楊靜，劉永平，劉蘊(yùn)，楊明峰

1 中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，山西 太原 030051

2 中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所，北京 100101

3 北京農(nóng)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè) (北方) 重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京 102206

麻瘋樹(shù)分子生物學(xué)研究進(jìn)展

楊靜1，劉永平1，劉蘊(yùn)2，楊明峰3

1 中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，山西 太原 030051

2 中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所，北京 100101

3 北京農(nóng)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè) (北方) 重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京 102206

麻瘋樹(shù)Jatropha curcas L.作為一種新興的生物柴油型能源樹(shù)種已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)可，關(guān)于它的各項(xiàng)研究持續(xù)升溫。文中綜述了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于麻瘋樹(shù)分子生物學(xué)方面的研究進(jìn)展，一是揭示麻瘋樹(shù)遺傳多樣性和系統(tǒng)分類(lèi)的分子標(biāo)記研究；二是全面解析麻瘋樹(shù)分子網(wǎng)絡(luò)的基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組研究；三是以培育優(yōu)質(zhì)高抗品系為目標(biāo)的代謝和發(fā)育調(diào)控相關(guān)基因的分離、克隆和功能研究；最后討論了目前研究的不足和麻瘋樹(shù)未來(lái)分子生物學(xué)研究的方向。

麻瘋樹(shù)，分子標(biāo)記，基因組，轉(zhuǎn)錄組，蛋白質(zhì)組，脂肪酸合成，非生物脅迫

Abstract:Jatropha curcas L., has been widely recognized as a potential source of biodiesel. In this review, we presented several aspects about the recent progress in molecular biology of J. curcas. First, molecular markers were used to assess its genetic diversity. Second, large-scale genome, transcriptome and proteome analyses were applied for decoding itsmolecular network. Third, functional characterization of key genes involved in metabolism and regulation of plant development was performed to breed lines with higher quality or higher resistance. Finally, we discussed the limitation of current progress and then proposed the future molecular biology research on J. curcas.

Keywords:Jatropha curcas, molecular marker, genome, transcriptome, proteomics, fatty acid biosynthesis, abiotic stress

麻瘋樹(shù) Jatropha curcas L.為大戟科(Euphorbiaceae) 麻瘋樹(shù)屬植物，又名小桐子、假花生、油桐等，多年生小喬木或灌木，成株高3~4米，多分枝，速生、幼枝粗壯，具有較強(qiáng)的耐干旱瘠薄能力[1-2]。原產(chǎn)中美洲，后引種到東南亞各國(guó)，分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，我國(guó)廣西、廣東、云南、四川、貴州、福建、海南等地均有栽培或野生。麻瘋樹(shù)林單年可以掛果，3年可投入生產(chǎn)，5年進(jìn)入盛果期，果實(shí)采摘期長(zhǎng)達(dá)50年，是國(guó)際上公認(rèn)的最有發(fā)展?jié)摿Φ纳镔|(zhì)能源樹(shù)種之一[2-3]。

由于麻瘋樹(shù)具有作為可再生能源植物的巨大潛能，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外利用各種分子生物學(xué)手段全面開(kāi)展了關(guān)于麻瘋樹(shù)遺傳多樣性、系統(tǒng)分類(lèi)、組學(xué)和功能基因等多項(xiàng)研究。這些研究為深入闡明麻瘋樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理、改善品質(zhì)、提高產(chǎn)量、最終實(shí)現(xiàn)對(duì)其果油的高效利用奠定了基礎(chǔ)。

1 分子標(biāo)記和遺傳多樣性分析

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，以 PCR為基礎(chǔ)建立起來(lái)的分子標(biāo)記技術(shù)不僅有利于種質(zhì)資源和系統(tǒng)分類(lèi)的研究，還有利于功能性標(biāo)記基因的定位和篩選，這將更好地為生物育種提供幫助。其中主要的分子標(biāo)記技術(shù)有：隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (Random amplified polymorphic DNA，RAPD) 標(biāo)記，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (Amplified fragment length polymorphism，AFLP) 標(biāo)記，簡(jiǎn)單重復(fù)序列 (Simple sequence repeats，SSR) 標(biāo)記，簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間 (Inter simple sequence repeats，ISSR) 標(biāo)記，特定序列擴(kuò)增區(qū)域(Sequence-characterized amplified region，SCAR)標(biāo)記等。

