王維 張玉娟 陳潔 劉聚波 夏民旋 沈法富

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安 271018）

植物逆境脅迫相關(guān)miRNA研究進(jìn)展

王維 張玉娟 陳潔 劉聚波 夏民旋 沈法富

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安 271018）

MicroRNAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性小分子的非編碼RNA，它通過(guò)對(duì)其靶基因mRNA的降解或抑制翻譯來(lái)調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)控植物相關(guān)生理活動(dòng)。在逆境脅迫下，植物中的一些miRNA通過(guò)迅速表達(dá)并作用于某些與逆境相關(guān)的基因，以啟動(dòng)植物的某些抗逆信號(hào)系統(tǒng)，進(jìn)而提高植物對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)能力。就miRNA的產(chǎn)生、作用方式、研究方法及其在植物在逆境脅迫中的抗逆作用機(jī)制研究進(jìn)行了綜述，并對(duì)植物miRNA的研究發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

MicroRNA；脅迫；生物信息學(xué)；靶基因；基因調(diào)控

DIO： 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.001

逆境脅迫是限制作物生長(zhǎng)、影響產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一。逆境脅迫分為生物逆境和非生物逆境，生物逆境主要包括病害和蟲害；非生物逆境包括養(yǎng)分脅迫、干旱脅迫、水分脅迫、高溫脅迫和低溫脅迫等［1］。MicroRNA（簡(jiǎn)稱miRNAs）是長(zhǎng)度為20-25 nt的內(nèi)源RNA，最早由Lee等在線蟲（Caenorhabditis elegans L.）中發(fā)現(xiàn)［2-4］，后來(lái)利用直接克隆測(cè)序和生物信息學(xué)等方法在許多高等植物中發(fā)現(xiàn)了大量的miRNA，如擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）［5］、苔蘚（Moss L.）［6］、水稻（Oryza sativa L.）［7］、玉米（Zea mays L.）［8］、小麥（Triticum aestivum L.）［9］等。近年來(lái)，隨著對(duì)模式植物miRNA的深入研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在植物生長(zhǎng)發(fā)育、維持基因組完整、抗逆境脅迫等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用［10］。在多種逆境脅迫下，對(duì)植物miRNA進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，植物通過(guò)引起某些物質(zhì)的積累和改變代謝途徑，從而對(duì)逆境脅迫出適應(yīng)性調(diào)整，同時(shí)miRNA存在差異表達(dá)［5，11，12］。從miRNA的角度深入研究植物在脅迫條件下的表現(xiàn)，有利于闡明植物耐脅迫機(jī)理和提高植物耐脅迫能力，對(duì)創(chuàng)新作物種質(zhì)資源和培育抗脅迫新品種奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 植物miRNA的產(chǎn)生及作用方式

1.1 miRNA的產(chǎn)生

MicroRNAs（簡(jiǎn)稱miRNAs）普遍存在于生物體內(nèi)，是由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度為20-25 nt左右的單鏈非編碼小分子RNA［13］。植物miRNA經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄、加工成熟和功能復(fù)合體裝配3個(gè)主要步驟完成生物合成。

1.1.1 轉(zhuǎn)錄 大部分植物miRNA由非編碼的核基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)，通過(guò)II型RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄形成初級(jí)轉(zhuǎn)錄本，稱為primary miRNAs（Pri-miRNAs）［14，15］。植物的pri-miRNA通常由腺苷酸開頭，具有5'帽子和3'-polyA尾，位于一個(gè)保守的TATA-box序列的下游40 nt處［16］。植物miRNA基因通常以單拷貝形式大多數(shù)存在于基因之間的間隔區(qū)（Intergenicregion，IGR），少數(shù)位于已知基因的內(nèi)含子區(qū)域［17］。

1.1.2 加工成熟 植物miRNA的加工成熟過(guò)程是由存在細(xì)胞核內(nèi)的Dicer酶類似物（Dicer-like1，DCL1），在Hyponastic leaves1（HYL1）蛋白的協(xié)助下，以一種ATP依賴的方式，通過(guò)兩次剪切步驟生成［18］。首先，pri-miRNA在細(xì)胞核內(nèi)加工成具有發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)的前體（pre-miRNAs）［19］，長(zhǎng)度約60-200 nt，每個(gè)片段的3'端都有2個(gè)堿基突出［18，20］。隨后，植物體內(nèi)的Exportin-5的同源蛋白（HASTY，HST）識(shí)別前體3'端的堿基突出信號(hào)，將前體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中［14，16］，在兩個(gè)蛋白酶HYL1和SERRATE（SE）的協(xié)助下［21，22］，剪切成約21-24 nt長(zhǎng)的miRNA∶miRNA*雙鏈復(fù)合體［18］。植物miRNA在Dicer加工之后，由HEN1作為轉(zhuǎn)甲基酶完成甲基化［23］。

