李楊 李棟

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所 北京蛋白質(zhì)組研究中心 蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

泛素連接酶-底物選擇關(guān)系的研究進(jìn)展

李楊 李棟

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所 北京蛋白質(zhì)組研究中心 蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

泛素是一種包含76個(gè)氨基酸的小分子蛋白。泛素共價(jià)結(jié)合到底物的過程稱為泛素化修飾。泛素化修飾過程是一個(gè)由級(jí)聯(lián)的泛素激活酶、泛素結(jié)合酶和泛素連接酶所介導(dǎo)的復(fù)雜過程，泛素化修飾具有高效、ATP依賴、高度特異的特點(diǎn)。泛素化修飾與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA損傷修復(fù)等一系列生物學(xué)過程密切相關(guān)。在泛素化修飾過程中，泛素連接酶對(duì)底物的識(shí)別，是決定泛素化修飾特異性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。泛素連接酶底物識(shí)別的相關(guān)機(jī)制研究不斷被報(bào)道，鑒定泛素連接酶底物的高通量方法也在不斷的改進(jìn)和發(fā)展。隨著實(shí)驗(yàn)研究的不斷深入，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的不斷產(chǎn)出，利用生物信息學(xué)進(jìn)行泛素連接酶底物的研究也開始受到關(guān)注。對(duì)泛素連接酶識(shí)別底物的相關(guān)機(jī)制、高通量泛素連接酶底物的鑒定方法、泛素連接酶底物的生物信息學(xué)研究和生物信息學(xué)在泛素連接酶底物研究中的發(fā)展方向進(jìn)行討論。

泛素化修飾；泛素連接酶；底物；生物信息學(xué)

DIO： 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.002

泛素（Ubiquitin）是真核生物中一種由76個(gè)氨基酸組成，僅8.5 kD的小分子調(diào)節(jié)蛋白，于1975年被發(fā)現(xiàn)［1］。泛素化是一種蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，是泛素共價(jià)結(jié)合到蛋白質(zhì)賴氨酸殘基上或者N末端的過程。泛素化修飾是一個(gè)多酶級(jí)聯(lián)的、消耗ATP的反應(yīng)。參與泛素化過程的酶包括泛素激活酶（E1，ubiquitin activating enzymes），泛素結(jié)合酶（E2，Ubiquitin conjugating enzymes），泛素連接酶（E3，ubiquitin ligases）［2］和去泛素化酶（Deubiquitinating enzyme，DUB）。泛素化修飾最為人們所熟知的功能是利用多聚泛素鏈標(biāo)記靶蛋白，介導(dǎo)被標(biāo)記蛋白的蛋白酶體降解［3］。泛素化修飾既能將單個(gè)的泛素修飾到底物，發(fā)生單泛素化（Monoubiquitination），也可以將利用泛素本身所包含的7個(gè)賴氨酸形成的多聚泛素鏈修飾到底物發(fā)生多聚泛素化（Polyuniquitination）。除了利用自身所具有的賴氨酸形成多聚泛素鏈，泛素還可以通過肽鍵形成線性的泛素鏈［4］。這些復(fù)雜的修飾形式?jīng)Q定了泛素化修飾在多種生物學(xué)過程中扮演重要角色。單泛素修飾影響細(xì)胞的膜運(yùn)輸、內(nèi)吞和病毒出芽等過程［5，6］；由48位賴氨酸（K48）形成的泛素鏈發(fā)生的修飾，主要介導(dǎo)蛋白質(zhì)的蛋白酶體降解；由63位賴氨酸（K63）形成的泛素鏈發(fā)生的修飾，與內(nèi)吞作用、炎癥響應(yīng)、蛋白質(zhì)翻譯和DNA修復(fù)相關(guān)。而其他形式的泛素鏈與細(xì)胞周期、溶酶體降解、激酶識(shí)別等一系列過程相關(guān)。

在泛素化修飾過程中，泛素連接酶對(duì)底物的選擇過程是泛素化調(diào)控特異性的關(guān)鍵。泛素連接酶負(fù)責(zé)將泛素或多聚泛素鏈從E2轉(zhuǎn)移到底物賴氨酸殘基或者蛋白質(zhì)N端殘基［7］，決定底物蛋白的命運(yùn)。泛素連接酶依據(jù)結(jié)構(gòu)的不同主要分為3類：RING類、HECT類、U-box類。目前已知的E3數(shù)目至少超過600種［8，9］，多于激酶的數(shù)量（518種）。泛素連接酶與眾多的生物學(xué)過程密切相關(guān)，如Pellino家族E3之前被認(rèn)為通過促進(jìn)IRAK1的泛素化調(diào)節(jié)天然免疫信號(hào)通路，最近研究表明，Pellino家族E3通過泛素化參與更多的先天和適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)，參與TLR信號(hào)通路的調(diào)控［10］；PRP19［11］、RNF4［12］、RNF8［13］等泛素連接酶參與DNA損傷應(yīng)答；SCF（FBW7）通過靶向MCL1發(fā)生泛素化降解調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡［14］；FBXO31介導(dǎo)Cyclin D1的降解，與細(xì)胞DNA損傷的G1期阻滯密切相關(guān)［15］。泛素化修飾幾乎調(diào)控真核細(xì)胞功能的所有方面。因此，泛素化修飾與許多疾病有密切關(guān)系：泛素連接酶Cbl-b和TAM受體能利用自然殺傷細(xì)胞調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［16］；FBXO11的失活會(huì)導(dǎo)致BCL6的過表達(dá)，從而引發(fā)彌散性巨型B細(xì)胞淋巴癌［17］；c-Cbl和Cbl-b對(duì)人的骨細(xì)胞形成和破壞起重要作用［18］。由于E3對(duì)底物識(shí)別具有特異性，是非常有潛力的藥靶。E3與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，通過干預(yù)E3的功能，可以對(duì)多種癌癥起到治療作用。目前，有多個(gè)團(tuán)隊(duì)正在研發(fā)針對(duì)泛素連接酶HDM2，或者干擾HDM2-p53相互作用的抑制劑以穩(wěn)定p53的表達(dá)，進(jìn)而用于腫瘤治療［19，20］。