麻瘋樹(shù)的分子標(biāo)記研究主要集中在印度和中國(guó)，包括種間和種內(nèi)鑒定，鑒定的樣品最少2個(gè)，最高的224個(gè)。從Sujatha研究團(tuán)隊(duì)的研究?jī)?nèi)容我們很容易看到世界麻瘋樹(shù)分子標(biāo)記研究的發(fā)展軌跡，早在2005年他們用RAPD技術(shù)來(lái)研究一個(gè)印度有毒種與一個(gè)墨西哥無(wú)毒種之間的相似度[4]，此后，他們又分別運(yùn)用RAPD、ISSR和 SCAR三種技術(shù)評(píng)價(jià)印度不同地區(qū)的有毒種與墨西哥無(wú)毒種之間的遺傳多樣性，共計(jì) 42個(gè)樣本，其結(jié)論是：同一地區(qū)不同生態(tài)型的麻瘋樹(shù)變異程度很小[5]，這與我國(guó)和巴西的研究結(jié)果相似[6-7]。因此，研究人員逐漸擴(kuò)大樣品的采集地，最終發(fā)現(xiàn)來(lái)自中美洲的樣本具有較高的遺傳多樣性，而非洲和印度地區(qū)的變異度則很低。隨著EST數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷挖掘和大戟科其他物種信息的補(bǔ)充，36條EST-SSRs和20條基因組SSRs被用于研究來(lái)自印度尼西亞、南美、云南、海南和格林納爾等地的 45個(gè)樣本，發(fā)現(xiàn)不同區(qū)域的類(lèi)群變異度比同一類(lèi)群的變異度大[8]?？偟膩?lái)說(shuō)麻瘋樹(shù)的遺傳基礎(chǔ)較窄，在育種改良方面還需要擴(kuò)大范圍，進(jìn)行諸如突變、種內(nèi)/種間雜交等研究。

除了針對(duì)基因組變異的研究外，同工酶技術(shù)也是了解種群內(nèi)遺傳變異的有力工具。張煒等[9]選取云南、四川2個(gè)省區(qū)10個(gè)麻瘋樹(shù)品種，分析了它們7種酶系統(tǒng)7個(gè)位點(diǎn)上21個(gè)等位基因的遺傳變異，相比較而言，西南地區(qū)的麻瘋樹(shù)具有較高的遺傳多樣性，而這種多樣性與種群的地理分布無(wú)關(guān)；種群內(nèi)部雜合程度較高，推測(cè)可能存在自交不育現(xiàn)象。

2 基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究

2.1 基因組學(xué)

麻瘋樹(shù)有 22條染色體，是典型的二倍體生物。它的基因組大概有416 Mbp，屬于比較理想的基因組測(cè)序植物[10]。目前，SGI公司 (Synthetic Genomics Inc.) 和ACGT公司 (Asiatic Centre for Genome Technology) 運(yùn)用 Sanger雙脫氧法和二代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)能夠估計(jì)出基因組大約有400 Mbp，與水稻基因組大小差不多，并公布了完整的首個(gè)麻瘋樹(shù)基因組草圖 (http://www.acgt.asia/press/pdf/20May2009.pdf)。之后Sato小組利用周期短、費(fèi)用低的雙脫氧法和最新測(cè)序綜合技術(shù)測(cè)定了麻瘋樹(shù)基因組序列，結(jié)果顯示：非冗余序列的基因組全長(zhǎng)2.85 Mbp，包含12萬(wàn)個(gè)重疊群 (Contigs) 和2.9萬(wàn)個(gè)單一序列 (Singlets)，大約有 1 529個(gè)(4%) 預(yù)測(cè)編碼蛋白的基因是麻瘋樹(shù)特有的[11]。

由于葉綠體和質(zhì)體是植物合成脂肪酸的主要場(chǎng)所，因此麻瘋樹(shù)葉綠體基因組 (cpDNA) 也備受關(guān)注，目前公布的測(cè)序結(jié)果顯示這個(gè)閉合環(huán)狀的分子有163 856 bp長(zhǎng)，編碼110個(gè)獨(dú)立基因(其中78個(gè)蛋白、4個(gè)rRNA和28個(gè)tRNA)，它的大小和基因排布與其他樹(shù)種相似，系統(tǒng)樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)它與木薯的親緣關(guān)系最近[12]。這項(xiàng)數(shù)據(jù)還能為以葉綠體為基礎(chǔ)的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立提供相應(yīng)的信息。

2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)

基于麻瘋樹(shù)種子油的重要價(jià)值，許多的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究集中在麻瘋樹(shù)種子、生殖器官等。研究人員先后從王治濤等[13]構(gòu)建的麻瘋樹(shù)胚乳cDNA文庫(kù)篩選到多個(gè)與油脂代謝和逆境響應(yīng)有關(guān)的功能基因，并在此后的幾年中開(kāi)展了基因全長(zhǎng)、表達(dá)模式等方面的深入研究。Natarajan等[14]從麻瘋樹(shù)發(fā)育中的種子 cDNA文庫(kù)獲得 12 084個(gè)EST序列，平均長(zhǎng)度為576 bp，這些序列片段與油脂合成相關(guān)的許多生物功能有關(guān)。Wang等[15]用麻瘋樹(shù)的生殖器官構(gòu)建了 2個(gè) cDNA文庫(kù)，共得到9 289條平均長(zhǎng)度為603 bp的EST序列，這些序列經(jīng)過(guò)組裝得到4 502條獨(dú)立基因序列 (UniSeqs)，選擇 50條 EST序列在葉、花和種子中的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行了定量分析，發(fā)現(xiàn)其中6條在1~2個(gè)麻瘋樹(shù)組織中檢測(cè)到，這些基因可能編碼高表達(dá)的油脂合成相關(guān)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子。