1.1.3 功能復(fù)合體裝配 解旋酶（Helicase）將甲基化后的miRNA/miRNA*二聚體解旋，miRNA單鏈與AGO等蛋白形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC），而星號(hào)鏈則被降解掉［24］。星號(hào)鏈被降解的原因是miRNA∶miRNA*的兩條鏈不完全配對(duì)，miRNA鏈上靠近5'端有一個(gè)不與星號(hào)鏈相應(yīng)位置配對(duì)的小突起，明顯減弱了miRNA鏈5'端的穩(wěn)定性［25］，而成熟miRNA的產(chǎn)生總是趨向于選擇5'端更不穩(wěn)定的鏈。

1.2 miRNA的作用方式

植物miRNA與其靶mRNA的序列互補(bǔ)的程度決定了其調(diào)控機(jī)制是對(duì)靶mRNA的剪切，或是對(duì)靶mRNA翻譯的阻遏［26］。當(dāng)miRNA與靶mRNA完全互補(bǔ)或接近完全互補(bǔ)時(shí)，則會(huì)切割mRNA；當(dāng)植物miRNA與靶mRNA不完全互補(bǔ)時(shí)，則抑制其翻譯［27］。與哺乳動(dòng)物miRNA作用方式相比，植物miRNA對(duì)靶mRNA的主要作用方式是剪切［16］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA也可以通過(guò)目標(biāo)染色體位點(diǎn)的甲基化，或通過(guò)調(diào)控靶mRNA的定位或穩(wěn)定性在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)揮作用［28］。

2 植物miRNA的研究方法

2.1 發(fā)現(xiàn)miRNA的方法

在miRNA的研究初期，人們通過(guò)正向遺傳學(xué)方法發(fā)現(xiàn)新的miRNA［29］。目前，植物中只有擬南芥miR164是通過(guò)這種方法被發(fā)現(xiàn)，該方法獲得miRNA的效率很低［30］。近年來(lái)，隨著生物信息學(xué)、分子生物學(xué)及其相關(guān)技術(shù)的迅速發(fā)展，目前人們主要利用直接克隆測(cè)序技術(shù)和計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)來(lái)發(fā)現(xiàn)miRNA。

2.1.1 直接克隆測(cè)序技術(shù) 直接克隆測(cè)序技術(shù)的基本流程，首先構(gòu)建cDNA文庫(kù)，再將這些cDNA進(jìn)行克隆、測(cè)序［31］。然后利用NCBI中的BlastN軟件，將克隆得到的序列在該物種基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性搜索，用Mfold等程序?qū)哂型葱缘幕蚪M序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析［32］，最后將具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的小分子RNA進(jìn)行Northern雜交，將符合miRNA標(biāo)準(zhǔn)的小分子RNA鑒定為新的miRNA［33］。利用直接克隆測(cè)序技術(shù)，從擬南芥中分別克隆得到了16、125和11個(gè)miRNAs［34-36］。之后又采用這種方法分別從擬南芥［37］、水稻［38］、小麥［9］、玉米［8］等植物中得到了大量miRNA。直接克隆測(cè)序方法，操作流程多且繁瑣，難以鑒定豐度低的或堿基構(gòu)成特殊、存在轉(zhuǎn)錄后修飾的miRNA，具有局限性［39］。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序（Deep parallel squencing）技術(shù)的發(fā)展，彌補(bǔ)了直接克隆測(cè)序技術(shù)難以鑒定低豐度表達(dá)miRNA的缺點(diǎn)。結(jié)合高通量測(cè)序使用直接克隆測(cè)序技術(shù)，已經(jīng)繪制了擬南芥小分子RNA的基因組分布圖譜［40］。這對(duì)包括miRNA在內(nèi)的各種內(nèi)源小分子RNA的深入研究有著重要意義。