E3與底物特異性的選擇機(jī)制和調(diào)控作用的發(fā)現(xiàn)，對(duì)揭示泛素化修飾所參與的細(xì)胞調(diào)控過程，理解泛素化修飾相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理，研發(fā)高特異性、低副作用的藥物具有重要意義?，F(xiàn)在對(duì)泛素連接酶底物的研究，主要采用分子生物學(xué)方法，通過體內(nèi)或體外的實(shí)驗(yàn)，尋找特定泛素連接酶底物。目前也建立了一些高通量的泛素連接酶底物鑒定方法，同時(shí)生物信息學(xué)研究也在泛素連接酶底物的發(fā)現(xiàn)中進(jìn)行了一些嘗試。這些研究為理解泛素連接酶與底物選擇關(guān)系，提供了多方面的幫助。本文將從泛素連接酶底物識(shí)別機(jī)制、鑒定泛素連接酶底物的高通量方法和泛素連接酶底物選擇關(guān)系的生物信息學(xué)研究3個(gè)方面對(duì)泛素連接酶和底物選擇關(guān)系的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 泛素連接酶底物識(shí)別機(jī)制

由于泛素連接酶數(shù)目眾多，并且存在大量復(fù)合體泛素連接酶。在泛素連接酶識(shí)別底物的過程中，有很多適配體參與其中。并且，泛素化修飾與多種其它翻譯后修飾存在著交互應(yīng)答，特別是與磷酸化修飾存在多種多樣的相互調(diào)控作用。這些原因都導(dǎo)致泛素連接酶對(duì)底物的識(shí)別機(jī)制變得異常復(fù)雜。

1.1 通過特定的序列特征識(shí)別底物

泛素連接酶對(duì)底物的識(shí)別，可能是由特定的序列所介導(dǎo)的。這里的序列主要指結(jié)構(gòu)域和motif。結(jié)構(gòu)域（Domain）是指蛋白中具有特定結(jié)構(gòu)的一段序列，結(jié)構(gòu)域通常為60-300個(gè)氨基酸長度。Motif（有翻譯為模體）是一些比較短的（通常小于10個(gè)氨基酸）、包含一些特定氨基酸的序列段［21］。目前有許多關(guān)于E3利用特定的domain或motif識(shí)別底物的特定motif或domain的研究報(bào)道。

APC/C復(fù)合體是一個(gè)由多個(gè)亞基組成的RING類復(fù)合體泛素連接酶，APC/C復(fù)合體利用Cdc20和Cdh1亞基作為底物識(shí)別亞基，Cdc20和Cdh1利用WD40 domain識(shí)別一些特定的motif識(shí)別底物。APC/C復(fù)合體識(shí)別底物的motif包括D-box motif和KEN-box motif。D-box motif又稱為RxxL motif，是指包含RxxL氨基酸的一段序列，其中x表示任意氨基酸。RxxL motif在所有哺乳動(dòng)物的PLK1同源蛋白中都出現(xiàn)，具有很高的保守性［22］。利用這個(gè)motif，APC/C復(fù)合體識(shí)別PLK1、ID2［23］等蛋白。KEN-box motif可識(shí)別多種底物，包括Cdc20，Cdc20上的KEN motif能被由Cdh1形成的APC/C復(fù)合體泛素連接酶所識(shí)別并泛素化［24］。通過KEN motif被識(shí)別的底物，包括與有絲分裂相關(guān)的中心體復(fù)制因子STIL［25］、與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的蛋白TRRAP［26］等。

HECT類泛素連接酶中也存在類似的底物識(shí)別機(jī)制，最典型的是NEDD4家族，人類的NEDD4家族包括9個(gè)成員：NEDD4、NEDD4-2/NED4L、ITCH、SMURF1、SMURF2、WWP1、WWP2、NEDL1及NEDL2［27］。該家族的E3結(jié)構(gòu)上類似，N端包含一個(gè)C2 domain，C端為HECT domain，中間段包含2-4個(gè)重復(fù)的WW domain。該家族能夠通過WW domain識(shí)別底物的PY motif［28］（包含PPxY序列的氨基酸段，x代表任意氨基酸），實(shí)現(xiàn)底物識(shí)別，如NEDD4-2能通過WW domain識(shí)別上皮細(xì)胞鈉離子通道的β和γ亞基的PY motif［29］。

但是蛋白上具有這些motif，并不是該蛋白被E3識(shí)別的必要條件。如Axin由SMURF1介導(dǎo)發(fā)生K29多聚泛素化，Axin上具有PY motif，但是通過研究發(fā)現(xiàn)，SMURF1上的WW結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏xin泛素化不是必須的，Axin并不被SMURF1上的WW domain所識(shí)別［30］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SMURF1上的C2 domain是泛素化Axin的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。另外，Zhi等［31］在對(duì)WWP1進(jìn)行綜述時(shí)也介紹了WWP1既能識(shí)別包含PY motif的底物，也能識(shí)別不包含PY motif的底物。并且給出了19個(gè)包含PY motif的底物和8個(gè)非PY motif的底物。在這些例子中，E3可能依賴一些人們所未知的motif對(duì)底物進(jìn)行識(shí)別，但是這些現(xiàn)象也說明了泛素連接酶與底物選擇關(guān)系的復(fù)雜性。

