美蟛蜞菊毛狀根生長的影響

選取生長旺盛的南美蟛蜞菊毛狀根，剪切成4~5 cm且具根尖的根段，按定量接種法接入含有不同濃度Cd或Cd-Ca組合的液體MS培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)。每錐形瓶的接種量為0.2 g (FW)。在為期 25 d的培養(yǎng)過程中觀察毛狀根的生長變化并進(jìn)行生物量的測定。每隔5 d隨機抽取不同濃度處理的毛狀根培養(yǎng)物各3瓶，用自來水沖洗去培養(yǎng)物上的殘留液體培養(yǎng)基，然后再用蒸餾水沖洗并用吸水紙吸干水分后進(jìn)行毛狀根生物量(鮮重) 測量。將新鮮毛狀根培養(yǎng)物保存于-80 ℃的超低溫冰箱中，用于進(jìn)行毛狀根可溶性蛋白含量、POD、SOD活性和MDA含量的測定。

1.4 毛狀根可溶性蛋白含量、POD、SOD活性及MDA含量的測定

為了探討不同濃度Cd單獨及其與Ca組合對毛狀根過氧化物酶 (POD) 和超氧化物歧化酶(SOD) 及丙二醛 (MDA) 含量的影響，取毛狀根定量接種到僅添加 10、50、100 μmol/L或300 μmol/L Cd及200 μmol/L或300 μmol/L Cd與10~30 mmol/L CaCl2組合的液體MS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并分別在培養(yǎng)后5、10、15、20、25 d取樣進(jìn)行測定。其中，毛狀根培養(yǎng)物可溶性蛋白含量的測定參照Bradford的方法[10]，用考馬斯亮藍(lán)G-250進(jìn)行染色并用紫外分光光度法測定。培養(yǎng)過程中其 SOD活性變化的測定基本按照Beauchamp和 Fridovich的測定方法[11]，以抑制NBT光還原50%所需要的酶量為1個酶活性單位；其POD活性的測定按照張志良等的愈創(chuàng)木酚法進(jìn)行[12]，以制備酶提取液所用的磷酸緩沖液作空白對照，用每分鐘OD470變化值表示酶活性的大小，即以 OD470/(min·mg) 蛋白表示。MDA含量的測定按Heath和Packer的方法[13]。實驗重復(fù)測定3次，取平均值。

1.5 南美蟛蜞菊毛狀根Cd含量測定

南美蟛蜞菊毛狀根在培養(yǎng)2~3 d后，分別移入含100、300 μmol/L Cd 和 (或) 10、20、30 mmol/L CaCl2組合的液體培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)2 d、4 d和6 d后，取出毛狀根，用去離子水洗1遍后，再用約50 mL 20 mmol/L EDTA液洗2~3次，收集EDTA洗滌液，經(jīng)濃縮、常規(guī)消化后供測定毛狀根吸附的Cd含量用；殘余的培養(yǎng)基經(jīng)濾紙過濾后用去離子水定容至 50 mL ，經(jīng)常規(guī)消化后供測定培養(yǎng)基殘存的Cd含量用。毛狀根樣品置于60 ℃~70 ℃下烘干，精密稱取粉碎過的毛狀根樣品于 100 mL錐形瓶中，加混酸(VHNO3∶VHClO4=4∶1) 15 mL消化，電爐上加熱烘干后，1% HNO3定容，供測定毛狀根吸收的Cd含量。各樣品的Cd含量采用原子吸收分光光度計法測定。其測定條件為：波長228.8 nm，燈電流7 mA，狹縫寬度113 nm，干燥110 ℃，30 s，灰化500 ℃。實驗重復(fù)測定3次，取平均值。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析，采用LSD法進(jìn)行處理間的差異性比較 (P＜0.05)，采用Excell 2003進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬Cd單獨及其與Ca組合對南美蟛蜞菊毛狀根生長的影響

南美蟛蜞菊毛狀根接種至MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1~2 d后，可見從毛狀根根段開始產(chǎn)生新的白色側(cè)根，且根段不斷伸長。與對照相比，培養(yǎng)至10 d時，無論是低濃度還是高濃度Cd培養(yǎng)的毛狀根，其主、側(cè)根都變粗，根段表面從淺紅色變成紫紅色。其中，10~50 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根分支能力較強，根尖白色且健壯；而高濃度100~300 μmol/L Cd培養(yǎng)的南美蟛蜞菊毛狀根的主根很少伸長，側(cè)根數(shù)量少且短小，根尖開始發(fā)黃 (圖1, A-E)。隨著培養(yǎng)基中Cd濃度的升高和培養(yǎng)時間的延長，各濃度 Cd培養(yǎng)的南美蟛蜞菊毛狀根在培養(yǎng)后期時根尖都逐漸變黃，起始根段開始變綠，并逐漸老化；而高濃度100~300 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根根段開始發(fā)黑，呈現(xiàn)明顯的重金屬Cd毒害癥狀。

圖2為Cd濃度對南美蟛蜞菊毛狀根生長的影響。從圖2可見，對照 (不添加Cd的MS培養(yǎng)基) 毛狀根生物量 (鮮重) 在0~20 d的培養(yǎng)期內(nèi)，隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增加，至培養(yǎng)20 d時達(dá)到最大，其生物量增值倍數(shù)達(dá)到12.475；隨后毛狀根逐漸老化，生長速率下降。與對照相比，不同濃度Cd培養(yǎng)的毛狀根生物量在培養(yǎng)后5~10 d期間也逐漸增加，除高濃度300 μmol/L Cd外，≤100 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根生物量增殖倍數(shù)都與對照相當(dāng)或略高。但培養(yǎng)15 d后，除低濃度10 μmol/L Cd外，50~300 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根生物量增殖倍數(shù)都隨培養(yǎng)基Cd濃度的增加而逐漸下降，培養(yǎng)至 25 d時，高濃度300 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根鮮重增值倍數(shù)僅為同期對照毛狀根的40.69%。這表明高濃度Cd不僅抑制南美蟛蜞菊毛狀根的生長，而且會使毛狀根出現(xiàn)毒害癥狀。

圖1 重金屬鎘單獨及其與鈣組合對南美蟛蜞菊毛狀根生長形態(tài)的影響Fig. 1 Effect of Cd alone or in combination with calcium on the growth and morphology of hairy roots. (A-E) Hairy roots cultured for 10 days in medium with different concentration of Cd. (A) 0 μmol/L. (B) 10 μmol/L. (C) 50 μmol/L. (D) 100 μmol/L. (E) 300 μmol/L. (F-H) Hairy roots cultured for 20 days in medium with 200 μmol/L Cd and 10?30 mmol/L Ca. (F) 200 μmol/L Cd+10 mmol/L Ca. (G) 200 μmol/L Cd +20 mmol/L Ca. (H) 200 μmol/L Cd +30 mmol/L Ca.

