高金卉，竇文芳，李會，張曉梅，許泓瑜，許正宏,2

1 江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院制藥工程研究室，江蘇 無錫 214122

2 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

硫酸乙酰肝素 (HS) 是一種帶電荷的多糖分子，HS常被用作抗凝血藥。肝素類化合物，除了有明確的抗凝血和抗血栓活性外，有研究發(fā)現(xiàn)它們也有防止艾滋病毒感染和減緩細(xì)胞體外凋亡的作用[1-2]。當(dāng)前肝素類生物活性分子一般從哺乳動物器官中提取，用該方法提取的肝素易受非常規(guī)病毒的二次污染[3]，而以半合成方法合成HS可避免此類污染。

K5多糖具有以下結(jié)構(gòu)：…→4) β-D-葡萄糖醛酸 (1→4) α-D-N-乙酰氨基葡萄糖 (1→4) …。它是肝素的非硫酸前體，用于生產(chǎn)半合成肝素[4]。K5多糖來源于大腸桿菌，是一種莢膜多糖[5-6]，該多糖存在于發(fā)酵液中。在一定的培養(yǎng)條件下K5多糖的分子量為100~200 kDa，但是受自身所產(chǎn)生K5裂解酶的影響，發(fā)酵生產(chǎn)的K5多糖存在低分子量和高分子量組分[5]，多糖分子量分布不均。合成低分子量肝素所需K5多糖的分子量為5 kDa左右[7-10]，K5裂解酶可以將發(fā)酵生產(chǎn)的K5多糖裂解為分子量為5 kDa左右的多糖，因此Elma可以用于低分子量K5多糖的制備。然而該酶在大腸桿菌K5中只有少量表達(dá)，且難以分離純化。因此我們構(gòu)建了能夠大量高效表達(dá)該酶的基因工程菌。

本研究在大腸桿菌BL21 (DE3) 中高效表達(dá)了大腸桿菌K5裂解酶，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni2+-NTA親和層析純化、G75分子篩凝膠純化后得到能裂解K5多糖的裂解酶Elma[8]，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，本研究為K5裂解酶作為一種新型的工具酶的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

大腸桿菌 BL21 (DE3) (Escherichia coli BL21 (DE3))、大腸桿菌JM109 (Escherichia coli JM109α)、大腸桿菌 K5 (Escherichia coli Bi 8337/41 (O10∶K5∶H4))、質(zhì)粒pET-28a為本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒 pMD18-T Simple Vector 購自TaKaRa公司。

1.1.2 酶、載體、引物和主要試劑

擴(kuò)增大腸桿菌K5裂解酶elma基因的引物(表 1) 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，其上下游引物分別加入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn) (下劃線標(biāo)示)。限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、exTaq酶等分子生物學(xué)工具酶購自大連寶生物公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒、IPTG、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白等購自上海生工生物技術(shù)有限公司。Ni2+-NTA親和層析柱和G-75凝膠柱層析購自 GenScript公司。其他化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。K5多糖為本實(shí)驗(yàn)室制備[11-12]。

表1 克隆目的基因elma的引物Table 1 Primers for cloning of target genes

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌K5裂解酶基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

提取大腸桿菌K5基因組，以基因組為模板擴(kuò)增大腸桿菌裂解酶基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、回收、純化后連接 pMD18-T Simple Vector并用 CaCl2法轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中，提取連接好的 T載體用 BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、回收、純化后，用 T4 DNA連接酶連接到同樣經(jīng)過BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切的pET-28a (+) 質(zhì)粒上，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-Elma。轉(zhuǎn)化后經(jīng)提取質(zhì)粒、PCR和雙酶切鑒定，篩選陽性克隆進(jìn)行測序分析。

1.2.2 重組蛋白Elma在大腸桿菌BL21 (DE3)中的表達(dá)及條件優(yōu)化

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)菌中。轉(zhuǎn)化的BL21 (DE3) 在LB培養(yǎng)基中活化過夜后，接種至含有100 mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基中，對誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，考察不同誘導(dǎo)劑量、誘導(dǎo)時間對目的蛋白表達(dá)量的影響及蛋白溶解性變化。經(jīng)12% SDS-PAGE和光密度掃描檢測，確定最適誘導(dǎo)條件。

1.2.3 重組蛋白的純化

取IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)物500 mL，4 ℃離心收集并洗滌菌體，在冰浴中超聲破碎菌體，離心取上清，將上清用 0.45 μm的膜過濾后，采用 GenScript公司的Ni2+-NTA蛋白質(zhì)純化柱純化目的蛋白，選擇不同濃度的咪唑 (50~250 mmol/L) 梯度洗脫，具體操作參照其說明書并參考文獻(xiàn)[13,17]，純化后的蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE分析，確定洗脫液的最佳咪唑濃度。然后用凝膠過濾色譜SepHadex G-75分離，收集不同時間洗脫下來的色譜峰，測定純化效率[14]。