為了改善逆境條件下麻瘋樹(shù)的生長(zhǎng)狀態(tài)，Eswaran等[16]利用鹽敏感的酵母菌種篩選麻瘋樹(shù)根的cDNA文庫(kù)，從20 000個(gè)轉(zhuǎn)化子中篩選出345個(gè)陽(yáng)性克隆，從中獲得32個(gè)全長(zhǎng)基因。選擇胚胎晚期積累蛋白基因 LEA5、胞質(zhì)抗壞血酸氧化酶基因Apx1、肌動(dòng)蛋白抑制蛋白基因profilin、金屬硫蛋白基因metallothionein和磷脂結(jié)合蛋白基因annexin 5個(gè)基因檢測(cè)它們?cè)邴}脅迫下根、葉中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們都在脅迫2 h后發(fā)生變化，說(shuō)明它們都與脅迫早期響應(yīng)有關(guān)，但是在根、葉中的表達(dá)規(guī)律各異，說(shuō)明在抵御脅迫時(shí)，不同的組織采取不同的抵抗機(jī)制。這些表達(dá)序列EST和相關(guān)基因的功能解析，將為麻瘋樹(shù)的育種工作提供無(wú)價(jià)的基因資源。

2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)

麻瘋樹(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究也聚焦到油體功能和油脂的生物合成上。通過(guò)對(duì)麻瘋樹(shù)種子萌發(fā)過(guò)程中胚乳油脂變化的比較分析發(fā)現(xiàn)油脂的利用主要在萌發(fā)的早期，而且涉及到β氧化、乙醛酸循環(huán)、TCA循環(huán)、糖異生和戊糖等多個(gè)途徑[17]。Polluechai等[18]對(duì)油體的進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)3個(gè)油體蛋白o(hù)leosins (JcOle1，JcOle2，JcOle3)，比較發(fā)現(xiàn) JcOle3的表達(dá)水平是其他兩個(gè)基因的 5倍，而且它呈現(xiàn)等位基因變異和內(nèi)含子區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性現(xiàn)象，因此可以作為系統(tǒng)分類(lèi)的標(biāo)記基因和分子育種的侯選基因。除了油體，對(duì)麻瘋樹(shù)成熟種子中胚和胚乳可溶性蛋白的比較研究中發(fā)現(xiàn)它們差異蛋白集中在油脂動(dòng)員、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成以及細(xì)胞周期等幾個(gè)與種子萌發(fā)相關(guān)的途徑中，胚乳中的差異蛋白主要是與分解代謝相關(guān)的酶，負(fù)責(zé)給生長(zhǎng)中的胚提供營(yíng)養(yǎng)；而胚中的差異蛋白主要是與合成代謝相關(guān)的酶，負(fù)責(zé)利用胚乳提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為進(jìn)一步生長(zhǎng)服務(wù)[19]。

Liang等[20]等用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，配合葉綠素?zé)晒獾裙夂蠀?shù)，在低溫處理下麻瘋樹(shù)幼苗葉片中鑒定到8個(gè)有顯著變化的蛋白，其中包括與光合作用有關(guān)的ATP合成酶、FeS蛋白、過(guò)氧化氫酶 (CAT) 和谷胱甘肽還原酶 (GR) 等，并推測(cè)麻瘋樹(shù)對(duì)低溫的響應(yīng)可能更多地選擇CAT途徑。

3 功能基因分析和研究

3.1 油脂合成相關(guān)基因

麻瘋樹(shù)種子含油量豐富，脂肪酸組成和菜籽油非常相似，種子中提取的生物柴油可生物降解，比傳統(tǒng)的柴油更加清潔和高效，因此幾乎所有與麻瘋樹(shù)脂肪酸合成有關(guān)的蛋白基因都得到了相應(yīng)的研究。