1.2 利用適配體識(shí)別底物

所謂適配體（Adaptor）是一些與E3和底物發(fā)生相互作用的蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，E3在調(diào)節(jié)底物泛素化的過程中，除了直接與底物結(jié)合，有時(shí)候還有一些適配體參與調(diào)節(jié)。這些適配體發(fā)揮多種多樣的功能。如TGFβ受體是一個(gè)復(fù)合體，能將信號(hào)跨膜傳遞給Smad信號(hào)通路。TGFβ能夠被Nedd4家族泛素連接酶SMURF1識(shí)別并降解。SMURF1并不是直接連接到TGFβ受體的亞基上，而是利用適配體Smad7結(jié)合TGFβ，并介導(dǎo)TGFβ的泛素化降解［32］。

RING類泛素連接酶中也存在類似的適配體，特別是復(fù)合體泛素連接酶，其多利用Cullin蛋白作為支架，連接用于識(shí)別E2的包含RING結(jié)構(gòu)域的蛋白（如ROC1）和用于底物識(shí)別的亞基（70多種F-box蛋白）。這些用于底物識(shí)別的亞基，某種意義上也可算作是識(shí)別底物的適配體。非復(fù)合體的RING類泛素連接酶TRAF6，也能夠利用p62蛋白，結(jié)合NGF受體TrkA，并介導(dǎo)TrkA的K63泛素化［33］。

除了作為E3和底物連接的支架，適配體還具有其他的作用，如激活或者抑制E3的活性，調(diào)節(jié)E3的細(xì)胞定位等。適配體所具有的這些豐富的功能，除了決定E3底物識(shí)別的特異性，一定程度上還決定了E3調(diào)控底物的時(shí)空特異性。

1.3 泛素化修飾與其他翻譯后修飾的cross-talk

泛素化修飾與其他翻譯后修飾存在廣泛的crosstalk。目前，研究最多的是泛素化與磷酸化間的crosstalk。磷酸化既可激活泛素化修飾，也可抑制泛素化修飾。如β-catenin和IκB都可被由Cul1、skp1和f-box蛋白β-TRCP組成的復(fù)合體E3所識(shí)別。但它們?cè)谕ǔ顟B(tài)下并不被該復(fù)合體E3所識(shí)別，當(dāng)IκB的第32位和第36位絲氨酸被磷酸化或當(dāng)β-catenin的第33位和第37位絲氨酸被磷酸化時(shí)，才能被由β-TRCP形成的復(fù)合體泛素連接酶所識(shí)別［34］。

在ITCH泛素連接酶的活性調(diào)控過程中，磷酸化發(fā)生了更廣泛的作用。ITCH并非組成型活化的泛素連接酶，前面所述ITCH泛素連接酶屬于NEDD4家族，ITCH會(huì)發(fā)生內(nèi)部折疊和自身相互作用，HECT domain會(huì)與WW domain發(fā)生連接，從而抑制ITCH的泛素連接酶活性。而激酶JNK1可以磷酸化ITCH的199位絲氨酸、222位蘇氨酸和232位絲氨酸，釋放與WW domain結(jié)合的HECT domain，激活I(lǐng)TCH的泛素連接酶活性。激活后的ITCH可以促進(jìn)JunB的泛素化。當(dāng)該過程需要被減弱或終止時(shí)，絡(luò)氨酸激酶Fyn能夠磷酸化ITCH的371位絡(luò)氨酸，這個(gè)位點(diǎn)位于WW domain，磷酸化修飾后ITCH將無法利用WW domain與底物的PY motif結(jié)合［35］，從而抑制ITCH的活性。

sumo化修飾是一種類泛素化修飾，同樣修飾底物上的賴氨酸位點(diǎn)。在DNA修復(fù)過程中，存在著兩種潛在的泛素化與sumo化修飾的cross-talk，第一種是PIAS可能sumo化RNF168和HERC2，HERC2的sumo化造成其內(nèi)部發(fā)生相互作用，使HERC2和RNF8組裝成復(fù)合體，這個(gè)復(fù)合體能夠配合RNF168在DNA損傷的位置附近的蛋白上形成泛素鏈。另一種潛在機(jī)制是PIAS介導(dǎo)MDC1的sumo化和DNA損傷位置附近蛋白的sumo化，sumo化的MDC1能夠募集RNF4，連同RNF8形成泛素鏈，并結(jié)合在之前修飾在DNA損傷位點(diǎn)附近蛋白上的sumo蛋白，形成sumo-泛素混合鏈［36］。除了與泛素化修飾協(xié)同，sumo化修飾還和泛素化修飾存在許多競(jìng)爭關(guān)系。泛素化修飾能夠促進(jìn)IKBα的蛋白酶體降解，而sumo化修飾能夠與IKBα的泛素化修飾發(fā)生競(jìng)爭，從而維持IKBα的穩(wěn)定［37］。

作為另外一種重要的類泛素化翻譯后修飾，NEDD8修飾與泛素化修飾之間也存在重要的crosstalk。NEDD8修飾重要的功能之一，就是促進(jìn)SCF復(fù)合體泛素連接酶的活性。但是NEDD8并不影響SCF復(fù)合體泛素連接酶的組裝，而是能夠幫助募集E2，從而達(dá)到促進(jìn)泛素化修飾的作用［38］。