圖3為200 μmol/L Cd 與10~30 mmol/L Ca組合對南美蟛蜞菊毛狀根生長的影響。與對照(僅添加200 μmol/L Cd培養(yǎng)的) 毛狀根相比，200 μmol/L Cd與10~30 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根鮮重增值倍數(shù)比對照顯著提高，其中以200 μmol/L Cd 與20 mmol/L Ca組合培養(yǎng)促進(jìn)毛狀根生長的效果最好，不僅毛狀根生長旺盛，而且分支側(cè)根更多；在毛狀根培養(yǎng)過程的各個時期，其鮮重增值倍數(shù)分別為對照的6.53倍、4.88倍、5.22倍、4.91倍和4.17倍；同時，與對照相比，培養(yǎng)5 d后，200 μmol/L Cd和10~30 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的南美蟛蜞菊毛狀根根表面也由淺紅色變成紫紅色，不僅根表面顏色比對照深；且其主、側(cè)根變得更粗而彎曲 (圖1，F(xiàn)，G，H)。而與對照 (僅添加300 μmol/L Cd培養(yǎng)的) 毛狀根相比，300 μmol/L Cd與10~30 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根根尖褐變程度和根生長受抑制程度明顯比對照輕，不僅毛狀根根系能產(chǎn)生較多的分枝側(cè)根，根生長形態(tài)正常，根尖褐化變慢；而且300 μmol/L Cd 與10~30 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根鮮重增殖倍數(shù)與 200 μmol/L Cd和10~30 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的趨勢相似，其根表面也呈現(xiàn)深紫紅色、根體增粗且部分彎曲。這表明，低濃度Cd對毛狀根生長的影響較小，甚至促進(jìn)生長；但高濃度Cd則抑制其生長，且濃度愈高抑制程度愈強，甚至產(chǎn)生毒害；但外源添加10~30 mmol/L Ca可緩解高濃度Cd對毛狀根生長的抑制和毒害。

2.2 Cd單獨及其與Ca組合對南美蟛蜞菊毛狀根可溶性蛋白含量的影響

圖2 Cd濃度對南美蟛蜞菊毛狀根生長的影響Fig. 2 Effect of Cd concentration in MS medium on the growth of W. trilobata hairy roots.

圖3 200 μmol/L Cd與10~30 mmol/L Ca組合對南美蟛蜞菊毛狀根生長的影響Fig. 3 Effect of 200 μmol/L Cd in combination with 10?30 mmol/L Ca on the growth of W. trilobata hairy roots.

圖4 Cd濃度對南美蟛蜞菊毛狀根可溶性蛋白含量的影響Fig. 4 Effect of Cd concentration on the soluble protein content in hairy roots of W. trilobata.

圖4為培養(yǎng)基Cd濃度對南美蟛蜞菊毛狀根可溶性蛋白含量的影響。從圖4可見，無論是對照還是不同濃度Cd培養(yǎng)的毛狀根，其可溶性蛋白含量都隨著培養(yǎng)時間的延長而呈先上升后逐漸下降的趨勢。與對照相比，10 μmol/L Cd處理的毛狀根可溶性蛋白含量僅在培養(yǎng)后5~10 d期間比同期對照提高；而后隨著培養(yǎng)時間延長而逐漸下降。50 μmol/L Cd處理的毛狀根可溶性蛋白含量幾乎在整個培養(yǎng)期間都比對照提高，其中，以培養(yǎng)15 d的可溶性蛋白含量最高，達(dá)到7.12 mg/g FW；而100 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根可溶性蛋白含量則比對照低；而當(dāng)毛狀根在300 μmol/L Cd中培養(yǎng)時，其可溶性蛋白含量僅在培養(yǎng)后5~10 d期間比同期對照提高，且隨著培養(yǎng)時間延長而逐漸下降；但其可溶性蛋白含量在5~25 d的培養(yǎng)期間均比100 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根高。這表明在培養(yǎng)過程中添加10~50 μmol/L Cd可在一定程度上促進(jìn)毛狀根可溶性蛋白的產(chǎn)生，但隨著Cd脅迫時間的延長和Cd濃度的升高，毛狀根的蛋白質(zhì)合成受阻或合成能力逐漸下降。

而與對照 (僅添加 200 μmol/L Cd) 培養(yǎng)的毛狀根相比，200 μmol/L Cd和10~20 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根可溶性蛋白含量在培養(yǎng)后5~15 d間均比對照略高，而當(dāng)毛狀根在200 μmol/L Cd和30 mmol/L Ca組合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，雖在培養(yǎng)5~15 d期間的可溶性蛋白含量比對照低，但在培養(yǎng)15~25 d期間，其可溶性蛋白含量隨培養(yǎng)時間的延長而逐漸升高，且明顯高于對照。與對照 (僅添加300 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根) 相比，300 μmol/L Cd和10~30 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根可溶性蛋白含量也隨著培養(yǎng)時間的延長呈現(xiàn)先升高后逐漸下降的趨勢，但其含量均比同期對照明顯升高，尤其是當(dāng)毛狀根在300 μmol/L Cd和30 mmol/L Ca中培養(yǎng)時，其可溶性蛋白含量分別是同期對照的 2.39倍、1.80倍、1.62倍、3.11倍和 2.67倍。這表明，隨著Cd脅迫處理時間的延長，Ca可能通過促進(jìn)蛋白水解酶活性，加強了某些蛋白質(zhì)的分解，通過提高南美蟛蜞菊毛狀根的可溶性蛋白含量來影響重金屬Cd對毛狀根生長的抑制或毒害。

