趙衛(wèi)紅張鳳英於葉兵王資生齊志濤

（1.鹽城工學院海洋與生物工程學院，鹽城 224051；2.江蘇省沿海池塘養(yǎng)殖重點實驗室，鹽城 224051；3.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

停乳鏈球菌對日本沼蝦總超氧化物歧化酶活性的影響

趙衛(wèi)紅1，2張鳳英3於葉兵1，2王資生1齊志濤1

（1.鹽城工學院海洋與生物工程學院，鹽城 224051；2.江蘇省沿海池塘養(yǎng)殖重點實驗室，鹽城 224051；3.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

對健康的日本沼蝦（1.40 ± 0.12）g分別肌肉注射0.6 × 106、2 × 106、4 × 106、6 × 106CFU/mL的停乳鏈球菌菌液10 μL，注射后3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、5 d、10 d分別采集肝胰腺、肌肉和鰓組織，測定其中的總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性，研究停乳鏈球菌對日本沼蝦T-SOD活性的影響。研究結果顯示，肝胰腺中T-SOD活性于注射5 d后達到最大值（P ＜ 0.05），10 d后0.6 × 106、2 × 106和4 × 106CFU/mL組T-SOD活性下降并接近對照組水平，而最高濃度組（6 × 106CFU/mL）T-SOD酶活性僅有對照組的46%。肌肉和鰓中T-SOD活性均在注射6 h后達到最大值，注射10 d后，4 × 106和6 × 106CFU/mL組的肌肉和6 × 106CFU/mL組的鰓組織中T-SOD活性均僅有對照組的50%左右。另外，肌肉組織中T-SOD的峰值遠高于鰓和肝胰腺組織中的峰值。上述結果表明，停乳鏈球菌不僅影響日本沼蝦機體T-SOD酶的活性，而且肌肉、鰓和肝胰腺組織中酶的活性應答時間不同，且組織內(nèi)酶活性的應答與菌的感染方式有關，另外，注射高濃度停乳鏈球菌長時間后會降低其組織中T-SOD酶活性。

停乳鏈球菌；日本沼蝦；總超氧化物歧化酶

日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）是我國重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟品種，具有較高的食用價值和經(jīng)濟價值，并具有潛在的藥用價值［1］，一直以來為人們所喜愛。近年來，隨著人工化養(yǎng)殖技術的快速發(fā)展，規(guī)?；呙芏瑞B(yǎng)殖模式的普及，水產(chǎn)動物間病原體交叉感染嚴重，細菌病等疾病的暴發(fā)制約著日本沼蝦產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。在我國一些水產(chǎn)養(yǎng)殖地區(qū)，均不同程度地暴發(fā)鏈球菌病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。大連某養(yǎng)殖場發(fā)生過對蝦鏈球菌病，造成了嚴重的經(jīng)濟損失［2］。近年來，廣東地區(qū)也出現(xiàn)南美白對蝦感染鏈球菌病例。雖然未見日本沼蝦養(yǎng)殖中鏈球菌病大規(guī)模爆發(fā)的報道，但是在本課題組的前期研究中發(fā)現(xiàn)，鏈球菌同樣對日本沼蝦具有感染致死作用。因此，研究鏈球菌對日本沼蝦免疫機能的影響對防范該菌在蝦類養(yǎng)殖中的大規(guī)模爆發(fā)，進一步探討甲殼動物的免疫機制有著十分現(xiàn)實的意義。

超氧化物歧化酶（SOD）是細胞內(nèi)最有效的抗氧化酶之一，是生物體內(nèi)清除活性氧從而保護機體組織的第一道防線［3］。超氧化物歧化酶（SOD）廣泛存在于細菌、真菌、植物和動物等生物體內(nèi)［4］，它以多種形式存在，主要有錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、鐵超氧化物歧化酶（Fe-SOD）和銅鋅超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）［5］，這些SOD統(tǒng)稱為總SOD（T-SOD）。SOD在抵抗各種應激因子上具有重要作用，如細菌［6］、病毒［7］、有毒化學物質(zhì)［8］和熱刺激［9］等。SOD可作為水產(chǎn)動物免疫機能的一個生物標記，其活性大小是衡量生物體免疫活性強弱的一個非常重要的參考指標［10］。本研究主要通過研究日本沼蝦感染停乳鏈球菌情況下其肝胰腺、肌肉和鰓中T-SOD活性的變化，為甲殼動物抵抗病菌感染能力以及免疫調(diào)節(jié)機能的生理和分子機制提供相關的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗蝦 2013年3月，于鹽城通渝河購買日本沼蝦，以新鮮的碎河蚌肉為餌料（投餌率4%-5%），上午7∶00、下午6∶00的投餌量分別占日投餌量的40%和60%，實驗室暫養(yǎng)1周后挑選活力好、規(guī)格整齊（1.40 ± 0.12）g的健康個體作為實驗蝦。試驗期間，24 h供氧，水溫穩(wěn)定在19℃左右，水質(zhì)良好。