甲基化修飾是組蛋白翻譯后修飾中研究最多的一類。某些組蛋白殘基可以通過甲基化抑制或激活基因表達(dá)，從而成為表觀遺傳。甲基化修飾的位點(diǎn)通常為精氨酸和賴氨酸。組蛋白同樣可以發(fā)生泛素化修飾，組蛋白的甲基化修飾和泛素化修飾之間，也存在著相互影響。如組蛋白H2B的123位賴氨酸能夠發(fā)生泛素化修飾，該修飾幫助起始組蛋白H3的79位甲基化修飾。組蛋白H3的79位甲基化修飾需要酶Dot1的輔助，而Dot1促進(jìn)組蛋白H3的79位甲基化，同時(shí)能夠抑制組蛋白H2B的123位泛素化修飾，從而形成反饋調(diào)節(jié)回路，控制組蛋白H3的甲基化修飾水平［39，40］。

磷酸化、甲基化等和多種類泛素化修飾與泛素化修飾之間的cross-talk，對(duì)泛素化修飾產(chǎn)生了幫助E3識(shí)別底物、激活或抑制E3活性、促進(jìn)泛素鏈形成、調(diào)控組蛋白甲基化修飾等一系列的調(diào)控作用，這些調(diào)控存在非常精細(xì)的機(jī)制，使得泛素化修飾和其他翻譯后修飾的發(fā)生不僅具有底物選擇的特異性，更具有了時(shí)空的特異性。這些翻譯后修飾借助它們之間的協(xié)同或抑制關(guān)系，通過功能的組合，發(fā)揮更多樣的調(diào)控作用。

2 鑒定泛素連接酶底物的高通量方法

泛素的得名是因其在生物體內(nèi)廣泛的存在。而數(shù)目眾多的E3也決定了泛素化修飾在體內(nèi)是大量發(fā)生的。傳統(tǒng)的泛素連接酶底物鑒定試驗(yàn)方法，多集中于對(duì)單個(gè)E3和少數(shù)底物的選擇關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究和驗(yàn)證，這樣的研究方法雖能比較精確的得到E3和底物的選擇關(guān)系，但實(shí)驗(yàn)通量低，難以達(dá)到全面研究泛素連接酶和底物選擇關(guān)系的目的。近些年來，一些高通量實(shí)驗(yàn)方法可以進(jìn)行較大規(guī)模的泛素連接酶的底物發(fā)現(xiàn)。這些方法包括基于蛋白全局穩(wěn)定性分析（Global protein stability profiling，GPS）、基于蛋白質(zhì)微陣列和基于質(zhì)譜技術(shù)等的一系列方法。

2.1 基于全局蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析方法

蛋白質(zhì)全局穩(wěn)定性分析方法，巧妙地將編碼紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白的核酸序列構(gòu)建在同一個(gè)腺病毒載體上，并且在兩個(gè)熒光蛋白之間加入核糖體入口，將編碼綠色熒光蛋白的核酸和編碼目標(biāo)蛋白的核酸構(gòu)建在一起，利用該腺病毒侵染宿主細(xì)胞，就能夠在宿主細(xì)胞中等比例的表達(dá)紅色熒光蛋白和帶綠色熒光蛋白的靶蛋白，如果靶蛋白被降解，則紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白的比例會(huì)發(fā)生變化，利用流式細(xì)胞技術(shù)，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析［41］。

Hsueh-Chi等［42］利用顯性失活突變技術(shù)，替代RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建顯性失活的Cul1，Cul1是構(gòu)成SCF復(fù)合體泛素連接酶的支架蛋白，如果Cul1失活，即便底物識(shí)別亞基能夠識(shí)別并結(jié)合底物，也無法將泛素修飾到底物。通過多輪的流式細(xì)胞篩選，最后鑒定出因?yàn)镃ul1失活，而導(dǎo)致蛋白質(zhì)豐度發(fā)生顯著變化的蛋白，作為潛在的底物。利用該方法鑒定到了大于350個(gè)潛在的底物，并且鑒定到了大部分已知的底物。利用GSP方法鑒定泛素連接酶底物能夠鑒定穩(wěn)定性發(fā)生變化的底物蛋白。但是造成泛素連接酶底物降解的泛素化修飾主要是K48泛素鏈修飾，K63泛素鏈主要和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。所以針對(duì)K63位泛素鏈或者其他非降解的泛素化修飾形式，難以有效使用該方法。

2.2 基于蛋白質(zhì)微陣列的泛素連接酶底物鑒定

基于蛋白質(zhì)微陣列的泛素連接酶底物鑒定技術(shù)，主要是通過構(gòu)建體外的泛素化體系，對(duì)構(gòu)建在微陣列上的蛋白質(zhì)進(jìn)行泛素化實(shí)驗(yàn)，之后利用多種方法進(jìn)行檢測(cè)和分析。如Andrews等［43］利用蛋白質(zhì)微陣列鑒定了SMURF1的底物。通過給泛素連接上生物素標(biāo)簽，泛素分子可以利用streptavidin-Alexa Flour進(jìn)行熒光檢測(cè)，通過熒光判斷是否發(fā)生了泛素化。利用該方法，共有89個(gè)潛在的SMURF1底物被鑒定。Loch等［44］利用兩塊微陣列板，使用兩種泛素抗體與泛素發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。一種既能結(jié)合單泛素，又能結(jié)合多聚泛素鏈；一種只能結(jié)合多聚泛素鏈。通過進(jìn)一步的GO分析，選取了部分結(jié)果作為進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的備選底物。

基于蛋白質(zhì)微陣列方法鑒定泛素連接酶底物，相比GPS方法簡單且高效，并且通過采用合適的泛素鑒定方法，可以不受所修飾泛素鏈形式的影響。但是利用蛋白質(zhì)微陣列進(jìn)行泛素連接酶底物鑒定，需要構(gòu)建體外的泛素化體系，篩選合適的E2，然而根據(jù)前面所述，泛素化修飾可能受到其他翻譯后修飾的調(diào)控，泛素化的發(fā)生也具有一定的時(shí)空特異性，這些在體外泛素化修飾實(shí)驗(yàn)中難以模擬。另一方面，利用蛋白質(zhì)微陣列進(jìn)行底物鑒定，所能覆蓋的底物規(guī)模，受到微陣列本身的限制。所以基于蛋白微陣列進(jìn)行泛素連接酶底物的鑒定，主要用于為后續(xù)更深入的研究進(jìn)行初步的底物篩選。