2.3 Cd單獨及其與Ca組合對南美蟛蜞菊毛狀根POD活性的影響

植物體內(nèi)的超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化物酶 (POD) 是活性氧自由基清除系統(tǒng)中重要的保護(hù)酶，其活性的提高可以為細(xì)胞清除過多的自由基，是使細(xì)胞免受毒害的調(diào)節(jié)反應(yīng)，但這種調(diào)節(jié)能力有一定限度。從圖5可見，對照 (0 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根) 的POD活性在培養(yǎng)過程中呈緩慢上升的趨勢，與對照相比，不同濃度Cd培養(yǎng)的毛狀根POD活性則呈先上升后下降的趨勢；而無論是低濃度Cd (10 μmol/L和50 μmol/L) 還是高濃度Cd (100 μmol/L和300 μmol/L) 培養(yǎng)的毛狀根POD活性在5~20 d內(nèi)均比同期對照高。其中，100 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根POD活性在培養(yǎng)至10 d達(dá)到最高，為同期對照的1.47倍，但培養(yǎng)10 d后其POD活性隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸下降，至培養(yǎng)25 d時其POD活性甚至比對照及其他濃度 Cd培養(yǎng)的都低；而300 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根POD活性則在培養(yǎng)的各個時期都比對照和其他鎘濃度培養(yǎng)的毛狀根高，其POD活性分別比同期對照增加25.6%、63.6%、77.6%、64.4%和44.4%，達(dá)到顯著水平 (P＜0.05)。這表明，在一定Cd濃度范圍內(nèi)南美蟛蜞菊毛狀根可通過提高其POD活性來抵御Cd脅迫引起的毛狀根生長的抑制或毒害。

圖6為200 μmol/L與10~30 mmol/L Ca組合對南美蟛蜞菊毛狀根POD活性影響的測定結(jié)果。從圖6可見，200 μmol/L Cd和10~30 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根 POD活性均比對照 (僅添加200 μmol/L Cd) 毛狀根的POD活性明顯降低，其毛狀根POD活性在培養(yǎng)后5~20 d內(nèi)均隨時間的延長而逐漸升高；20 d后，除200 μmol/L Cd和30 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根POD活性繼續(xù)升高外，200 μmol/L Cd和 10 mmol/L及20 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根POD活性迅速下降，培養(yǎng)到25 d時分別僅為對照的31.1%和38.0%。而300 μmol/L Cd和10~30 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根POD活性與200 μmol/L Cd和10~30 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根的POD活性變化趨勢相似，其 POD活性也比僅添加300 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根明顯降低。這表明，外源Ca與Cd組合可以明顯降低南美蟛蜞菊毛狀根的POD活性，并可能通過對POD活性的調(diào)節(jié)來拮抗或減輕重金屬Cd對南美蟛蜞菊毛狀根生長的抑制或毒害。

2.4 Cd單獨及其與Ca組合對南美蟛蜞菊毛狀根SOD活性的影響

圖5 Cd濃度對南美蟛蜞菊毛狀根POD活性的影響Fig. 5 Effect of Cd concentrations on POD activities in hairy roots of W. trilobata.

圖6 200 μmol/L Cd與10~30 mmol/L Ca組合對南美蟛蜞菊毛狀根POD活性的影響Fig. 6 Effect of 200 μmol/L Cd in combination with 10?30 mmol/L Ca on POD activities in hairy roots of W. trilobata.

圖7 Cd濃度對南美蟛蜞菊毛狀根SOD活性的影響Fig. 7 Effect of Cd concentrations on SOD activities in hairy roots of W. trilobata.

圖7為Cd濃度對南美蟛蜞菊毛狀根SOD活性影響的測定結(jié)果。從圖7可見，與對照相比，不同濃度Cd培養(yǎng)的南美蟛蜞菊毛狀根SOD活性在培養(yǎng)后5~20 d間隨培養(yǎng)時間的延長而逐漸升高，且其活性均比同期對照明顯提高；而培養(yǎng) 20 d后，對照毛狀根的SOD活性繼續(xù)上升；而不同濃度Cd培養(yǎng)的毛狀根SOD活性則逐漸下降，培養(yǎng)至25 d時，10、50、100 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根 SOD活性甚至比同期對照還低；其中以100 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根SOD活性最低，僅為同期對照SOD活性的64.06%。該結(jié)果表明，重金屬Cd可明顯提高毛狀根的SOD活性，并可能通過對毛狀根SOD活性的調(diào)節(jié)來影響Cd對毛狀根生長的抑制或毒害。

而與對照相比，當(dāng)南美蟛蜞菊毛狀根在200 μmol/L Cd和10 mmol/L 或30 mmol/L Ca中培養(yǎng)5~20 d時，其SOD活性大都比同期僅添加200 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根低，但培養(yǎng)至20~25 d時其SOD活性與對照相當(dāng)或略升高；而200 μmol/L Cd和20 mmol/L Ca培養(yǎng)的毛狀根SOD活性在培養(yǎng)后5~25 d期間則始終比對照降低，培養(yǎng)至 25 d時其 SOD活性為同期對照的46.76%。此外，當(dāng)毛狀根在300 μmol/L Cd和10、20和30 mmol/L Ca組合中培養(yǎng)時，在整個培養(yǎng)過程中其SOD活性呈先升后降的趨勢，其SOD活性均較對應(yīng)的僅添加300 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根不同程度的降低。可見，與僅加高濃度 Cd培養(yǎng)的毛狀根相比，外源加入10~30 mmol/L Ca可降低毛狀根的SOD活性。而SOD作為一種重要的防御酶，其活性的維持和提高是植物耐受Cd脅迫的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。該結(jié)果表明，南美蟛蜞菊毛狀根對Cd脅迫具有一定的耐受能力;而外源添加一定濃度的 Ca可能通過降低毛狀根的SOD活性，來減輕或緩解重金屬Cd對南美蟛蜞菊毛狀根生長的抑制或毒害。