2.1.2 計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)法 計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)法是利用前體miRNA基因具有較穩(wěn)定發(fā)夾結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)搜尋miRNA，常用的程序有findMiRNA［41］、Mirfold［42］等。利用這些程序?qū)M南芥和水稻基因組中的miRNA基因進(jìn)行分析，篩選出了5個(gè)新家族中23個(gè)候選植物miRNA，隨后用實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證，證實(shí)了預(yù)測(cè)的真實(shí)性［41］。利用這種方法在20多種植物及病毒中預(yù)測(cè)得到了數(shù)百條miRNA序列［43］。隨著人們對(duì)miRNA研究的深入發(fā)現(xiàn)，利用計(jì)算機(jī)方法預(yù)測(cè)得到的miRNA存在一定的假陽(yáng)性，因?yàn)椴⒉皇撬衜iRNA在進(jìn)化過(guò)程中具有保守性，也不是所有能形成發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)的都是miRNA，如在tRNAs和rRNAs中也可形成發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)，其真實(shí)性需經(jīng)過(guò)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證［44］。但是，計(jì)算機(jī)方法有其他方法無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)，簡(jiǎn)單有效、時(shí)間短、花費(fèi)少，以及可獲得一些表達(dá)水平低、組織特異性表達(dá)以及特定環(huán)境誘導(dǎo)表達(dá)的miRNA［45］。

2.2 miRNA靶基因的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

目前對(duì)miRNA靶基因進(jìn)行功能注釋，主要利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其靶基因和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證結(jié)合的方式。其中生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miRNA靶基因常用的軟件有：miRanda、TargetScan、RNAhybrid、DIANA-microT、PicTar及FindTar等［46］。

預(yù)測(cè)得到的靶基因一般都要通過(guò)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其真實(shí)性，但是目前對(duì)miRNA靶基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證還沒(méi)有一個(gè)快速、簡(jiǎn)便、高通量的鑒定方法。剪切產(chǎn)物5'-RACE是植物中最常用的驗(yàn)證miRNA靶基因的方法［47］。許多研究利用該方法驗(yàn)證了miRNA靶基因，并且發(fā)現(xiàn)，這種剪切作用通常精確發(fā)生在miRNA第10或11位堿基處［48］。另一種驗(yàn)證靶基因的有效途徑是，在miRNA過(guò)量表達(dá)后，使用mRNA表達(dá)芯片分析。當(dāng)某些miRNA只行使翻譯抑制功能，表達(dá)芯片則無(wú)法檢測(cè)靶基因。確定miRNA與靶基因的對(duì)應(yīng)關(guān)系還可以利用熒光定量PCR及Western blot方法，分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染或敲除miRNA后細(xì)胞中mRNA水平及蛋白水平的變化［49］。該方法雖然能夠直接準(zhǔn)確地鑒定出miRNA的靶基因，但是不能鑒定miRNA的靶位點(diǎn)。近幾年涌現(xiàn)出一些不依賴預(yù)測(cè)和過(guò)表達(dá)的研究方法，直接檢測(cè)被剪切的miRNA靶基因，“降解組測(cè)序法”（Degradome sequencing）就是其中之一［50］。

3 植物逆境脅迫相關(guān)的miRNA

植物逆境脅迫（干旱、水分、溫度、養(yǎng)分及病菌侵染等）可以在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上調(diào)控植物相關(guān)基因的表達(dá)［51］。而轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，特別是轉(zhuǎn)錄因子直接與保守順式作用啟動(dòng)子元件結(jié)合來(lái)調(diào)控靶基因的調(diào)控方式，在逆境脅迫下基因表達(dá)調(diào)控中較為普遍［52］。已有的研究表明，miRNA在植物逆境脅迫下的調(diào)控機(jī)制可能屬于轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，目前尚不明確其調(diào)控機(jī)制［12］。闡明這種由miRNA介導(dǎo)下的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有助于進(jìn)一步明確植物耐脅迫機(jī)理，進(jìn)而通過(guò)基因工程手段和分子生物學(xué)方法提高作物的耐脅迫能力，改良植物種質(zhì)資源［53］。