乙酰輔酶 A 羧化酶 (Acetyl CoA carboxylase，ACCa) 廣泛存在于生物界，是催化乙酰輔酶A和羧化生成丙二酰輔酶A的生物素酶。此反應(yīng)制約著脂肪酸合成第一階段的速度，屬于脂肪酸合成的限速酶。從麻瘋樹(shù)中分離得到的ACCa基因長(zhǎng)1 149 bp，編碼383個(gè)氨基酸。將麻瘋樹(shù)幼苗分別置于pH 8.0和pH 7.0的生長(zhǎng)環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)在pH 8.0的培養(yǎng)條件下，葉片無(wú)論發(fā)育的早期、中期和晚期ACCa的表達(dá)量更高。相應(yīng)的，黑暗條件下果實(shí)中的ACCa的量也增加。如果施加高光脅迫，在果實(shí)發(fā)育的早、中和晚期ACCa的量發(fā)生顯著波動(dòng)，說(shuō)明ACCa基因表達(dá)與葉片和果實(shí)的生長(zhǎng)條件和發(fā)育階段有關(guān)[21]。從麻瘋樹(shù)中分離、鑒定的各類(lèi)基因信息詳見(jiàn)表1。

?；d體蛋白 (Acyl carrier protein，ACP)結(jié)合一系列的脂肪酸合成酶共同完成脂肪酸的碳鏈加長(zhǎng)反應(yīng)，在脂肪酸的合成過(guò)程中起核心作用。從麻瘋樹(shù)胚乳cDNA文庫(kù)中篩選分離得到的JcACP序列推測(cè)的氨基酸序列，與其他物種已知ACP氨基酸序列同源性不高，但是具有“LEEEF”和“LGLDSLDTVEVVMA”兩個(gè)保守區(qū)，這兩個(gè)區(qū)域正好是 4′-磷酸泛酰巰基乙胺輔基的結(jié)合位點(diǎn)，是酰基載體蛋白的特征區(qū)。該基因在葉、莖和種子中表達(dá)，在根中不表達(dá)，以種子中的表達(dá)量最高，并且種子萌發(fā)后其表達(dá)量隨萌發(fā)進(jìn)程遞增，在96 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，推測(cè)在種子中的這種高量表達(dá)可能與種子萌發(fā)時(shí)的代謝活動(dòng)有關(guān)[22]。

酮脂酰載體蛋白合成酶 (Ketoacyl-acyl carrier protein (ACP) synthase III，KAS III) 是催化細(xì)菌或質(zhì)體中脂肪酸合成中第一個(gè)延長(zhǎng)反應(yīng)的關(guān)鍵酶，而KAS I和KAS II分別催化ACP-4∶0到ACP-16∶0和ACP-16∶0到ACP-18∶0的碳鏈延伸[23]。過(guò)量表達(dá)KAS III的煙草、擬南芥和葡萄中 C16∶0的脂肪酸量都有增加[24]。?；?ACP硫酯酶 (Acyl-acyl carrier protein (ACP)thioesterase (TE)，F(xiàn)ATB) 能夠水解?；?ACP上的硫酯，釋放出脂肪酸和ACP，是控制脂肪酸長(zhǎng)鏈終止點(diǎn)的關(guān)鍵酶。研究發(fā)現(xiàn) JcKAS III和JcFATB1在基因組中都是單拷貝的，并且能夠在根、莖、葉、花和種子中表達(dá)，在種子萌發(fā)過(guò)程中基因的表達(dá)量也在逐漸增大，其中前者在根中的表達(dá)量最大，后者在種子中表達(dá)量最大[25-26]。在過(guò)量表達(dá) JcFATB1的擬南芥中檢測(cè)到飽和脂肪酸含量增加，特別是其中的棕櫚酸的量，而不飽和脂肪酸的量下降。因此，推測(cè)JcFATB1作為一個(gè)?；?ACP硫酯酶，能夠通過(guò)提高棕櫚酸含量改變麻瘋樹(shù)種子油的組分[26]。

硬酯酰載體蛋白去飽和酶 (Stearoyl-acyl carrier protein (ACP) desaturase，SAD) 定位在質(zhì)體基質(zhì)中，主要催化硬脂酰-ACP脫飽和成油酰-ACP，是控制高等植物脂肪酸中飽和與不飽和鍵比率的，這個(gè)比率的高低與植物的許多生理功能有關(guān)，特別是與植物的抗冷性相關(guān)[27]。麻瘋樹(shù)的JcSAD的氨基酸序列與蓖麻的相似度高達(dá)96%。JcSAD在根、莖、葉、花、果皮和種子都有表達(dá)，其中果皮和種子中表達(dá)量最大。通過(guò)原核表達(dá)獲得的JcSAD，能夠?qū)⑼庠从仓?ACP轉(zhuǎn)化成油酰-ACP，具有去飽和酶活性[28]。在利用病毒誘導(dǎo)基因沉默 (VIGS) 方法檢測(cè)麻瘋樹(shù)包括脂肪酸合成、發(fā)育調(diào)控、毒蛋白合成相關(guān)的13個(gè)基因功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，JcKAS II和JcFATB確實(shí)在脂肪酸鏈長(zhǎng)和飽和/不飽和比率中起重要作用，而且JcSAD1在種子的甘油三酯積累階段表達(dá)量較高[29]。