2.5 Cd單獨及其與Ca組合對南美蟛蜞菊毛狀根MDA含量的影響

膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量的高低是細(xì)胞膜受損傷程度的重要指標(biāo)之一。從圖8可見，無論南美蟛蜞菊毛狀根是在10 μmol/L或50 μmol/L低濃度 Cd，還是在高濃度 100 μmol/L Cd和300 μmol/L Cd中培養(yǎng)，其MDA含量均比同期對照升高，并且隨著Cd濃度的增加而逐漸升高；其中，以300 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根MDA含量最高，在整個培養(yǎng)過程中，其MDA含量分別為同期對照毛狀根MDA含量的1.53、1.49、1.23、1.17和2.10倍。這可能表明，重金屬Cd對南美蟛蜞菊毛狀根生長的抑制或毒害可能與其對毛狀根細(xì)胞膜脂過氧化的促進(jìn)有關(guān)。

圖8 Cd濃度對南美蟛蜞菊毛狀根MDA含量的影響Fig. 8 Effect of Cd concentration on MDA content in hairy roots of W. trilobata.

而與對照 (僅添加 200 μmol/L Cd) 相比，200 μmol/L Cd和20~30 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的南美蟛蜞菊毛狀根 MDA含量比對照降低，而200 μmol/L Cd和10 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根 MDA含量在 5~15 d培養(yǎng)期間比對照略高，而培養(yǎng) 15 d后也逐漸降低，至培養(yǎng) 25 d時其MDA含量比同期對照降低了33.72%。圖9為300 μmol/L Cd與10~30 mmol/L Ca組合對南美蟛蜞菊毛狀根 MDA含量的影響。從圖 9可見，與對照 (僅添加300 μmol/L Cd) 相比，300 μmol/L Cd和10、20和30 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根MDA含量在培養(yǎng)后5~20 d期間，其MDA含量都比對照明顯降低；而培養(yǎng)至25 d時，300 μmol/L Cd和10~20 mmol/L Ca組合培養(yǎng)的毛狀根的MDA含量略高于對照，但300 μmol/L Cd和30 mmol/L Ca培養(yǎng)毛狀根的MDA含量則比對照低。可見，外源加入10~30 mmol/L Ca可降低毛狀根的MDA含量。這可能表明，外源Ca可能通過降低毛狀根細(xì)胞膜脂過氧化程度而對重金屬鎘對毛狀根生長的抑制或毒害產(chǎn)生拮抗作用或緩解效應(yīng)。

2.6 Cd2+及其與 Ca2+組合對南美蟛蜞菊毛狀根吸收Cd2+的影響

圖10為培養(yǎng)液Cd2+濃度對南美蟛蜞菊毛狀根吸收重金屬Cd2+的影響。從圖10可見，當(dāng)毛狀根在含有100 μmol/L和300 μmol/L Cd2+的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，毛狀根能從培養(yǎng)基中吸收重金屬Cd2+，其中當(dāng)培養(yǎng)基鎘濃度100 μmol/L Cd2+時，毛狀根對Cd2+的吸收量較高，且Cd2+吸收量隨培養(yǎng)時間的延長而逐漸升高。然而，當(dāng)毛狀根在300 μmol/L Cd2+培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d、4 d和6 d后，其Cd2+吸收量則分別比100 μmol/L Cd2+培養(yǎng)的同期毛狀根降低約40.23%、32.35%和42.53%。這表明，南美蟛蜞菊毛狀根能吸收重金屬Cd2+，但其對 Cd2+的吸收效率與 Cd2+的濃度和培養(yǎng)時間的長短等因素有關(guān)。

圖9 300 μmol/LCd與10~30 mmol/L Ca組合對南美蟛蜞菊毛狀根MDA含量的影響Fig. 9 Effect of 300 μmol/L Cd in combination with 10?30 mmol/L Ca on on MDA content in hairy roots of W. trilobata.

圖10 Cd2+濃度對南美蟛蜞菊毛狀根吸收 Cd2+的影響Fig. 10 Effect of Cd concentrations on absorption of Cd2+ in hairy roots of W. trilobata.

圖11 100 μmol/L Cd2+與10~30 mmol/L Ca2+組合對南美蟛蜞菊毛狀根吸收Cd2+的影響Fig. 11 Effect of 100 μmol/L Cd2+ in combination with 10?30 mmol/L Ca2+ on absorption of Cd2+ in hairy roots of W. trilobata.

圖12 300 μmol/L Cd2+與10~30 mmol/L Ca2+組合對南美蟛蜞菊毛狀根吸收Cd2+的影響Fig. 12 Effect of 300 μmol/L Cd2+ in combination with 10?30 mmol/L Ca2+ on absorption of Cd2+ in hairy roots of W. trilobata.

圖11和圖 12分別為 100 μmol/L Cd2+和300 μmol/L Cd2+與10~30 mmol/L Ca2+組合培養(yǎng)對南美蟛蜞菊毛狀根吸收Cd2+的測定結(jié)果。由圖11可知，與對照 (僅添加100 μmol/L Cd2+培養(yǎng)的毛狀根) 相比，外源添加10~30 mmol/L Ca2+可顯著降低毛狀根對Cd2+的吸收，其鎘含量大都隨培養(yǎng)基中Ca2+濃度的升高而逐漸下降。培養(yǎng)到第6天時，100 μmol/L Cd2+與10~30 mmol/L Ca2+組合培養(yǎng)的毛狀根對 Cd2+的吸收量分別比同期對照降低了71.56%、87.49%和85.32%，達(dá)到顯著水平 (P＜0.05)。而從圖 12可見，與對照 (僅添加300 μmol/L Cd2+培養(yǎng)的) 毛狀根相比，外源加入10 mmol/L Ca2+時，毛狀根對Cd2+的吸收量不但沒有降低，反而比對照有明顯提高，培養(yǎng)2 d、4 d和6 d時其毛狀根Cd2+含量分別為同期對照毛狀根Cd2+吸收量的2.26倍、1.31倍和1.26倍；但外源加入30 mmol/L Ca2+時毛狀根對Cd2+的吸收才受到明顯抑制，培養(yǎng)至6 d時，其毛狀根吸收的Cd2+含量約比同期對照降低61.58%?？梢姡庠刺砑?Ca2+可以影響南美蟛蜞菊毛狀根對重金屬Cd2+的吸收能力，但當(dāng)用高濃度Cd2+培養(yǎng)毛狀根時，需添加較高濃度的外源Ca2+才能有效抑制毛狀根對Cd2+的吸收。而這表明外源Ca2+可能通過降低或減少毛狀根對Cd2+的吸收，從而拮抗或減弱高濃度Cd2+對毛狀根生長的抑制或毒害。