2.3 基于噬菌體展示技術(shù)的泛素連接酶底物鑒定

噬菌體展示（Phage display）技術(shù)是一種高通量的研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-肽段、蛋白質(zhì)-DNA相互作用的方法。噬菌體展示技術(shù)的原理是將需要研究的蛋白或多肽的基因與噬菌體表面蛋白的編碼基因融合，經(jīng)過表達(dá)并裝配成噬菌體后，待研究蛋白或多肽會(huì)以融合蛋白的形式呈現(xiàn)在噬菌體表面。而導(dǎo)入了多種蛋白的一群噬菌體，就構(gòu)成了一個(gè)噬菌體展示文庫。利用噬菌體展示技術(shù)對(duì)泛素連接酶底物進(jìn)行篩查，首先需要進(jìn)行陰性選擇。將人腦cDNA展示文庫與僅包含E1、E2和His標(biāo)簽泛素，而不包含E3的體外泛素化系統(tǒng)以及Ni-beads共同孵育。收集沒有與Ni-beads結(jié)合的噬菌體，并用它們感染BLT5403大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后的文庫用于陽性篩選。在陽性篩選過程中，將之前擴(kuò)增的文庫與包含E3的體外泛素化系統(tǒng)及Ni-beads共同孵育，Ni-beads會(huì)結(jié)合His標(biāo)簽，所以發(fā)生泛素化修飾的噬菌體會(huì)被Ni-beads所捕獲。將這些噬菌體從Ni-beads上洗脫后，用這些噬菌體感染BLT5403大腸桿菌擴(kuò)增，再重復(fù)進(jìn)行陰性、陽性篩選，經(jīng)過多輪篩選后，單克隆的噬菌體利用PCR進(jìn)行測(cè)序，從而得到E3的底物序列［45］。

該技術(shù)的原理決定它可以對(duì)非降解的泛素連接酶底物進(jìn)行考察，并且只要能夠構(gòu)建E3對(duì)應(yīng)的體外泛素化修飾系統(tǒng)，理論上就可以對(duì)底物進(jìn)行篩查。但該技術(shù)與利用蛋白質(zhì)微陣列鑒定泛素連接酶底物的原理類似，所以也存在和利用蛋白微陣列進(jìn)行泛素連接酶底物鑒定存在類似的限制。

2.4 基于質(zhì)譜技術(shù)的泛素連接酶底物鑒定

基于質(zhì)譜技術(shù)的泛素連接酶底物鑒定包括多種方法，這些方法之間存在較大差異，其共同點(diǎn)是最后都是通過質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。Yumimoto等［46］發(fā)展了一種利用差異蛋白質(zhì)組鑒定F-box構(gòu)成的復(fù)合體泛素連接酶底物的方法DiPIUS。這兩種方法首先都需要構(gòu)建野生型和突變的F-box蛋白，并且給它們帶上FLAG標(biāo)簽。突變的F-box蛋白不能與skp1結(jié)合，也就不能構(gòu)成完整的SCF泛素連接酶復(fù)合體，無法介導(dǎo)底物發(fā)生泛素化。第一種方法是將F-box在分別用12C和13C標(biāo)記的細(xì)胞中表達(dá)，利用MG132抑制蛋白酶體。然后通過免疫共沉淀技術(shù)同時(shí)對(duì)野生型和突變型F-box蛋白進(jìn)行沉淀，經(jīng)過酶切后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組分析。另一種方法，將兩種F-box蛋白分別在不標(biāo)記的細(xì)胞中表達(dá)，然后分別用免疫共沉淀技術(shù)對(duì)F-box蛋白進(jìn)行沉淀。利用SDS-PAGE蛋白電泳分離蛋白，酶切后分別進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組分析。利用該方法，作者對(duì)Fbxw7α、Skp2和Fbx15的底物進(jìn)行了鑒定，得到一些先前已知的底物，如Fbxw7α的底物c-Myc、Skp2底物p27、Fbx15底物IPR1和IPR2，證明了方法的有效性。

另一種利用質(zhì)譜鑒定底物的方法，是利用串聯(lián)的UBA富集泛素的方法進(jìn)行底物鑒定。UBA結(jié)構(gòu)域是泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能夠結(jié)合泛素。Shi等［47］曾利用4個(gè)串聯(lián)的UBA拷貝富集泛素化蛋白，并通過質(zhì)譜技術(shù)鑒定泛素化修飾位點(diǎn)。Rubel等［48］進(jìn)一步利用4個(gè)串聯(lián)的UBA domain進(jìn)行泛素化蛋白的富集，首先分離新生大鼠心肌細(xì)胞，作為用于后續(xù)泛素化試驗(yàn)的細(xì)胞系。將大鼠的MuRF1泛素連接酶包裝成帶Myc標(biāo)簽的腺病毒，然后侵染之前分離的細(xì)胞系，分別向?qū)φ战M和試驗(yàn)組加入串聯(lián)了4個(gè)UBA拷貝的瓊脂糖珠（TUBE組）和不帶UBA結(jié)構(gòu)域的瓊脂糖珠（Control組）。孵育一段時(shí)間后進(jìn)行分離，從瓊脂糖珠上分離蛋白（eluate），并保留上清液（Supernatant），分別做3組2維凝膠電泳：Control TUBE eluate VS Experiment TUBE eluate；Experiment TUBE supernatant VS Experiment agrose control supernatant；Control TUBE supernatant VS Control agarose control supernatant。如果鑒定E3的底物，第1組選取Ctrleluate＜Expeluate，第2組選取Expctrl＞ExpTUBE，第3組選取Ctrlctrl＞CtrlTUBE的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。鑒定后前兩組得到的是發(fā)生泛素化的蛋白，第3組得到的是組成型泛素化的底物。通過去冗余分析，可以得到待研究泛素連接酶的底物。如果利用該方法進(jìn)行DUB底物鑒定，只需要在對(duì)凝膠電泳后的結(jié)果進(jìn)行蛋白選取時(shí)遵循相反的原則即可。