3.1 植物生物脅迫相關(guān)miRNA

植物病蟲害是一個(gè)廣泛影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的生物因素。每年因植物病毒感染而導(dǎo)致大多數(shù)農(nóng)作物和果樹減產(chǎn)30%左右［54］。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，植物已經(jīng)形成了一些抵制病毒感染的機(jī)制，其中一種機(jī)制就是病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。已有越來(lái)越多的證據(jù)表明miRNA與病毒介導(dǎo)的疾病以及病毒誘導(dǎo)的基因沉默有關(guān)［55］。植物在miRNA的指導(dǎo)下，通過(guò)類似于RNA干涉的形式，切割病毒RNA和病毒通過(guò)miRNA作用指導(dǎo)切割多種調(diào)控性靶mRNA的方式來(lái)干擾宿主細(xì)胞的基因表達(dá)［56］。

2009年，F(xiàn)eng等［57］率先檢測(cè)了與病毒相關(guān)的番茄miRNA，其后研究表明miRNA在黃瓜花葉病毒（Cucumer mosaic virus，CMV）、番茄不孕病毒（Tomato aspermy virus，TAV）、番茄卷葉新德里病毒（Tomato leaf curl new delhi virus，ToLCNDV）、番茄灰霉病等病害的防御和發(fā)生中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用。非洲木薯花葉病毒（Africancassava mosaic virus）編碼的AC4蛋白，能與擬南芥miR159結(jié)合，阻止其對(duì)正常目標(biāo)mRNA的調(diào)控，從而干擾了轉(zhuǎn)錄后基因沉默共抑制過(guò)程［58］。孫廣鑫等［59］通過(guò)構(gòu)建Cytoscape網(wǎng)絡(luò)圖，篩選出番茄中與致病密切相關(guān)的miRNA，并對(duì)選出的miR169、miR482、miR5300、miR6024、miR6026和miR6027進(jìn)行靶基因功能分析和啟動(dòng)子分析后發(fā)現(xiàn)，這6個(gè)miRNA的靶基因和啟動(dòng)子基本都與抗病性相關(guān)，表明它們極可能參與了番茄對(duì)生物脅迫響應(yīng)的調(diào)控過(guò)程。2011年，Zhang等［60］對(duì)未處理、致病性和非致病性Pst處理6 h和14 h后的擬南芥建立了13個(gè)小RNA庫(kù)，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)分別有15個(gè)、17個(gè)和20個(gè)miRNA家族出現(xiàn)顯著的表達(dá)差異。其中包括保守性較高的miR156a/b/c/e/f、miR159b/c和miR166等，以及保守性較低的miR852、miR825和miR843等。Yin等［61］通過(guò)在接種黃萎病棉花根中調(diào)查miRNA和非編碼小RNA的轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建了4個(gè)小RNA文庫(kù)，在兩個(gè)抗感棉花品系中共鑒定了215個(gè)miRNA家族，其中14個(gè)是新的miRNA，并且發(fā)現(xiàn)在文庫(kù)中有多于65個(gè)miRNA家族出現(xiàn)表達(dá)差異，在接種黃萎病后，它們的表達(dá)量也出現(xiàn)差異。棉花miR862和miR1536在經(jīng)過(guò)黃萎病處理后表達(dá)量顯著下降，意味著其靶基因TCH4表達(dá)量上調(diào)，從而在抵御黃萎病菌侵染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。姜兆遠(yuǎn)等［63］運(yùn)用Affymetrix基因表達(dá)譜芯片和miRNA芯片對(duì)接種稻瘟病的水稻進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，osamiR399i_st在抗病初期上調(diào)，其靶基因RGA1抗病蛋白在抗病初期下調(diào)表達(dá)，表明osa-miR399i_st在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因RGA1過(guò)程中起關(guān)鍵作用；由于斑點(diǎn)葉基因突變可提高水稻對(duì)白葉枯病的抗性［62］，該研究發(fā)現(xiàn)控制病原菌在寄主葉片上癥狀的斑點(diǎn)葉基因，在抗病初期下調(diào)表達(dá)并受osa-miR812c_st的調(diào)控，從而說(shuō)明osa-miR812c_st可能對(duì)抗稻瘟病也有一定的作用。羅茂等［64］利用生物信息學(xué)篩選到出23條新的玉米miRNA，預(yù)測(cè)到89個(gè)靶基因，以對(duì)紋枯病抗性不同的自交系R15和掖478為材料，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR手段對(duì)上述兩個(gè)材料中表達(dá)存在差異的成熟miRNA進(jìn)行驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，zmamiR165、zma-miR168b/zma-miR168b*、zma-miR171、zma-miR173、zma-miR319在玉米抗紋枯病脅迫過(guò)程中可能起重要的調(diào)控作用。