2.7 Cd2+及其與 Ca2+組合對南美蟛蜞菊毛狀根吸附Cd2+的影響

圖13為Cd2+濃度對南美蟛蜞菊毛狀根吸附Cd2+的影響。從圖 13可見，當(dāng)毛狀根在含有100 μmol/L和300 μmol/L Cd2+的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，毛狀根能吸附培養(yǎng)基中的Cd2+，并且其Cd2+吸附量隨培養(yǎng)基 Cd2+濃度的增加及培養(yǎng)時間的延長而升高；其中300 μmol/L Cd2+培養(yǎng)的毛狀根吸附的Cd2+含量較100 μmol/L Cd2+培養(yǎng)的高，培養(yǎng)2 d、4 d和6 d后，其Cd2+吸附量分別約為同期100 μmol/L Cd2+的0.82倍、3.74倍和5.26倍。這表明，南美蟛蜞菊毛狀根具有較強的吸附重金屬Cd2+的能力，且毛狀根對鎘的吸附作用與所用的Cd2+濃度及培養(yǎng)時間長短等有關(guān)。

圖13 Cd2+濃度對EDTA洗脫的毛狀根重金屬Cd2+含量的影響Fig. 13 Effect of Cd2+ concentration on Cd2+ content diluted by EDTA solution from hairy roots of W. trilobata.

圖14為100 μmol/L和10~30 mmol/L Ca2+組合對南美蟛蜞菊毛狀根吸附Cd2+的測定結(jié)果。由圖14可知，與對照 (僅100 μmol/L Cd2+培養(yǎng)的毛狀根) 相比，外源加入 10~30 mmol/L Ca2+時毛狀根對 Cd2+的吸附量隨著 Ca2+濃度的升高增加而逐漸降低；其中以培養(yǎng)4 d時100 μmol/L Cd2+與 10~30 mmol/L Ca2+組合培養(yǎng)的毛狀根對Cd2+的吸附量下降程度最明顯，其Cd2+吸附量分別比同期對照下降約38.16%、62.26%和66.90%，達(dá)到顯著水平 (P＜0.05)。而與100 μmol/L Cd2+與10~30 mmol/L Ca2+組合相比，300 μmol/L Cd2+和 10~30 mmol/L Ca2+組合更可降低毛狀根對Cd2+的吸附量；培養(yǎng)到6 d時，毛狀根對Cd2+的吸附量分別比同期對照 (僅添加 300 μmol/L Cd2+培養(yǎng)的毛狀根) 下降了 66.01%、71.13%和97.53%，差異達(dá)到顯著水平 (P＜0.05)?？梢?，外源加入10~30 mmol/L Ca2+能不同程度地降低毛狀根對Cd2+的吸附量，并因而減少Cd2+對南美蟛蜞菊毛狀根的抑制或毒害。

圖14 100 μmol/L Cd2+與10~30 mmol/L Ca2+組合對EDTA洗脫的毛狀根Cd2+含量的影響Fig. 14 Effect of 100 μmol/L Cd2+ in combination with 10?30 mmol/L Ca2+ on Cd2+ content diluted by EDTA solution from hairy roots of W. trilobata.

3 討論

一些研究表明，Cd對植物生長、根的形態(tài)和側(cè)根發(fā)生及其毒害的影響具有濃度劑量效應(yīng)和因植物類型而異[14-15]，如低濃度 (0.1 mg/L) Cd可促進(jìn)小白菜Brassica chinensis L.側(cè)根的發(fā)育，而≥5 mg/L Cd 則可使小白菜根變短變粗，根毛缺乏，側(cè)根分枝減少[14]；而受鎘毒害的玉米幼苗根尖膨大變褐繼而腐爛[15]。然而，所有這些有關(guān)Cd對植物生長和毒害的研究大都是通過水培、沙培或盆栽的方法來研究Cd對完整植株生長的影響，少見有關(guān)Cd對細(xì)胞培養(yǎng)物如愈傷組織或毛狀根生長影響的系統(tǒng)研究報道，未見有關(guān)重金屬Cd對南美蟛蜞菊W. trilobata毛狀根生長影響及其Cd耐受能力研究的報道。Fornazier 等發(fā)現(xiàn)，低濃度 (0.01~0.1 mmol/L) CdCl2能明顯促進(jìn)甘蔗Saccharum officinarum L. 愈傷組織的生長，但高濃度 (0.5~1 mmol/L) CdCl2則強烈抑制其生長[16]。這與本實驗的結(jié)果不完全一致。在本實驗中，培養(yǎng)基中Cd≤50 μmol/L 時能促進(jìn)南美蟛蜞菊毛狀根生長，而高于100 μmol/L Cd 則抑制毛狀根生長，使其側(cè)根短小，根尖發(fā)褐或變黑，濃度越高抑制越重甚至產(chǎn)生毒害。所不同的是，在本實驗中，無論是低濃度還是高濃度Cd培養(yǎng)南美蟛蜞菊毛狀根，培養(yǎng)10 d后其主、側(cè)根都變粗，分支較對照少；根體由淺紅色變成紫紅色；之后，隨著培養(yǎng)時間的延長和培養(yǎng)基Cd濃度的加大，毛狀根根尖逐漸變黃，直至發(fā)褐或變黑。然而，張艷等[17]液體培養(yǎng)黃瓜毛狀根時發(fā)現(xiàn)，Cd≤10 mg/L能促進(jìn)毛狀根生長，并使根增粗，而Cd≥15 mg/L才抑制黃瓜毛狀根生長，使根變得十分短而小，根尖膨大但不變褐，根表面變紅。此外，Cd≤50 μmol/L幾乎不影響褐脈少花龍葵毛狀根的生長，甚至還能略促進(jìn)生長；但≥100 μmol/L高濃度Cd則開始抑制生長，且濃度愈高抑制作用愈明顯，使毛狀根側(cè)根根尖變褐變短，數(shù)目減少[18]。這與本實驗的結(jié)果不完全一致。而這種差異表明重金屬Cd對植物毛狀根生長及毒害影響的程度不僅具有劑量效應(yīng)，而且還可因植物或毛狀根類型而異。