1.1.2 停乳鏈球菌的獲得 停乳鏈球菌（Streptococcus dysgalactiae equisimilis）由中國科學院水生生物研究所淡水生態(tài)和生物技術國家重點實驗室的李愛華研究員提供，來源于得病的鱘魚（Sturgeon sp.），從10條患病的鱘魚體內(nèi)分離獲得，通過生理、生化特性和分子鑒定確認。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度停乳鏈球菌活菌的注射 本試驗分為四組，每組分別注射0.6 × 106、2 × 106、4 × 106、6 × 106CFU停乳鏈球菌活菌10 μL，對照組注射同等劑量的PBS（0.1 mol/L，pH 7.0），每組3個平行，每個平行60尾蝦。在第2腹甲和第3腹甲之間與身體呈45°角肌肉處進行注射，注射劑量10 μL。

1.2.2 日本沼蝦組織的提取與處理 取樣前24 h停食，為了檢測鏈球菌注射后短時間（24 h內(nèi)）和較長時間內(nèi)蝦體T-SOD活性的影響，于注射后3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、5 d和10 d取5尾試驗蝦的肝胰腺、肌肉和鰓。-20℃保存待測。測定時肌肉和鰓按重量體積比加生理鹽水制成10%的組織勻漿，肝胰腺制成5%的組織勻漿，6 000 r/min離心15 min，上清用于測定其T-SOD活性。

1.2.3 蛋白濃度測定 采用南京建成生物工程研究所考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒。蛋白計算公式如下：

蛋白濃度（g/L）=（測定管OD值-空白管OD值）/（標準管OD值-空白管OD值）×標準管濃度（0.563 g/L）

1.2.4 T-SOD活性測定 T-SOD活性采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定，方法為黃嘌呤氧化法。T-SOD活性定義為每毫克組織蛋白在1 mL反應液中T-SOD抑制率達50%時所對應的T-SOD量為一個T-SOD活性單位（U）。依據(jù)上面所測的蛋白濃度，T-SOD活性計算公式如下：

T-SOD活性（U/mgprot）=（對照管吸光度-測定管吸光度）/對照管吸光度/50% × 反應液總體積/取樣量（mL）/待測樣本蛋白濃度（mgprot/mL）。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 考慮到注射應激和試驗時間等因素對酶活性的影響，每組酶活性測定均采用試驗組酶活性和對照組酶活性的比值，即試驗組酶活性和PBS對照組酶活性的比值，用平均值±標準差（± s）形式表示。對上述比值采用 SPSS17.0統(tǒng)計軟件和單因素（One-way）分析法進行處理。用Duncan氏多重比較法分析組間差異顯著程度，顯著水平為P＜0.05。

2 結果

2.1 停乳鏈球菌對日本沼蝦肝胰腺中T-SOD活性影響

結果顯示（表1），注射5 d后肝胰腺組織中T-SOD酶活性在每個濃度組均達到最大值，均顯著高于對照組（P ＜ 0.05），且隨著注射濃度的增大，T-SOD活性逐漸增強，至6 × 106CFU/ mL濃度組肝胰腺中T-SOD活性達到最大值8.99 ± 0.00，與0.6 × 106CFU/mL、2 × 106CFU/mL和4 × 106CFU/mL濃度組差異顯著（P ＜ 0.05）。注射10 d后肝胰腺中T-SOD活性相對于5 d顯著降低（P ＜ 0.05），均低于對照組，且最高濃度組酶活僅有對照組的0.46倍。