ω3 脂 肪 酸 去 飽 和 酶 (ω3-fatty acid desaturase，F(xiàn)AD3) 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和葉綠體中將二烯脂肪酸去飽和生成三烯脂肪酸的關(guān)鍵酶。三烯脂肪酸屬于多不飽和脂肪酸，是植物細(xì)胞膜的重要組成成分，葉綠體膜中的這種脂肪酸占到了總脂肪酸的80%。從擬南芥中分離得到定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的 FAD3，和定位在質(zhì)體中的 FAD7,8，其中FAD8與低溫響應(yīng)有關(guān)[30-31]。從麻瘋樹(shù)中克隆得到的JcFAD7的6個(gè)外顯子 (從第2個(gè)到第7個(gè))的大小與擬南芥的 FAD7,8是一樣的。在轉(zhuǎn)pYJcFAD7質(zhì)粒的酵母中加入亞油酸能檢測(cè)到新的C18∶3脂肪酸出現(xiàn)，且所占比例達(dá)到2.5%，說(shuō)明 JcFAD7編碼的脂肪酸去飽和酶能夠在 ω3的位置上將亞油酸去飽和，但是JcFAD7的表達(dá)與溫度變化無(wú)關(guān)[32]。圖1顯示各酶在麻瘋樹(shù)脂肪酸合成途徑中的基本位置和作用。

Xu等[33]利用實(shí)時(shí)定量PCR研究麻瘋樹(shù)種子發(fā)育過(guò)程中與脂肪酸和甘油三酯合成相關(guān)的 21個(gè)油脂基因，比較全面地了解到這些基因在種子發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)變化，為更好地研究麻瘋樹(shù)種子油脂積累提供了一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)信息。

圖1 麻瘋樹(shù)脂肪酸合成模型[27]Fig. 1 A model for fatty acid (FA) biosynthetic pathway in J. curcas[27].

磷酸烯酮式丙酮酸羧化 (Phophoenlpyuvate carboxylase，PEPcase) 主要參與植物 C4代謝途徑CO2固定作用。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)反義PEPC的轉(zhuǎn)基因大豆和水稻提高了籽粒的油脂含量[34-35]。目前，克隆到的JcPEPC屬于該基因家族中PEPC1，其蛋白為C3型PEPC，與蓖麻、陸地棉、橙、大豆、花生的氨基酸序列同源性都超過(guò) 90%[36]。推測(cè)通過(guò)反義抑制技術(shù)控制麻瘋樹(shù)PEPC基因的表達(dá)，可提高麻瘋樹(shù)種子含油量。

3.2 抗逆相關(guān)基因

3.2.1 毒蛋白基因curcin和curcin-L

不同來(lái)源的核糖體失活蛋白 (Ribosome inactivating proteins，RIPs) 在抗真菌、抗病毒和抗腫瘤方面表現(xiàn)出獨(dú)特的作用，具有十分重要的生物學(xué)功能。它們是一種能使核糖體28S rRNA的保守α莖環(huán)結(jié)構(gòu)域脫嘌呤的蛋白質(zhì)。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)兩種麻瘋樹(shù)RIP，分別是種子中的毒蛋白curcin和葉片中的逆境誘導(dǎo)蛋白 curcin-L。早在1976年 Stirpe等[37]就對(duì)麻瘋樹(shù)毒蛋白進(jìn)行了初步分離，并將其中有活性的產(chǎn)物命名為curcin1；此后林娟等[38]對(duì)該蛋白的毒性、編碼基因以及啟動(dòng)子進(jìn)行了更深入的研究。curcin只在種子的胚乳中積累，且表達(dá)始于心型胚時(shí)期，成熟時(shí)達(dá)到最高[39-40]。將該基因5'側(cè)翼區(qū)620 bp (EF612739)長(zhǎng)的片段插入pBI121載體，替換其中的 CaMV 35S啟動(dòng)子，并在相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因煙草中檢測(cè)報(bào)告基因 GUS的表達(dá)情況，結(jié)果顯示該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的 GUS在煙草種子胚乳中特異性表達(dá)，與它調(diào)控的curcin基因表達(dá)模式相似，其作用始于心形胚時(shí)期，并持續(xù)到種子成熟[41]。