1.2.4 Elma的活性檢測

定性測定：1 μg的Elma加入到100 μL的1 g/L的 K5多糖反應(yīng)液中，反應(yīng)液含有100 mmol/L NaCl，10 mmol/L醋酸鈣，pH 7.0，37 ℃反應(yīng)10、20、30、40、50、60、70 min，取各個反應(yīng)時間的樣品10 μL沸水浴5 min。用10%聚丙烯酰胺電泳125 V (20 min) ~250 V (40 min) 檢測不同反應(yīng)時間 K5多糖分子量變化。用阿利辛藍(lán)和銀染的方法顯色[15]。

反應(yīng)最適溫度和pH確定：1 μg的Elma加入到 1 g/L的 K5多糖 3 mL中，反應(yīng)液含有100 mmol/L NaCl，10 mmol/L醋酸鈣，分別在37 ℃不同的pH，pH 7.0不同溫度下反應(yīng)5 min，測其OD232變化值[14]。每個樣品設(shè)3個平行組，重復(fù)試驗(yàn)2次，結(jié)果取平均。

底物特異性檢測：2 μg的K5裂解酶分別加入到0.5 g/L的K5多糖，HS和HA的反應(yīng)液中。反應(yīng)液含有100 mmol/L NaCl和10 mmol/L醋酸鈣 (pH 7.0)，37 ℃反應(yīng)一定時間，測不同時間OD232變化值。每個樣品設(shè)3個平行組，重復(fù)試驗(yàn)2次，結(jié)果取平均。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌K5裂解酶基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

用PCR方法以大腸桿菌K5基因組為模板擴(kuò)增elma基因。產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見在2 460 bp附近的擴(kuò)增產(chǎn)物 (圖1)，大小與預(yù)期相符；純化后的 PCR產(chǎn)物和 pMD18-T Simple Vector 連接后，與 pET-28a (+) 同時用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切純化并連接，得到重組質(zhì)粒pET-28a (+)-Elma，酶切鑒定表明重組載體構(gòu)建成功。測序結(jié)果表明與GenBank登記序列相一致。

2.2 重組蛋白Elma在大腸桿菌BL21 (DE3) 中的表達(dá)及條件優(yōu)化

將重組質(zhì)粒 pET-28a (+)-Elma轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3) 后，經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PAGE電泳分析顯示80 kDa處有明顯的蛋白條帶，與預(yù)期相符。表明重組菌BL21 (DE3)/ pET-28a (+) -Elma構(gòu)建成功。我們對誘導(dǎo)表達(dá)條件中的誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示：重組菌BL21/pET-28a (+)-Elma在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長前期，加入 IPTG濃度為0.2 mmol/L最佳 (圖 2)，誘導(dǎo)時間 5 h最佳(圖3)。重組蛋白Elma在優(yōu)化后表達(dá)量均可達(dá)到菌體總蛋白的30%以上。

圖1 elma的PCR擴(kuò)增Fig. 1 PCR amplification of elma. M: DNA marker; 1: PCR product of elma.

圖2 IPTG濃度對Elma蛋白表達(dá)量的影響Fig. 2 Effects of IPTG concentration on the expression of Elma. M: protein marker; 1: uninduced sample; 2: 0.1 mmol/L; 3: 0.2 mmol/L; 4: 0.3 mmol/L; 5: 0.4 mmol/L; 6: 0.5 mmol/L; 7: 0.6 mmol/L; 8: 0.7 mmol/L; 9: 0.8 mmol/L.

圖3 誘導(dǎo)時間對Elma蛋白表達(dá)量的影響Fig. 3 Effects of induction time on the expression of Elma. M: protein marker; 1: uninduced sample; 2: 1 h; 3: 2 h; 4: 3 h; 5: 4 h ; 6: 5 h; 7: 6 h.