已有的研究表明，Cd對植物的毒害可能是通過損害生物體內(nèi)的抗氧化保護(hù)酶POD和SOD的活性及蛋白質(zhì)的合成等變化表現(xiàn)出毒性[19]。如低濃度Cd能促進(jìn)植物蛋白質(zhì)合成，但高濃度Cd則對蛋白質(zhì)合成起破壞或抑制作用[15]。而張利紅等在研究Cd污染對小麥生長和部分生理特性影響時發(fā)現(xiàn)，隨著 Cd濃度的增加，小麥幼苗的SOD、POD活性隨Cd濃度的增高而增加[20]；而不同濃度Cd培養(yǎng)的黃瓜毛狀根可溶性蛋白含量大都隨著培養(yǎng)時間延長而逐漸下降，但其 SOD和 POD活性則逐漸升高[17]。然而在高濃度 Cd培養(yǎng)時，油菜Brassica napus L. cv Drakkar植株的抗氧化酶SOD和CAT活性均急劇下降；但高濃度Cd也可顯著降低白菜Brassica campestris L. ssp. chinensis (L.) Makino葉片和蘆葦Phragmite ausralis L.幼苗的SOD、CAT及POD 活性[21-22]；然而也有報道表明，在超積累植物庭薺 Alyssum maritimum L.中，高濃度 Cd卻可提高該植物的SOD活性[23]；而受Cd脅迫時，印度芥菜Brassica juncea L.植株的抗氧化酶活性則保持恒定或幾乎不變[24]。此外，隨著鎘濃度增加，土培的Cd超富集植物圓錐南芥 Arabis paniculata Franch的SOD活性呈下降趨勢，但其POD和CAT等活性則呈先升高后降低的變化趨勢[25]。而這些與本實驗的結(jié)果不一致。在本實驗中，各濃度Cd培養(yǎng)的南美蟛蜞菊毛狀根的POD和SOD活性均隨著Cd濃度提高而逐漸升高，其中尤以POD活性的表現(xiàn)最為明顯，300 μmol/L Cd培養(yǎng)的毛狀根POD活性明顯高于其他濃度培養(yǎng)的毛狀根。這些結(jié)論表明，Cd對植物抗氧化保護(hù)酶活性的影響程度可能與所使用的Cd濃度、植物類型以及毛狀根的生長特性等有關(guān)。

丙二醛 (MDA) 是植物細(xì)胞膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，其含量的高低在一定程度上能反映膜脂過氧化水平和膜結(jié)構(gòu)的受害程度及植株的自我修復(fù)能力。有關(guān)Cd促進(jìn)植物細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化已有不少報道。如用10~50 μmol/L Cd培養(yǎng)印度芥菜和油菜時發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫僅使油菜體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化水平增加，而印度芥菜的 MDA含量則保持不變[24]。但扁桃Prunus dulcis L.幼苗在0~150 μmol/L Cd 水培時發(fā)現(xiàn)，無論是根還是葉中，高濃度Cd 可通過提高脂質(zhì)過氧化水平而對植株產(chǎn)生氧化損傷[26]。而在本實驗中，無論南美蟛蜞菊毛狀根在低濃度≤50 μmol/L Cd，還是在高濃度 (＞100 μmol/L Cd) 中培養(yǎng)，其MDA含量大都比同期對照 (不加 Cd處理) 升高，并且300 μmol/L Cd 處理的MDA含量在培養(yǎng)的各個時期幾乎都是最高的。而施和平等[18]報道，不同濃度Cd培養(yǎng)的褐脈少花龍葵毛狀根MDA含量均比同期對照顯著提高，表明Cd可促進(jìn)毛狀根細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化。然而，在Cd脅迫處理的胡蘿卜Daucus carota L. 植株及其毛狀根中并未出現(xiàn)明顯的膜脂過氧化[27]。這顯然與本實驗的結(jié)果相反。而這種差異的產(chǎn)生表明Cd對植物細(xì)胞膜脂過氧化的促進(jìn)也可能因所使用的Cd濃度、植物種類和毛狀根類型等而異。

Ca是植物生長發(fā)育必需的大量元素。已有的研究表明，外源鈣可能通過對有害礦質(zhì)元素的拮抗作用[28]、維持較高的抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)活力[29]以及發(fā)揮鈣信使系統(tǒng)的功能[30]等而發(fā)揮作用。如在鎘脅迫下，玉米根部供鈣可明顯提高其SOD、POD和CAT 活性，降低其葉片丙二醛含量[15]。而在 Cd2+毒害下，用 5 mmol/L Ca2+和10 mmol/L Ca2+處理玉米種子后，其幼苗的SOD和CAT活性增加，而MDA含量逐漸下降，表明Ca能減少以至消除Cd2+對種子活力和幼苗生長的毒害作用[31]。然而，這些研究都是以完整植物為材料，少見有關(guān)Ca和Cd結(jié)合對毛狀根生長影響的研究報道。在本實驗中，南美蟛蜞菊毛狀根不僅能從培養(yǎng)基中吸收和吸附Cd2+，而且，所吸收和吸附的 Cd2+含量隨著培養(yǎng)基 Cd2+濃度的升高而增加；但外源加入 10~30 mmol/L Ca2+后，毛狀根吸收和吸附的Cd2+含量則逐漸降低。此外還發(fā)現(xiàn)，與僅添加 Cd2+培養(yǎng)相比，外加10~30 mmol/L Ca2+不僅能通過離子拮抗而減少毛狀根對Cd2+的吸收，降低其Cd2+含量，而且可降低毛狀根可溶性蛋白含量和MDA含量，提高其抗氧化酶SOD活性，降低其膜脂過氧化水平，從而解除或減輕重金屬Cd2+對其生長的毒害。賀迪等[22]發(fā)現(xiàn)，在營養(yǎng)液中 Cd2+濃度由 2 μmol/L增加到0.6 mmol/L時，蘆葦幼苗的SOD、CAT和 POD等抗氧化酶活性顯著降低，而加入10 mmol/L CaCl2則可抑制 MDA產(chǎn)生，并刺激Cd2+脅迫蘆葦幼苗葉片SOD和CAT活性的增強，從而提高蘆葦對Cd2+的抗性。而這與本實驗的結(jié)果相似。這說明，外源 Ca2+可以緩解過量 Cd2+脅迫引起的膜脂過氧化和刺激植物細(xì)胞抗氧化酶活性的提高，從而對Cd2+導(dǎo)致的毛狀根生長的抑制或毒害產(chǎn)生拮抗或緩解效果。