另一個(gè) curcin-L在受脫落酸、水楊酸、干旱、高溫、低溫和 UV等脅迫誘導(dǎo)時(shí)在葉片中表達(dá)[40]。用 curcin-L基因 5'端 654 bp (EF612740)側(cè)翼序列替換pBI121轉(zhuǎn)煙草的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草的GUS表達(dá)量證實(shí)：它在葉片中特異表達(dá)，并且響應(yīng)以上 6種脅迫的誘導(dǎo)，其中對(duì)于PEG模擬的干旱響應(yīng)最明顯[42]。這些結(jié)果拓展了我們對(duì)麻瘋樹(shù)核糖體失活蛋白的了解，不僅有毒性蛋白 curcin，還有抗逆蛋白curin-L。

3.2.2 ERF轉(zhuǎn)錄因子基因 (JcERF) 和 DREB轉(zhuǎn)錄因子基因 (JcDREB)

盡管麻瘋樹(shù)在抗旱、耐鹽、耐貧瘠等方面表現(xiàn)突出，但是要想獲得果實(shí)高產(chǎn)且含油量高的種植結(jié)果，還必須對(duì)麻瘋樹(shù)抵御生物和非生物逆境反應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的研究，以期獲得耐受脅迫能力更強(qiáng)的植株。除了前面介紹的利用鹽敏感型酵母篩選麻瘋樹(shù)根部耐鹽基因的報(bào)道[16]以外，Tang等[43-44]先后從高鹽、干旱和低溫脅迫的幼苗葉片中克隆到了JcERF和JcDREB，研究發(fā)現(xiàn)它們均在高鹽、干旱、ABA等逆境脅迫條件下大量表達(dá)，在過(guò)量表達(dá)JcERF和JcDREB的擬南芥中顯示了比野生型更好的抗性特征，說(shuō)明這兩個(gè)基因在麻瘋樹(shù)忍受非生物脅迫中起重要作用。

3.2.3 肌醇-1-磷酸合成酶基因JcMIPS

肌醇-1-磷酸合成酶 (Myo-inositol-1-phosphatesynthase，MIPS) 在真核生物中是非常保守的，可催化 6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為肌醇-1-磷酸，是肌醇生物合成的限速酶[45]。肌醇作為一種重要的滲透保護(hù)物質(zhì)不僅是植物細(xì)胞中磷元素的主要貯存形式，而且在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、保護(hù)植物免受外部逆境傷害、激素貯存與運(yùn)輸?shù)确矫娑计鸬街匾饔谩Ｆ埓簩毜萚46]和Wang等[47]研究發(fā)現(xiàn)干旱、高鹽、低溫和 ABA脅迫不僅誘導(dǎo) JcMIPS的表達(dá)，還能使與 JcMIPS 5′端不同缺失片段相連的 GUS報(bào)告基因在煙草葉片原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)，說(shuō)明JcMIPS對(duì)各種逆境的響應(yīng)可能源于啟動(dòng)子的某個(gè)核心區(qū)域的調(diào)控。

3.2.4 水通道蛋白基因JcPIP和JcPIP2

植物水通道蛋白 (Aquaporin) 是水分快速進(jìn)出細(xì)胞的主要途徑。根據(jù)它們的分布和在細(xì)胞器上的定位不同將它們分為 4大類(lèi)，其中最常見(jiàn)的就是質(zhì)膜內(nèi)膜蛋白 (Plasma membrane intrinsic protein，PIPs) 和液泡膜內(nèi)膜蛋白(Tonoplast intrinsic protein，TIPs)。從麻瘋樹(shù)中克隆到的JcPIP和JcPIP2的氨基酸序列與蓖麻、葡萄和菠菜 PIP蛋白在進(jìn)化上親緣關(guān)系較近。將 JcPIP2互補(bǔ) RNA (complementary RNA，cRNA) 注入非洲爪蟾卵母細(xì)胞后改變了細(xì)胞膜的水通透性，說(shuō)明它具有水通道蛋白功能，它能夠在根、莖和葉中表達(dá)，但是只有JcPIP2在干旱脅迫條件下誘導(dǎo)表達(dá)[48]，JcPIP基因誘導(dǎo)表達(dá)變化不明顯[49]。

3.2.5 甜菜堿醛脫氫酶基因JcBD1

在植物、動(dòng)物、細(xì)菌和藻類(lèi)的許多物種中，甜菜堿作為一種無(wú)毒滲透劑，不僅能在水分虧缺時(shí)起到保護(hù)作用，還能在各種脅迫條件下維持蛋白和膜結(jié)構(gòu)。甜菜堿醛脫氫酶 (Betaine aldehyde dehydrogenase，BADH) 能催化甜菜堿醛不可逆的轉(zhuǎn)變?yōu)樘鸩藟A，是甜菜堿生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。該酶的基因JcBD1能在根、莖、葉、花和未成熟種子中表達(dá)，其中葉和莖中的表達(dá)量最高。Southern雜交分析發(fā)現(xiàn)該基因是多拷貝的，屬于一個(gè)多基因家族。在高鹽、高溫和干旱條件下，JcBD1的表達(dá)量明顯提高，表達(dá)JcBD1蛋白的大腸桿菌在高鹽環(huán)境中長(zhǎng)勢(shì)明顯好于對(duì)照[50]。