當(dāng)植物受到病原物侵染時(shí)，體內(nèi)多種miRNA及相關(guān)靶基因的表達(dá)量都會(huì)發(fā)生變化，說(shuō)明miRNA在植物響應(yīng)生物脅迫中發(fā)揮重要作用［65，66］，并且所介導(dǎo)的沉默途徑、調(diào)控反應(yīng)與病原抑制RNA沉默的反防御、干擾作用機(jī)制遠(yuǎn)比人們想象的復(fù)雜［53］。

3.2 植物非生物脅迫相關(guān)miRNA

3.2.1 養(yǎng)分脅迫 氮是植物3大營(yíng)養(yǎng)元素之一，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在氮素水平較低的情況下，一些miRNA的表達(dá)量會(huì)發(fā)生變化［67］。如2009年，Pant等［68］發(fā)現(xiàn)在氮脅迫條件下擬南芥miRl69家族受到抑制，而供氮正常的植株韌皮部汁液中存在大量的miRl69，說(shuō)明miRl69可能是氮代謝中的長(zhǎng)距離信號(hào)。Joshi和Combier等［69，70］研究發(fā)現(xiàn)，豆科植物在低氮水平下，miR169通過(guò)調(diào)節(jié)根瘤發(fā)育適應(yīng)低氮環(huán)境，原因是miR169的靶基因HAP2-1調(diào)控根瘤原基分化，過(guò)量表達(dá)miR169或敲除HAP2-1基因抑制側(cè)根的形成。Gifford等［71］發(fā)現(xiàn)miR167a可以通過(guò)調(diào)節(jié)側(cè)根生長(zhǎng)來(lái)響應(yīng)低氮脅，因?yàn)锳RF8與植物側(cè)根的生長(zhǎng)有密切關(guān)系，而miR167a在低氮脅迫下表達(dá)量上調(diào)，從而導(dǎo)致靶基因ARF8表達(dá)下調(diào)。最近的研究表明，低N條件會(huì)引起水稻體內(nèi)miRNAs含量的變化，如根部miR168表達(dá)水平下降［72］。

近年來(lái)，土壤有效磷的缺失已經(jīng)成為很多地區(qū)限制作物生長(zhǎng)的重要因素之一。植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，通過(guò)改變根系形態(tài)結(jié)構(gòu)、根系分泌有機(jī)酸和酸性磷酸酶分解根際難溶性磷，以增加與土壤的接觸面積，提高植物體內(nèi)磷的循環(huán)利用，以適應(yīng)低磷環(huán)境［73］。這些適應(yīng)性變化與低磷脅迫下某些特定基因的表達(dá)和調(diào)控密切相關(guān)［74］。Fujii等［11］發(fā)現(xiàn)，在擬南芥基因組中存在編碼6個(gè)miR399基因，均在低磷脅迫的誘導(dǎo)下出現(xiàn)差異表達(dá)。擬南芥miR399對(duì)低磷脅迫發(fā)生響應(yīng)，并保持體內(nèi)磷素穩(wěn)定平衡有重要作用［75］。植物在低磷脅迫下，miR399的表達(dá)量上升迅速，當(dāng)磷素水平恢復(fù)正常時(shí)，表達(dá)量又急劇下降。Chio等［76］的研究表明，miR399的靶基因是無(wú)機(jī)磷轉(zhuǎn)運(yùn)子（Pi transporter）和泛素結(jié)合酶（UBC24）兩個(gè)基因家族。Wang等［77］利用基因芯片得到199個(gè)陸地棉miRNA，通過(guò)對(duì)miR399研究發(fā)現(xiàn)，它與纖維中磷的含量變化相關(guān)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，除miR399之外，在其他植物中也有與磷相關(guān)的miRNA參與調(diào)節(jié)植物對(duì)磷脅迫的響應(yīng)過(guò)程，如在大豆中miR159a在磷脅迫誘導(dǎo)下表達(dá)量上調(diào)，而miR166a、miR319a、miR396a、miR398b和miR1507a表達(dá)量上調(diào)［78］。