有研究表明，外源Ca2+在逆境脅迫中的作用可能與Ca2+-CaM的作用或與Ca2+在穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮的作用有關(guān)[30]。而在研究Cd2+對蘿卜Raphanus sativus L. 種子萌發(fā)和幼苗生長時還發(fā)現(xiàn)，Ca2+可部分逆轉(zhuǎn)Cd2+對種子生長和Cd2+吸收的抑制，而Cd2+不僅可與Ca2+競爭CaM的結(jié)合位點；還可抑制Ca2+-CaM依賴的磷酸二酯酶的活化，這表明Cd2+對種子萌發(fā)的毒害是通過Cd2+對Ca2+-CaM的影響而發(fā)揮作用[32]。而在我們的結(jié)果中，外源供給10~30 mmol/L Ca2+后，毛狀根吸收和吸附的Cd2+含量雖比對照明顯降低，或隨著培養(yǎng)基中Ca2+濃度增加而降低，但含有相當(dāng)高含量Cd2+的毛狀根仍能較好地正常生長。這表明外源加入足夠 Ca2+并不能完全抑制毛狀根對Cd2+的吸收和吸附；而這是否表明在Cd-Ca拮抗過程中，外源Ca2+是否是通過Ca2+-CaM介導(dǎo)而發(fā)揮作用？或者說是否通過維持細(xì)胞內(nèi) Ca2+的低穩(wěn)態(tài)水平而發(fā)揮其生理作用？重金屬鎘毒害是否與通過影響Ca2+-CaM的功能有關(guān)則待進(jìn)一步研究。

本實驗的結(jié)果表明，南美蟛蜞菊毛狀根具有較強的重金屬Cd耐受能力；而外源加入Ca可拮抗Cd對毛狀根生長的抑制或毒害，減少毛狀根對Cd的吸收和吸附。我們的結(jié)果為今后利用具發(fā)達(dá)根系的南美蟛蜞菊毛狀根及其再生植株來對受重金屬Cd污染的環(huán)境進(jìn)行植物修復(fù)奠定了相關(guān)的前期工作基礎(chǔ)并提供了可能性。

[1] Wagner GJ. Accumulation of cadmium in crop plants and its consequences to human health. Adv Agron, 1993, 51(5): 173?212.

[2] Salt DE, Blaylock M, Kumar NPBA, et al. Phytoremediation: a novel strategy for the removal of toxic metals from the environment using plants. Biotechnology, 1995, 13(5): 468?474.

[3] Boominathan R, Doran PM. Cadmium tolerance and antioxidative defenses in hairy roots of the cadmium hyperaccumulator, Thlaspi caerulescens. Biotechnol Bioeng, 2003, 83(2): 158?167.

[4] Eapen S, Suseelan KN, Tivarekar S, et al. Potential

for rhizofiltration of uranium using hairy root cultures of Brassica juncea and Chenopodium amaranticolor. Environ Res, 2003, 91(2): 127?133. [5] Angelinia VA, Orejasb J, Medinaa MI, et al. Scale up of 2,4-dichlorophenol removal from aqueous solutions using Brassica napus hairy roots. J Hazard Mater, 2011, 185(1): 269?274.

[6] Qian JH, Zayed A, Zhu YL, et al. Phytoaccumulation of trace elements by wetland plants: III. uptake and accumulation of ten trace elements by twelve plant species. J Environ Qual, 1999, 28(5): 1448?1455.

[7] Ou SY, Shi HP, Tsang PK Eric. Induction and in vitro culture of Wedelia trilobata hairy roots. Chin J Biotech, 2010, 26(3): 378?385.歐少云, 施和平, 曾寶強. 南美蟛蜞菊毛狀根誘導(dǎo)及其離體培養(yǎng). 生物工程學(xué)報, 2010, 26(3): 378?385.

[8] Andersson A, Nillsson KO. Influence of lime and soil pH on Cd availability to plants. Ambio, 1974, 3(5): 198?200.

[9] Jiang YB, Li JH, Fang LY, et al. Effect of calcium on drought resisting of alfalfa seedlings. Chin J Grassland, 2008, 30(1): 117?120.姜義寶, 李建華, 方麗云, 等. 鈣處理對苜蓿幼苗抗旱性的影響. 中國草地學(xué)報, 2008, 30(1): 117?120.

[10] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976, 72(1/2): 248?254.

[11] Beauchamp C, Fridovich I. Superoxide dismutase: improved assays and an assay applicable to acrylamide gels. Anal Biochem, 1971, 44(1): 276?287.

[12] Zhang ZL, Zhai WJ. A Text-Manual for Plant Physiology. 3rd ed. Beijing: Higher Education Press, 2003: 123?124.張志良, 翟偉菁. 植物生理學(xué)實驗指導(dǎo). 3版. 北京: 高等教育出版社, 2003: 123?124.

[13] Heath RL, Packer L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts: I. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Arch Biochem Biophys, 1968, 125(1): 189?198.

[14] Qin TC, Wu YS, Wang HX, et al. Effect of cadmium, lead and their interactions on the physiological and ecological characteristics of root system of Brassica chinensis. Acta Ecol Sin, 1998, 18(3): 320?325.秦天才, 吳玉樹, 王煥校, 等. 鎘、鉛及其相互作用對小白菜根系生理生態(tài)效應(yīng)的研究. 生態(tài)學(xué)報, 1998, 18(3): 320?325.