3.2.6 細(xì)胞質(zhì)II類(lèi)小熱激蛋白基因JcHSP17.5

多種脅迫環(huán)境下，生物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一組分子量大小在15~42 kDa的小熱激蛋白 (Small heat shock proteins，sHSPs)，它們具有分子伴侶的功能，能夠在不依賴(lài)ATP的情況下阻止在逆境脅迫下變性蛋白的累積以及保護(hù)蛋白的正確折疊，從而減少脅迫對(duì)生物的傷害[51]。從麻瘋樹(shù)胚乳cDNA文庫(kù)中篩選到一條編碼157個(gè)氨基酸的胞質(zhì)類(lèi)小熱激蛋白基因JcHSP17.5，該基因經(jīng)過(guò)在大腸桿菌以及釀酒酵母中過(guò)量表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)兩種重組菌在逆境下都較對(duì)照組生活力有顯著提高，有較好的耐熱和耐滲透脅迫能力，推測(cè)JcHSP17.5在麻瘋樹(shù)生長(zhǎng)過(guò)程中可能與麻瘋樹(shù)耐熱、耐旱以及耐離子脅迫相關(guān)[52]。

3.2.7 翻譯腫瘤調(diào)節(jié)腫瘤蛋白基因JcTCTP

翻譯腫瘤調(diào)節(jié)腫瘤蛋白 (Translationally controlledtumor protein，TCTP) 基因最早是從人類(lèi)腫瘤細(xì)胞中克隆到，發(fā)現(xiàn)其在翻譯水平上受到控制，因此得名[53]。目前對(duì)TCTP的研究主要集中在哺乳動(dòng)物和寄生蟲(chóng)中，對(duì)于植物中的 TCTP作用及其機(jī)制尚不清楚。但是在對(duì)JcTCTP表達(dá)模式的研究中發(fā)現(xiàn)它呈現(xiàn)一定的組織和時(shí)間特異性：在Ⅰ期胚乳、胚和莖中最為豐富，而在Ⅱ期胚乳和花中表達(dá)最弱[54]。它還受到高溫、NaCl和乙烯的誘導(dǎo)，推測(cè)可能與麻瘋樹(shù)耐高溫、耐貧瘠的特性有關(guān)[55]。

3.2.8 ADP核糖基化因子基因JcARF

ADP核糖基化因子 (ADP-ribosylation factor，ARF) 是小 G 蛋白家族 (RAS、RHO、RAB、ARF和 RAN) 的一員，它們參與諸如基因表達(dá)、細(xì)胞骨架重組和微管形成等生理活動(dòng)。從麻瘋樹(shù)cDNA文庫(kù)中篩選到的JcARF，編碼的預(yù)測(cè)蛋白具有典型的 GTP結(jié)合蛋白家族特有的P 框 (GLDAAGKT)、G′框(DVGGQ)和 G 框(NKQDL)。研究發(fā)現(xiàn) JcARF在花中的表達(dá)要比在根、莖、葉、胚乳中的表達(dá)豐富得多，此外該基因還受干旱、低溫的誘導(dǎo)，但是對(duì)NaCl脅迫不敏感[56]。后來(lái)還發(fā)現(xiàn)，乙烯利誘導(dǎo)提高的表達(dá)量比干旱和低溫的誘導(dǎo)更加明顯，JcARF可能與植物激素參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[57]。

3.3 發(fā)育相關(guān)基因

3.3.1 DOF轉(zhuǎn)錄因子基因JcDof1-3

擬南芥中 AtCDFs (CYCLING DOF FACTOR) 是一組研究得最清楚的參與光周期反應(yīng)調(diào)控開(kāi)花的Dof (DNA binding with one finger)轉(zhuǎn)錄因子[58-60]。在對(duì)它們的系列研究中發(fā)現(xiàn)，過(guò)量表達(dá) AtCDF1的轉(zhuǎn)基因擬南芥的開(kāi)花時(shí)間推遲，而轉(zhuǎn)反義OsRdd1-AS (與AtCDF的同源基因)的水稻表現(xiàn)出開(kāi)花推遲、植株矮小和種子變小的現(xiàn)象[61]。我們從麻瘋樹(shù)中克隆到3個(gè)Dof轉(zhuǎn)錄因子基因JcDof1-3，研究發(fā)現(xiàn)JcDof1和JcDof3的表達(dá)在長(zhǎng)日照和短日照條件下均呈現(xiàn)有規(guī)律的生物鐘振顫，但是在3 d的連續(xù)光照后，它們的表達(dá)呈現(xiàn)JcDof1量更高，而JcDof3波峰出現(xiàn)更早的情況，在與開(kāi)花調(diào)控有關(guān)的擬南芥蛋白FKF1、ZTL、ASK2、LKP2和GI的酵母雙雜交試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)JcDof1只與ASK2結(jié)合，而JcDof3能與ASK2和LKP2結(jié)合，說(shuō)明它們可能采取不同的蛋白降解途徑來(lái)調(diào)控麻瘋樹(shù)的開(kāi)花時(shí)間，推測(cè)它們?cè)谡{(diào)控麻瘋樹(shù)的開(kāi)花過(guò)程中扮演著既冗余又互補(bǔ)的角色[62-63]。如果能變麻瘋樹(shù)的持續(xù)開(kāi)花/結(jié)果特性為同步開(kāi)花/結(jié)果，將大大提高采收效率，為麻瘋樹(shù)的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展發(fā)展掃清道路，也是麻瘋樹(shù)育種方向之一。