質(zhì)譜方法進(jìn)行泛素連接酶底物的鑒定，分離和獲得潛在底物蛋白的方法多種多樣，最后都需要通過質(zhì)譜技術(shù)對(duì)底物蛋白進(jìn)行鑒定。所以利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定底物蛋白，鑒定的覆蓋率和準(zhǔn)確性受到質(zhì)譜技術(shù)本身的影響和制約。

2.5 基于NEDD8修飾鑒定泛素連接酶底物

在之前討論泛素化修飾與其他翻譯后修飾的交互中，介紹過NEDD8修飾是一種類泛素化修飾，可將類泛素分子NEDD8修飾到底物的賴氨酸殘基上。利用這一性質(zhì)，Zhuang等［49］開發(fā)了一種鑒定泛素連接酶底物的方法。直接鑒定泛素連接酶的底物有一些困難，如泛素化底物通常較多，所以如果要直接鑒定某一種泛素連接酶的底物，可能受到其他泛素化修飾的干擾。而NEDD8修飾相比泛素化修飾，是一種細(xì)胞內(nèi)比較稀少的修飾，為了鑒定IAP泛素連接酶的底物，Zhuang等巧妙的將NEDD8的結(jié)合酶Ubc12與IAP泛素連接酶進(jìn)行了融合。融合后的蛋白可以將NEDD8修飾到原本應(yīng)該修飾泛素的底物賴氨酸。通過鑒定被NEDD8修飾的蛋白，就可以鑒定到泛素連接酶的底物。利用該方法，有50多個(gè)IAP泛素連接酶的底物被鑒定。

該方法設(shè)計(jì)非常巧妙，并且利用NEDD8修飾代替泛素化修飾，避免了泛素化修飾底物鑒定中的一些困難。但是泛素蛋白和NEDD8蛋白的空間結(jié)構(gòu)存在著一些差異，可能導(dǎo)致該方法存在一定的假陽性和假陰性問題。

3 泛素連接酶底物選擇關(guān)系的生物信息學(xué)研究

隨著泛素連接酶與底物選擇關(guān)系研究的不斷深入，以及高通量鑒定泛素連接酶底物方法的不斷產(chǎn)生和發(fā)展，大量的泛素連接酶和底物選擇關(guān)系的研究數(shù)據(jù)不斷產(chǎn)出。隨之也產(chǎn)生了幾個(gè)對(duì)泛素連接酶和底物關(guān)系進(jìn)行收錄的數(shù)據(jù)庫。另一方面，隨著數(shù)據(jù)的不斷積累，利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行泛素連接酶底物的研究和預(yù)測(cè)變得可能。

3.1 收錄泛素連接酶和底物選擇關(guān)系的數(shù)據(jù)庫

E3net（http：//pnet.kaist.ac.kr/e3net/）是一個(gè)以E3為中心，收錄泛素連接酶及其底物的數(shù)據(jù)庫［50］，E3net收錄了來自人、小鼠、酵母等多個(gè)物種的2 201個(gè)E3和4 896個(gè)底物數(shù)據(jù)。以人為例，收錄了415個(gè)E3和1 590個(gè)底物數(shù)據(jù)，其中190個(gè)E3包含有對(duì)應(yīng)的底物信息。E3net的數(shù)據(jù)由對(duì)PubMed數(shù)據(jù)庫的文獻(xiàn)摘要的文本挖掘、對(duì)UniProt數(shù)據(jù)庫注釋信息的文本挖掘、對(duì)公共泛素化數(shù)據(jù)庫的整合和少量對(duì)高通量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的整合構(gòu)成。E3net通過以E3或底物為中心瀏覽數(shù)據(jù)條目，提供了E3或底物的UniProt訪問號(hào)、描述該蛋白為E3或底物的文獻(xiàn)語句或UniProt注釋、通路信息、參與的生物學(xué)過程、功能、家族、定位、相關(guān)疾病等信息。如果該蛋白有對(duì)應(yīng)的底物或E3信息，則會(huì)提供描述它們之間特異性選擇關(guān)系的文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫信息。為了更全面的了解E3對(duì)底物的調(diào)控信息，E3net還利用數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)構(gòu)建了一個(gè)E3和底物的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。用戶可以可視化的對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行瀏覽。