[15] Kong XS, Guo XP, Zhang MX. Effect of Cadmium stress on seed leng growth and physiologychemistry of maize. J Huazhong Agri Univ, 1999, 18(2): 111?113.孔祥生, 郭秀璞, 張妙霞. 鎘脅迫對玉米幼苗生長及生理生化的影響. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1999, 18(2): 111?113.

[16] Fornazier RF, Ferreira RR, Pereira GJG, et al. Cadmium stress in sugar cane callus cultures: Effect on antioxidant enzymes. Plant Cell Tiss Org Cult, 2002, 71(2): 125?131.

[17] Zhang Y, Shi HP, Tsang PK Eric. Influences of heavy metal cadmium alone and in combination with zinc on the growth and activities of antioxidant enzymes of Cucumis sativus hairy roots. Chin J Biotech, 2009, 25(1): 60?68.張艷, 施和平, 曾寶強. 重金屬鎘及其與鋅組合對黃瓜毛狀根生長及其抗氧化酶活性的影響. 生物工程學(xué)報, 2009, 25(1): 60?68.

[18] Shi HP, Tsang PK Eric, Wang YL, et al. Effect of cadmium, alone or in combination with CaCl2, on the growth, antioxidative enzyme activity and cadmium absorption of Solanum nigrum L. var pauciflorum hairy roots. Chin J Biotech, 2010, 26(2): 147?158.施和平, 曾寶強, 王云靈, 等. 鎘及其與鈣組合對褐脈少花龍葵毛狀根生長、抗氧化酶活性和吸收鎘的影響. 生物工程學(xué)報, 2010, 26(2): 147?158.

[19] Chugh LK, Gupta VK, Sawhney SK. Effect of cadmium on enzymes of nitrogen metabolism in pea seedlings. Phytochemistry, 1992, 31(2): 395?400.

[20] Zhang LH, Li PJ, Li XM, et al. Effects of cadmium stress on the growth and physiological characteristics of wheat seedlings. Chin J Ecol, 2005, 24(4): 458?460.張利紅, 李培軍, 李雪梅, 等. 鎘脅迫對小麥幼苗生長及生理特性的影響. 生態(tài)學(xué)雜志, 2005, 24(4): 458?460.

[21] Sun GW, Zhu ZJ, Fang XZ. Effects of different cadmium levels on the growth and antioxidant enzymes in Brassica campestris L. ssp. chinensis (L.) Makino. Acta Horticul Sin, 2004, 31(3): 378?380.孫光聞, 朱祝軍, 方學(xué)智. 不同鎘水平對白菜生長及抗氧化酶活性的影響. 園藝學(xué)報, 2004, 31(3): 378?380.

[22] He D, Liu YG, Huang YE, et al. Effects of calcium on chlorophyll and antioxidant enzymes in Phragmite ausralis under cadmium stress. J Agro-Environ Sci, 2007, 26(1): 197?201.賀迪, 劉云國, 黃玉娥, 等. 鈣對不同濃度鎘脅迫下蘆葦幼苗葉綠素及抗氧化酶系統(tǒng)的影響. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2007, 26(1): 197?201.

[23] Schickler H, Capsi H. Response of antioxidative enzymes to nickel and cadmium stress in hyperaccumulator plants of the genus Alyssum. Physiol Plant, 1999, 105(1): 39?44.

[24] Nouairi I, Ben Ammar W, Ben Youssef N, et al. Antioxidant defense system in leaves of Indian mustard (Brassica juncea) and rape (Brassica napus) under cadmium stress. Acta Physiol Plant, 2009, 31(2): 237?247.

[25] Yu FM, Tang YT, Qiu RL, et al. Antioxidative responses to cadmium stress in the hyperaccumulator Arabis paniculata Franch. Acta Sci Circum, 2010, 30(2): 409?414.于方明, 湯葉濤, 仇榮亮, 等. Cd 脅迫下超富集植物圓錐南芥抗氧化機理. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2010, 30(2): 409?414.

[26] Nada E, Ferjani BA, Ali R, et al. Cadmium-induced growth inhibition and alteration of biochemical parameters in almond seedlings grown in solution culture. Acta Physiol Plant, 2007, 29(1): 57?62.

[27] Sanita di Toppi L, Lamberdi M, Pecchioni N, et al. Effects of cadmium stress on hairy root of Dacus carota. J Plant Physiol, 1999, 154: 385?391.

[28] Skórzyńska-Polit E, Tukendorf A, Selstam E, et al. Calcium modifies Cd effect on runner bean plants. Environ Exp Bot, 1998, 40(3): 275?286.

[29] Wang H, Zhou W, Lin B. Effects of Ca on growth and some physiological characteristics of maize under Cd stress. Plant Nutri Fert Sci, 2001, 7(1): 78?87.汪洪, 周衛(wèi), 林葆. 鈣對鎘脅迫下玉米生長及生理特性的影響. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報, 2001, 7(1): 78?87.

[30] Wang LJ, Liu YL, Ma K. The role of calcium in promotion of proline accumulation induced by salt stress in Ficus carica L. cells. Acta Photophysiol Sin, 1999, 25(1): 38?42.汪良駒, 劉友良, 馬凱. 鈣在無花果細(xì)胞鹽誘導(dǎo)脯氨酸積累中的作用. 植物生理學(xué)報, 1999, 25(1): 38?42.

[31] Song SQ, Jian WJ, Fu JR. Effect of Cd2+on seed vigor of Zea mays L. and antagonism of Ca2+to Cd2+. Chin J Appl Environ Biol, 1997, 2(1): 1?5.宋松泉, 簡偉軍, 傅家瑞. Cd2+對玉米種子活力的影響及 Ca2+的拮抗作用. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報, 1997, 2(1): 1?5.

[32] Rivetta A, Negrini N, Cocucci M. Involvement of Ca2+-calmodulin in Cd2+toxicity during the early phases of radish (Raphanus sativus L.) seed germination. Plant Cell Environ, 1997, 20(5): 600?608.