3.3.2 F-Box蛋白基因JcFbl1

F-box蛋白廣泛存在于各種真核生物中，最早在酵母中研究發(fā)現(xiàn) F-box蛋白參與組成 SCF復(fù)合體，這個(gè)復(fù)合體又參與泛素降解途徑介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，經(jīng)過(guò)研究證明F-box蛋白一般都通過(guò)SCF復(fù)合體參與了植物生長(zhǎng)和發(fā)育的各種重要生理過(guò)程，如激素應(yīng)答、晝夜節(jié)律、光形態(tài)建成、抗逆性等。高帆等[64]從麻瘋樹(shù)胚乳cDNA文庫(kù)中篩選出一條與在動(dòng)、植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要調(diào)控作用的 F-box家族序列相似的EST序列，并進(jìn)一步克隆得到含有完整編碼框的 cDNA全長(zhǎng)和基因組序列，遺憾的是該文僅對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和構(gòu)建了真核表達(dá)載體，而對(duì)該蛋白可能參與的生理功能沒(méi)有進(jìn)一步的研究和發(fā)掘。

4 小結(jié)與展望

雖然關(guān)于麻瘋樹(shù)分子生物學(xué)方面的研究逐年增加，取得了很多可喜的成績(jī)，但是不得不承認(rèn)許多研究起步較晚，很多的基因組、轉(zhuǎn)錄組信息還有待進(jìn)一步分析鑒定。對(duì)于功能基因的分離、克隆多限于表達(dá)模式分析和原核表達(dá)階段，對(duì)于轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證方面的工作開(kāi)展較少，目前尚未見(jiàn)到油脂含量增加或是抗性提高的轉(zhuǎn)基因麻瘋樹(shù)的報(bào)道。因此，還必須對(duì)大量未知的和已知的基因和蛋白進(jìn)行更為詳盡的分析和鑒定，不僅僅是通過(guò)異源轉(zhuǎn)基因植物鑒定其功能，更重要的是找到提高脂肪酸含量、提高植株抗逆性和調(diào)控植株開(kāi)花時(shí)間的關(guān)鍵基因，為麻瘋樹(shù)育種和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展服務(wù)。

表1 麻瘋樹(shù)中分離鑒定的基因Table 1 Cloning and characterization of genes in J. curcas

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Received: March 24, 2010; Accepted: May 17, 2010

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2006AA10Z138).

Corresponding author: Gongshe Yang. Tel/Fax: +86-29-87092430; E-mail: gsyang999@hotmail.com

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2006AA10Z138) 資助。

Progress in molecular biology of Jatropha curcas

Jing Yang1, Yongping Liu1, Yun Liu2, and Mingfeng Yang3

1 School of Chemical Engineering and Environment, North University of China, Taiyuan 030051, Shanxi, China

2 Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

3 Key Laboratory of Urban Agriculture (North) of Ministry of Agriculture China, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China

楊靜, 劉永平, 劉蘊(yùn), 等. 麻瘋樹(shù)分子生物學(xué)研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2012, 28(6): 671?683.

Yang J, Liu YP, Liu Y, et al. Progress in molecular biology of Jatropha curcas. Chin J Biotech, 2012, 28(6): 671?683.

Received: November 25, 2011; Accepted: March 9, 2012

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 30972333), Initial Foundation of North University of China (No.2011-2012), Research Fund for the Doctor of North University of China (No. 2011-2012), Natural Science Foundation for Young Scientists of Shanxi Province (No. 2012021029-1).

Corresponding author: Mingfeng Yang. Tel: +86-10-80797308; E-mail: mfyang@bac.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 30972333)，中北大學(xué)?；?(No. 2011-2012)，中北大學(xué)博士啟動(dòng)基金 (No. 2011-2012)，山西省自然科學(xué)青年基金 (No.2012021029-1) 資助。