植物在應(yīng)對(duì)低硫脅迫時(shí)，通過(guò)改變一些生理狀態(tài)來(lái)使體內(nèi)硫素水平維持穩(wěn)態(tài)［53］。Sunkar等［79］研究發(fā)現(xiàn)miRNA395在維持?jǐn)M南芥體內(nèi)硫素平衡中發(fā)揮了重要作用。Lappartient等［80］研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥基因組中的兩個(gè)基因簇的6個(gè)基因位點(diǎn)可能是miRNA395發(fā)揮作用的位點(diǎn)，其中APS1、APS3和APS4等是催化硫吸收的ATP硫化酶基因。AsT68則是一個(gè)低親和力硫轉(zhuǎn)運(yùn)子，其主要作用是將硫由根系轉(zhuǎn)運(yùn)至莖葉［81］。Jones-rhoades等的研究結(jié)果表明，植物在受低硫脅迫誘導(dǎo)的同時(shí)，APS1的轉(zhuǎn)錄水平下降，當(dāng)供硫正常時(shí)，ASP1的轉(zhuǎn)錄水平增加，miRNA395表達(dá)完全受到抑制［12］，表明可能存在某些負(fù)調(diào)控途徑，但詳細(xì)的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

miRNA對(duì)于微量元素及其他重金屬元素有相似應(yīng)對(duì)大量元素變化的調(diào)控功能［67］。在植物保守miRNA家族中，miR398在多種逆境脅迫響應(yīng)中的調(diào)控功能已得到廣泛研究，其在調(diào)節(jié)植物銅代謝平衡，應(yīng)答過(guò)量的鐵、鎘等金屬脅迫中扮演重要角色［82］。銅素缺乏時(shí)，miR398介導(dǎo)了Cu/Zn SOD mRNA的降解過(guò)程，促使CSD基因表達(dá)量下調(diào)，并且使CSD在葉綠體中的作用被Fe SOD所代替，該過(guò)程被認(rèn)為是植物自身應(yīng)對(duì)銅素缺乏的適應(yīng)性變化［83］。

3.2.2 干旱脅迫 干旱是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素之一。水稻miR169g家族包含17個(gè)成員，是在水稻中最早發(fā)現(xiàn)的與干旱相關(guān)的miRNA［84］。通過(guò)PEG6000模擬的干旱脅迫誘導(dǎo)水稻miR169和miR393的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR169g是唯一一個(gè)被干旱所誘導(dǎo)的miR169成員，說(shuō)明在序列相似的同一家族各成員之間，在生理學(xué)上有不同的作用。對(duì)擬南芥進(jìn)行干旱脅迫時(shí)測(cè)定miR169a和miR169c的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)miR169a的植株比野生型更容易表現(xiàn)出葉片易失水和抗干旱能力減弱等特點(diǎn)［84］。顏秦峰等［85］通過(guò)構(gòu)建擬南芥MIR398過(guò)表達(dá)載體，將擬南芥MIR398基因轉(zhuǎn)入煙草中后發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下與野生型相比，轉(zhuǎn)基因煙草丙二醛與超氧陰離子含量均有所升高，脯氨酸含量相對(duì)降低，說(shuō)明了miR398參與了植物抗旱過(guò)程。羅書芳等［86］利用定量PCR技術(shù)驗(yàn)證了在干旱脅迫條件下，丹參中15種常見的miRNAs的差異表達(dá)，對(duì)其靶基因及其功能進(jìn)行初步分析后發(fā)現(xiàn)，15種miRNA在干旱脅迫前后的表達(dá)都出現(xiàn)差異，推測(cè)出丹參miR169和miR3462參與丹參的干旱脅迫應(yīng)答過(guò)程的可能性大。Wei等［87］通過(guò)miRNA芯片雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下來(lái)自13個(gè)物種的34個(gè)miRNA表達(dá)顯著變化。在干旱條件下，miR474表達(dá)量上升，其靶基因PDH是脯氨酸積累過(guò)程的負(fù)調(diào)控元件。干旱脅迫抑制miR168、miR528和miR167表達(dá)，它們各自的靶mRNA、MAPK、POD和PLD表達(dá)量上調(diào)，啟動(dòng)ABA誘導(dǎo)的氣孔運(yùn)動(dòng)和抗氧化防御。Li等［88］研究發(fā)現(xiàn)與吸足水分的玉米種子相比，干旱種子中miR168表達(dá)量上調(diào)，說(shuō)明miR168參與了種子體內(nèi)的新陳代謝，進(jìn)而調(diào)控了耐干旱脅迫過(guò)程。