2.3 Ni2+-NTA親和層析及G-75凝膠層析純化

對菌體超聲破碎后，用相差顯微鏡鏡檢，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞破碎完全。分別對破碎上清和沉淀進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明重組蛋白主要存在于上清中。將破碎后的菌體上清用親和層析柱和凝膠柱層析純化，收集各個色譜峰并用12% SDS-PAGE電泳觀察純化結(jié)果，從圖4可以看出：在約80 kDa處可見特異條帶。目的蛋白主要集中在咪唑濃度為200 mmol/L時的洗脫峰中，收集的樣品經(jīng)G-75分離得到較純的酶，經(jīng)SDS-PAGE薄層掃描分析，其純度大于95%。

2.4 Elma的活性定性檢測

1 μg的Elma加入到100 μL的1 g/L的K5多糖反應(yīng)液中反應(yīng)不同時間后取樣并將酶及時滅活，樣品用 10%聚丙烯酰胺電泳 125 V (20 min) ~250 V (40 min) 檢測其分子量變化。用阿利辛藍(lán)和銀染的方法顯色。電泳原理同蛋白電泳類似，圖5所示隨著反應(yīng)時間的延長，K5多糖電泳條帶隨著反應(yīng)時間的延長逐漸向下延伸，說明K5多糖的分子量隨著反應(yīng)時間的延長而降低，該實(shí)驗(yàn)定性地說明了重組表達(dá)的Elma對K5多糖有明顯的裂解作用。Elma for different time. 1: undigested sample; 2: 10 min; 3: 20 min; 4: 30 min; 5: 40 min; 6: 50 min; 7: 60 min; 8: 70 min.

圖4 純化后Elma的SDS-PAGE凝膠電泳分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of purified Elma. M: protein marker; 1?3: purified Elma.

圖5 K5多糖分子量隨著反應(yīng)時間變化Fig. 5 The change of K5 molecular after digested by

2.5 Elma的最適反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH

K5裂解酶的最適反應(yīng)溫度實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6A所示，Elma的酶活受溫度影響比較大，隨著反應(yīng)溫度的升高 (從32 ℃到52 ℃)，Elma的酶活呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，在37 ℃條件下酶活最高。Elma裂解 K5多糖的活性也受 pH的影響(圖6B)，隨著反應(yīng)體系pH的上升 (pH 6.0到pH 8.0)，Elma的酶活也呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當(dāng)pH為7.0時Elma的裂解活性最高。由以上實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象得出，重組Elma反應(yīng)最適溫度為37 ℃，最適反應(yīng)pH為7.0。

2.6 Elma底物特異性研究

研究Elma對不同底物的裂解活性，結(jié)果如圖7所示，說明Elma對K5多糖有著明顯的裂解作用，而對于肝素和透明質(zhì)酸裂解作用不明顯。分別增加透明質(zhì)酸 (HA) 和肝素 (HS) 的濃度，測不同底物濃度的OD值變化 (圖8)，發(fā)現(xiàn)隨著底物濃度的增加，反應(yīng)的OD值變化也相應(yīng)增加，由此可確定K5裂解酶對HA和HS也有裂解的作用。

圖6 Elma反應(yīng)最適溫度和反應(yīng)最適pHFig. 6 Optimal temperature and pH of Elma.

圖7 Elma底物特異性分析Fig. 7 The substrate specificity of Elma.

圖8 Elma對不同濃度底物 (HS和HA) 的裂解作用分析Fig. 8 Analysis of Elma degradating HS and HA at different concentrations.

4 討論

Elma作為K5多糖裂解酶，具有活性高和產(chǎn)物分子量均一的特性，但該酶在產(chǎn)K5多糖菌中的表達(dá)量較少且難以分離純化，不適宜大規(guī)模生產(chǎn)。為實(shí)現(xiàn)高效生產(chǎn) Elma，本研究在基因工程菌中高效表達(dá)了目的蛋白，產(chǎn)量高，成本低且易操作，適于大規(guī)模生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)將 Elma表達(dá)后得到水溶性蛋白，并經(jīng)分離純化后得到產(chǎn)物。經(jīng)過優(yōu)化得到的最佳的表達(dá)條件是：LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組菌，在對數(shù)生長期前期加入0.2 mmol/L的IPTG，16 ℃誘導(dǎo)5 h。產(chǎn)物經(jīng)純化得到了較高純度的Elma。

肝素的分子量越低，其抗凝活性越強(qiáng)。另外低分子量肝素在保持肝素的抗血栓作用的同時又降低了出血的風(fēng)險。低分子量肝素比高分子量肝素具備更好的療效，并且具有更小的副作用[16-18]。半合成法生產(chǎn)低分子量肝素的底物-低分子量K5多糖需要用K5裂解酶生產(chǎn)。我們克隆并表達(dá)了編碼 K5裂解酶的基因，該裂解酶被大量表達(dá)，并具有較高的活性。并對Elma的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。本研究為 K5裂解酶應(yīng)用于低分子量K5多糖的生產(chǎn)奠定了重要的基礎(chǔ)。