E3net數(shù)據(jù)庫是目前收錄E3和底物選擇關(guān)系最全面的數(shù)據(jù)庫，其數(shù)據(jù)具有多個(gè)來源，數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。E3net中收錄了許多復(fù)合體的E3，數(shù)據(jù)庫對(duì)這些復(fù)合體的亞基進(jìn)行了系統(tǒng)收錄并且特別標(biāo)示了復(fù)合體中負(fù)責(zé)底物識(shí)別的亞基。利用其構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)可以方便的對(duì)E3和底物的相互選擇關(guān)系進(jìn)行瀏覽，幫助進(jìn)行E3底物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究。但是數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)自2012年之后沒有更新，也沒有提供數(shù)據(jù)提交功能，不利于用戶幫助補(bǔ)充數(shù)據(jù)，并且不提供數(shù)據(jù)的下載。

hUbiquitome（http：//202.38.126.151/hmdd/hubi）數(shù)據(jù)庫是一個(gè)旨在收錄高可信實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的人類泛素化酶和底物數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫［51］。數(shù)據(jù)庫由于對(duì)數(shù)據(jù)的要求標(biāo)準(zhǔn)比較嚴(yán)格，所有數(shù)據(jù)經(jīng)過人工校驗(yàn)，所以數(shù)據(jù)量相對(duì)較小。包含1個(gè)E1、12個(gè)E2、138個(gè)E3、279個(gè)底物和17個(gè)DUB數(shù)據(jù)。hUbiquitome所有數(shù)據(jù)基于PubMed數(shù)據(jù)庫中的文獻(xiàn)獲得。hUbiquitome支持通過blast方式，利用序列信息搜索相關(guān)的泛素化酶與底物數(shù)據(jù)。hUbiquitome提供了全部數(shù)據(jù)的下載，這相比前面介紹的E3net數(shù)據(jù)庫，極大地方便了研究者利用hUbiquitome數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進(jìn)行更深入的泛素化機(jī)制討論。hUbiquitome數(shù)據(jù)庫提供了用戶提交數(shù)據(jù)的功能。讓用戶可以參與進(jìn)行數(shù)據(jù)庫的完善和補(bǔ)充。但是用戶無法在線提交數(shù)據(jù)，需要通過填寫表格后郵件發(fā)送給作者的方式提交數(shù)據(jù)，這在一定程度上會(huì)影響用戶提交數(shù)據(jù)的積極性。hUbiquitome數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)自2011年10月后無更新。

SCUD（http：//scud.kaist.ac.kr/）數(shù)據(jù)庫是一個(gè)收錄酵母的泛素化相關(guān)酶與底物的數(shù)據(jù)庫［52］。數(shù)據(jù)庫包含42個(gè)不同的E3和940個(gè)底物，并對(duì)E3進(jìn)行了分類，但是該數(shù)據(jù)庫物種比較局限。除了上面介紹的這些數(shù)據(jù)庫外，泛素化相關(guān)的數(shù)據(jù)庫還有收錄實(shí)驗(yàn)產(chǎn)出的底物和位點(diǎn)信息的Ubiprot數(shù)據(jù)庫［53］、收錄植物泛素化酶系統(tǒng)的plantsUPS［54］、收錄植物泛素化相關(guān)通路的數(shù)據(jù)庫plantsUBQ等。

3.2 利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行泛素連接酶底物的研究和預(yù)測(cè)

TRAF6是一個(gè)RING類E3，p62可以作為泛素連接酶TRAF6的適配體蛋白，幫助識(shí)別并結(jié)合底物。Jadhav等［55］通過對(duì)TRAF6/p62已知的兩個(gè)底物NRIF和TrKA進(jìn)行分析，總結(jié)出了一個(gè)包含10個(gè)氨基酸的motif：［-hydrophobic-k-hydrophobic-x-xhydrophobic-polar1-hydrophobic-polar2-hydrophobic-］進(jìn)行底物的預(yù)測(cè)。該研究收集了155個(gè)p62的相互作用蛋白和54個(gè)不發(fā)生相互作用的蛋白，利用bruteforce比對(duì)算法，對(duì)這些蛋白上K附近的氨基酸進(jìn)行motif匹配。根據(jù)匹配結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了一些可能以p62作為橋接蛋白的TRAF6底物。Jadhav等［55］的研究是較早利用生物信息學(xué)進(jìn)行E3底物研究的工作，具有一定的開創(chuàng)性。

Liu等［56］建立了一種利用KEN-box和D-box motif預(yù)測(cè)APC/C復(fù)合體E3底物的方法。通過考察文獻(xiàn)，共有68個(gè)APC/C底物中的74個(gè)D-box motif數(shù)據(jù)和42個(gè)APC/C底物中的44個(gè)KEN-box motif數(shù)據(jù)被收集作為金標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)集。作者定義滿足這兩個(gè)motif的序列，以及上下游的m，n個(gè)氨基酸組成一個(gè)ARM（m，n），采用了之前發(fā)展的GPS方法［57，58］，通過訓(xùn)練窗口大小（即選取合適的m值和n值）、位點(diǎn)權(quán)重和對(duì)打分矩陣進(jìn)行點(diǎn)突變，建立預(yù)測(cè)模型。利用這個(gè)模型，可考察包含KEN-box和D-box的蛋白是否是APC/C復(fù)合物的底物，以及匹配這兩個(gè)motif的區(qū)域是否是APC/C的識(shí)別區(qū)域。

但是利用這兩種生物信息學(xué)方法進(jìn)行泛素連接酶底物的預(yù)測(cè)都是借助E3識(shí)別底物的motif進(jìn)行的，然而目前對(duì)泛素連接酶識(shí)別底物的motif研究還比較少，所以前面介紹的兩項(xiàng)工作都只針對(duì)單個(gè)泛素連接酶的底物進(jìn)行討論。

4 泛素連接酶底物選擇關(guān)系研究展望

泛素化修飾作為一種重要的翻譯后修飾，參與了大部分生物學(xué)過程。泛素化修飾具有多樣的修飾形式，可以發(fā)揮多種多樣的功能。隨著泛素化相關(guān)研究的不斷發(fā)展，泛素連接酶底物高通量鑒定技術(shù)的不斷推進(jìn)，對(duì)泛素連接酶底物的研究將更加的深入，實(shí)驗(yàn)方法將更加的高效和可靠，隨之，將會(huì)有大量的泛素連接酶與底物選擇關(guān)系數(shù)據(jù)持續(xù)產(chǎn)出。隨著這些數(shù)據(jù)的積累，生物信息學(xué)方法有望在泛素連接酶底物選擇關(guān)系包括泛素連接酶底物生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、泛素連接酶底物數(shù)據(jù)庫構(gòu)建和大規(guī)模發(fā)現(xiàn)泛素連接酶底物方面發(fā)揮重要作用。