3.2.3 低溫脅迫 低溫對(duì)植物的自然分布和栽培區(qū)域有重要的限制作用。植物miRNA對(duì)低溫脅迫作出響應(yīng)是通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素、脫落酸（ABA）等信號(hào)途徑完成的。研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，擬南芥miR393表達(dá)上調(diào)，E3水解其靶蛋白受到抑制，進(jìn)而使植物對(duì)低溫的耐受性得到加強(qiáng)［53］。Sunkar等將擬南芥幼苗進(jìn)行不同脅迫處理發(fā)現(xiàn)，miR393和miR397在低溫脅迫誘導(dǎo)下表達(dá)。同時(shí)，一種miRNA可以在多種脅迫因素誘導(dǎo)下表達(dá)。例如，miR393受低溫、脫水、高鹽和ABA的正調(diào)控程度大，而miR397b和miR402受以上4種脅迫的正調(diào)控程度較?。?］。Zhou等和Liu等［89］分別通過(guò)全基因組測(cè)序及芯片雜交方法證實(shí)低溫誘導(dǎo)miR397的表達(dá)。通過(guò)芯片雜交實(shí)驗(yàn)還證明低溫誘導(dǎo)擬南芥miR172、miR171、miR169、miR408以及毛白楊中miR168和miR477的表達(dá)，同時(shí)抑制毛白楊miR156、miR475和miR476的表達(dá)。王冰等［90］對(duì)受低溫脅迫誘導(dǎo)的小麥miR156家族成員進(jìn)行了qRT-PCR分析后發(fā)現(xiàn)，miR156d*表現(xiàn)出明顯下調(diào)趨勢(shì)，miR156a的表達(dá)顯著上升，說(shuō)明它們參與了低溫脅迫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

3.2.4 鹽及其他非生物脅迫 除上述幾種脅迫之外，植物在生長(zhǎng)過(guò)程中可能還會(huì)受到鹽、重金屬、淹水、機(jī)械力、氧化和輻射等不同形式的非生物脅迫。植物在對(duì)這些脅迫作出適應(yīng)性反應(yīng)時(shí)，miRNA對(duì)生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)也有十分重要的意義。

Yin等［91］對(duì)耐鹽性不同的兩個(gè)棉花品種進(jìn)行了鹽脅迫處理，利用微陣列分析發(fā)現(xiàn)，miRNA在不同的耐鹽性品種之間的特異性表達(dá)模式，確定了17個(gè)保守的棉花miRNA，耐鹽品系在高鹽脅迫下，miR156a/d/e、miR169、miR535a/b和miR827b表達(dá)量下調(diào)，miR167a、miR397a/b和miR399a表達(dá)上調(diào)，而鹽敏感品系在鹽脅迫下只有miR159表達(dá)量下調(diào)。預(yù)測(cè)其靶基因，并對(duì)靶基因功能相似性分析后發(fā)現(xiàn)，其靶基因包括轉(zhuǎn)錄因子和多種酶，調(diào)控植物生長(zhǎng)和發(fā)育，保守的miRNA構(gòu)成的復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)了棉花對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)。杜馳等［92］在花花柴中克隆到CSD1和CSD2基因全長(zhǎng)序列：KcCSD1和KcCSD2，進(jìn)行鹽脅迫誘導(dǎo)后，熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明花花柴的KcmiR398和KcCSD1、KcCSD2存在組織差異性表達(dá)，說(shuō)明鹽脅迫可以影響KcmiR398和KcCSD1、KcCSD2基因的表達(dá)以適應(yīng)鹽脅迫產(chǎn)生的氧化危害。

Fang等［93］對(duì)HX3（Cd耐受型）和ZH24（Cd敏感型）大豆（Glycinemax）株系進(jìn)行Cd對(duì)照處理，采用miRNA微陣列芯片鑒定出26個(gè)與Cd應(yīng)激相關(guān)的miRNA，其中有5個(gè)和12個(gè)miRNA分別在HX3和ZH24中特異表達(dá)，9個(gè)miRNA在2個(gè)株系中均有發(fā)現(xiàn)。Yang和Chen等［94］研究發(fā)現(xiàn)，miR395在植物中參與調(diào)控硫饑餓誘導(dǎo)的低親和力硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體（SULTR2；1）以及3個(gè)ATP硫酸化酶基因（ATP sulphurylase，APS）（APS1、APS3和APS4），從而參與重金屬Al、Cd和Hg脅迫應(yīng)答過(guò)程。Zhang等［95］通過(guò)對(duì)甘藍(lán)型油菜的研究發(fā)現(xiàn)，miR395通過(guò)調(diào)控其靶基因APS和SULTR2的表達(dá)，參與Cd脅迫調(diào)節(jié)。