另外本研究發(fā)現(xiàn)除K5多糖外，Elma對另外兩種葡胺聚糖 (GAG) 透明質(zhì)酸和肝素也有裂解作用，低分子量的 GAG寡糖相對于高分量 GAG有著更好的治療作用[19-20]，葡胺聚糖裂解酶近年來受到普遍重視，Elma還可以作為工具酶來生產(chǎn)特殊的 GAG寡糖。本研究將有助于 Elma的規(guī)?；a(chǎn)和相關(guān)功能研究等后續(xù)工作。

[1] Linhardt RJ. Claude S. Hudson Award adress in carbohydrate chemistry. Heparin: structure and activity. J Med Chem, 2003, 46(13): 2551?2564. [2] Linhardt RJ, Toida T. Role of glycosaminoglycans in cellular communication. Acc Chem Res, 2004, 37(7): 431?438.

[3] Liu HY, Zhang ZQ, Linhardt RJ. Lessons learned from the contamination of heparin. Nat Prod Rep, 2009, 26(3): 313?321.

[4] Chen JH, Avci FY, Mu?oz EM, et al. Enzymatic redesigning of biologically active heparan sulfate. J Biol Chem, 2005, 280(52): 42817?42825.

[5] Vann WF, Schmidt MA, Jann B, et al. The structure of the capsular polysaccharide (K5 antigenn) of urinary-tract-infective Escherichia coli 010:K5:H4. A polymer similar to desulfo-heparin. Eur J Biochem, 1981, 116(2): 359?364.

[6] Manzoni M, Bergomi S, Cavazzoni V. Extracellular K5 polysaccharide of Escherichia coli: production and characterization. J Bioact Comp Polym, 1993, 8(3): 251?257.

[7] Manzoni M, Bergomi S, Rollini M. Influence of the culture conditions on extracellular lyase activity related to K5 polysaccharide. Biotechnol Lett, 2000, 22(1): 81?85.

[8] Linhardt RJ, Galliher PM, Gooney CL. Polysaccharide lyases. Appl Biochem Biotechnol, 1986, 12(2): 135?176.

[9] Lindahl U, Li JP, Kusche-Gullberg M, et al. Generation of "Neoheparin" from E. coli K5 capsular polysaccharide. J Med Chem, 2005, 48(2): 349?352.

[10] Kuberan B, Beeler DL, Lech M, et al. Chemoenzymatic synthesis of classical and non-classical anticoagulant heparan sulfate polysaccharides. J Biol Chem, 2003, 278(52): 52613?52621.

[11] Zhang ZQ, McCallum SA, Xie J, et al. Solution structures of chemoenzymatically synthesized heparin and its precursors. J Am Chem Soc, 2008, 130(39): 12998?13007.

[12] Legoux R, Lelong P, Jourde C, et al. N-Acetyl-Heparosan lyase of Escherichia coli K5: gene cloning and expression. J Bacteriol, 1996, 178(24): 7260?7264.

[13] Lv XY. Protein Purification Protocols and Applications. Beijing: Chemical Industry Press, 2010: 36?43.呂憲禹. 蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn)方案與應(yīng)用. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2010: 36?43.

[14] Clarke BR, Esumeh F, Roberts IS. Cloning, expression, and purification of the K5 capsular polysaccharide lyase(KflA)from coliphage K5A: evidence for two distinct K5 lyase enzymes. J Bacteriol, 2000, 182(13): 3761?3766.

[15] Min H, Cowman MK. Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution. Anal Biochem, 1986, 155(2): 275?285.

[16] Bai XD, Lv YL, Liu HJ. The application and advantage of low moculer weight HS in modern medicine. Harbin Med J, 2003, 23(4): 33.白曉丹, 呂艷莉, 劉紅杰. 低分子肝素在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用及其優(yōu)越性. 哈爾濱醫(yī)藥, 2003, 23(4): 33.

[17] Rek A, Tompson J, Roberts IR, et al. Biophysical investigation of recombinant K5 lyase: structural implications of substrate binding and processing. Biochim Biophys Acta, 2007, 1774(1): 72?77.

[18] Linhardt RJ. Chemical and enzymatic methods for the depolymerization and modification of heparin//Ogura H, ed. Carbohydrate Synthetic Methods and Applications in Medicinal Chemistry. Tokyo: VCH, 1992: 385?401.

[19] Chong BF, Blank LM, McLaughlin R, et al. Microbial hyaluronic acid production. Appli Microbiol Biotechnol, 2005, 66(4): 341?351.

[20] Lidholt K, Riesenfeld J, Jacobsson KG, et al. Biosynthesis of heparin. Modulation of polysaccharide chain length in a cell-free system. Biochem J, 1988, 254(2): 571?578.