4.1 泛素連接酶底物的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

生物信息學(xué)在蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測(cè)領(lǐng)域取得了很好的效果，并且隨著時(shí)間的推進(jìn)不斷的有高水平文獻(xiàn)產(chǎn)出［59-62］。隨著蛋白質(zhì)相互作用研究的不斷深入，蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測(cè)不斷加入新的特征，效果不斷提高。而泛素連接酶與底物的選擇關(guān)系本質(zhì)上是一種特殊的蛋白質(zhì)相互作用。所以通過借鑒蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測(cè)的方法，結(jié)合泛素化修飾具有的性質(zhì)和生物學(xué)特征，對(duì)泛素連接酶底物進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，是很有潛力的研究方向。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)泛素連接酶底物，相比實(shí)驗(yàn)方法，花費(fèi)少，效率高。甚至可以利用生物信息學(xué)對(duì)全基因組進(jìn)行掃描，構(gòu)建基于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的泛素連接酶底物選擇網(wǎng)絡(luò)，這將對(duì)深入認(rèn)識(shí)泛素連接酶底物選擇機(jī)制和輔助實(shí)驗(yàn)人員篩選泛素連接酶底物研究對(duì)象提供很大的幫助。

4.2 泛素連接酶底物選擇關(guān)系數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建

雖然目前已建立了E3net、hUbiquitome等收錄泛素連接酶底物選擇關(guān)系的數(shù)據(jù)庫，但收錄的數(shù)據(jù)或來自對(duì)文獻(xiàn)進(jìn)行的文本挖掘，或來自人工對(duì)文獻(xiàn)的閱讀和整理，這些數(shù)據(jù)庫往往存在數(shù)據(jù)量較小、數(shù)據(jù)庫維護(hù)較差、數(shù)據(jù)更新不及時(shí)的問題。而泛素連接酶底物數(shù)據(jù)不斷產(chǎn)出，大量數(shù)據(jù)未被很好地收錄。所以構(gòu)建一個(gè)數(shù)據(jù)規(guī)模較大，更新及時(shí)的泛素連接酶底物數(shù)據(jù)庫非常必要。并且可以借鑒相互作用數(shù)據(jù)庫，為實(shí)驗(yàn)人員提供數(shù)據(jù)提交平臺(tái)，讓實(shí)驗(yàn)人員在使用數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的同時(shí)參與到數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)補(bǔ)充中來。另外可以借鑒STRING數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建方式［63］，將預(yù)測(cè)得到的數(shù)據(jù)加入數(shù)據(jù)庫，以幫助實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，并且可以通過實(shí)驗(yàn)人員驗(yàn)證預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)。

4.3 大規(guī)模發(fā)現(xiàn)泛素連接酶底物

大規(guī)模泛素連接酶底物的發(fā)現(xiàn)需要進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)工作。可以利用生物信息學(xué)輔助實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，降低實(shí)驗(yàn)規(guī)模。隨著生物信息學(xué)預(yù)測(cè)泛素連接酶底物技術(shù)的不斷發(fā)展，如果能夠取得接近高通量實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和覆蓋度，那么利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，進(jìn)行底物的初步篩選，可以減少實(shí)驗(yàn)研究的工作量，降低實(shí)驗(yàn)成本。或者可以利用生物信息學(xué)方法，采取一定的策略，進(jìn)行合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，如借鑒酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中用到的smart pooling［64］方法，借助生物信息學(xué)設(shè)計(jì)合理的實(shí)驗(yàn)分組方案，在降低實(shí)驗(yàn)次數(shù)的同時(shí)，保證一定的實(shí)驗(yàn)重復(fù)，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Advances in the Selective Relationship Between Ubiquitin Ligases and Substrates

Li Yang Li Dong
（State Key Laboratory of Proteomics，Beijing Proteome Research Center，Beijing Institute of Radiation Medicine，Beijing 102206）

Ubiquitin is a small-molecule protein composed of 76 amino acids. The covalent-bonding process between ubiquitin and substrates is defined as Ubiquitination. Ubiquitination modification， an efficient， ATP-dependent， and highly specific process， is mediated by a cascade regulation of ubiquitin activating enzymes， ubiquitin conjugating enzymes， ubiquitin ligase and deubiquitinating enzymes. Ubiquitination is highly relevant with biological processes like cell cycle regulation， cell apoptosis， transcription regulation， DNA damage response and so on. In the process of ubiquitination， the recognition between ubiquitin ligases and substrates is critical for the specificity. The mechanisms of such recognition are being reported moreover the high throughput methods identifying E3’s substrate are being improved and developed. With the accumulation of ubiquitination data from the deep-going research， the bioinformatics approach studying the selective relationship between E3s and substrates is becoming a hot spot. This article will discuss the recognition mechanism between E3s and substrates， the high throughput methods used for the identification of E3’s substrates， review the bioinformatics study about E3s’ substrates and highlight the future research direction.

ubiquitination；ubiquitin-ligase；substrate；bioinformatics

2014-06-09

國家重大科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2012CB910300， 2011CB910202），國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（“863”計(jì)劃）（2012AA020201），國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31271407），國際科技合作與交流專項(xiàng)（2014DFB30020）

李楊，碩士研究生，研究方向：泛素連接酶底物的生物信息學(xué)；E-mail：liyang_bprc@163.com

李棟，博士，副研究員，研究方向：蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)；E-mail：lidong.bprc@foxmail.com