Zhang等［96］通過(guò)對(duì)玉米在淹水脅迫下miRNA調(diào)節(jié)根細(xì)胞形態(tài)及代謝作用的研究發(fā)現(xiàn)，在淹水脅迫下多種miRNA表達(dá)量出現(xiàn)差異，并呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)性及多樣性。Lu等［97，98］發(fā)現(xiàn)從機(jī)械力脅迫4 d的毛白楊（Populus trichocarpa）中分離得到的22個(gè)miRNAs，其中至少10個(gè)是毛白楊特有。通過(guò)對(duì)其靶基因預(yù)測(cè)并進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，大部分miRNA的靶基因是與脅迫相關(guān)的抗性蛋白基因或者與細(xì)胞壁代謝合成有關(guān)的基因。

同時(shí)，植物在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)遇到多種脅迫的共同作用，植物在應(yīng)對(duì)環(huán)境的綜合脅迫時(shí)，同一種miRNA會(huì)對(duì)不同生理活動(dòng)作出調(diào)節(jié)。Sunkar等對(duì)擬南芥幼苗進(jìn)行脫水、高鹽、低溫和ABA脅迫處理后，構(gòu)建了小分子RNA文庫(kù)，對(duì)文庫(kù)的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)了來(lái)源于15個(gè)新的miRNA家族的26個(gè)新的miRNAs。利用miRNA與靶基因結(jié)合序列互補(bǔ)的特點(diǎn)，預(yù)測(cè)了41個(gè)具有不同功能的靶基因。Nothern分析后發(fā)現(xiàn)，許多miRNA受到一種或多種逆境脅迫的調(diào)控，并表現(xiàn)組織特異性。

4 展望

miRNA的發(fā)現(xiàn)是RNA研究領(lǐng)域的一個(gè)里程碑式的突破，植物逆境miRNA對(duì)研究植物在逆境脅迫下的適應(yīng)性生理反應(yīng)機(jī)制提供了強(qiáng)有力的工具，促進(jìn)了對(duì)植物逆境分子生物學(xué)研究。目前雖然在很多物種中發(fā)現(xiàn)、鑒定了數(shù)以千計(jì)的miRNA，但是這些只占基因組中全部miRNA的一小部分，還有很多重要的miRNA等待人們?nèi)グl(fā)現(xiàn)、研究、驗(yàn)證。然而大部分miRNA同時(shí)調(diào)控多種靶基因，各種miRNA構(gòu)成的調(diào)控網(wǎng)存在交叉和關(guān)聯(lián)，如何理清miRNA功能之間的復(fù)雜關(guān)系，需要依賴于更巧妙的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和更先進(jìn)的技術(shù)手段。解決逆境脅迫對(duì)作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的限制問(wèn)題，前提是弄清作物的抗脅迫機(jī)制，從miRNA的角度研究植物在逆境脅迫下的適應(yīng)性變化，為作物抗逆境脅迫研究指明了新的方向，對(duì)作物種質(zhì)資源的創(chuàng)新和抗脅迫新品種的培育有著重要的意義。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress of MicroRNAs in Plant Stress Responses

Wang Wei Zhang Yujuan Chen Jie Liu Jubo Xia Minxuan Shen Fafu
（State Key Laboratory of Crop Biology，College of Agronomy，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018）

MicroRNA（miRNAs）is a class of endogenous non-coding small RNAs， which participate in regulation of physiological activities by target mRNA cleavage or translational repression in plants. Some miRNAs play important roles in stress-related signal transduction and improving resilience against adverse environmental hazards of plant capacity by regulating gene expression under stressed conditions. This article focused on the production of miRNA， mechanism， research approaches and characteristics of resisting the biotic and abiotic stresses in plants， the development trends and future prospect of plant miRNAs research.

microRNA；stress；bioinformatics；target gene；gene regulation

2014-07-14

國(guó)家轉(zhuǎn)基因育種重大專項(xiàng)（2011ZX08005-004，2011ZX08005-002）

王維，男，碩士，研究方向：植物生物技術(shù)及其在育種上的應(yīng)用；E-mail：sdauww@126.com

沈法富，男，教授，研究方向：棉花種質(zhì)資源創(chuàng)新；E-mail：ffshen@sdau.edu.cn