表1 停乳鏈球菌對日本沼蝦肝胰腺中T-SOD活性的影響

2.2 停乳鏈球菌對日本沼蝦肌肉中T-SOD活性的影響

從表2可以看出，停乳鏈球菌注射6 h后，肌肉中T-SOD活性均升至峰值，且2×106CFU/mL組活性最強，顯著高于其他各組（P ＜ 0.05）。4×106和6×106CFU/mL組酶活性在12 h和5 d均顯著高于0.6×106和2×106CFU/mL組（P ＜ 0.05）。與感染5 d后相比，感染10 d后肌肉T-SOD酶活性，0.6×106CFU/mL組顯著升高（P ＜ 0.05），其他3組，顯著下降（P ＜ 0.05），且4×106和6×106CFU/mL組酶活性均僅有對照組的一半左右。

表2 停乳鏈球菌對日本沼蝦肌肉中T-SOD活性的影響

2.3 停乳鏈球菌對日本沼蝦鰓中T-SOD活性影響

感染不同濃度停乳鏈球菌6 h后鰓中T-SOD活性顯著升高，且均達到峰值（P ＜ 0.05）（表3）。而感染3 h、24 h和5 d后，所有感染濃度組之間差異均不顯著（P ＞ 0.05）。感染9 h后，0.6×106CFU/mL顯著低于其它3組（P ＜ 0.05），感染12 h后，0.6×106和2×106CFU/mL組顯著低于其它兩組（P ＜ 0.05）。感染10 d后，最高濃度組（6×106CFU/mL）鰓中T-SOD活性降至最低值0.54 ± 0.01，約為對照組鰓中T-SOD活性的1/2，且顯著低于其他濃度組（P ＜ 0.05）。

3 討論

SOD是體內(nèi)清除氧自由基最主要的酶，其活性的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力［11］。SOD活性高低與蝦蟹的免疫機能狀況密切相關［12］。本試驗結果表明，注射停乳鏈球菌對日本沼蝦肌肉、鰓和肝胰腺中T-SOD活性的影響不僅和菌液的濃度大小有關，還與感染時間長短有關。如多氯聯(lián)苯（PCBs）刺激劍尾魚（Xiphophorus helleri）12 h內(nèi)，T-SOD活性略有上升，而在48 h和72 h內(nèi)，T-SOD活性顯著下降［13］；羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）受莫格球擬酵母（Torulopsis）感染致病后，T-SOD活性下降［14］；而紅螯螯蝦感染嗜水氣單胞菌48-72 h SOD活性明顯升高［15］。T-SOD產(chǎn)生如此復雜的變化，與動物體內(nèi)相互關聯(lián)的免疫系統(tǒng)有關。作為甲殼動物的日本沼蝦，其免疫系統(tǒng)主要由血淋巴細胞和溶酶體酶組成，前者包括透明細胞、小顆粒細胞和大顆粒細胞，后者包括SOD、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，血淋巴細胞的數(shù)量和種類會影響溶酶體的酶活，而且?guī)追N溶酶體之間亦有關聯(lián)。

表3 停乳鏈球菌對日本沼蝦鰓中T-SOD活性的影響

感染停乳鏈球菌5 d后日本沼蝦肝胰腺中T-SOD活性隨著感染菌液濃度的升高而增強。產(chǎn)生這一結果的原因可能是，隨著感染菌液濃度的增加，蝦體產(chǎn)生的氧自由基隨之增加，作為甲殼動物最主要的免疫器官的肝胰腺，是清除體內(nèi)氧自由基的主要器官，其T-SOD活性亦即隨之增強。另外，停乳鏈球菌感染10 d后，在所有低濃度組（0.6×106和2×106CFU/mL）肌肉和鰓中T-SOD活性恢復到對照組水平，原因可能是低濃度感染10 d后，體內(nèi)活性氧自由基被清除，機體對停乳鏈球菌感染入侵產(chǎn)生了應答；而高濃度組（6×106CFU/mL）感染10 d后所有組織中T-SOD酶活均顯著降低，僅有對照組的50%左右。在鹽度對SOD活性影響的研究中同樣也發(fā)現(xiàn)，高鹽度對SOD活性具有抑制作用［16］。以上結果同時也表明一方面可能是因為日本沼蝦抗氧化調(diào)節(jié)機制是有限度的，高濃度停乳鏈球菌長時間感染對機體造成損傷，引起體內(nèi)合成代謝受阻，T-SOD活性下降［17］；另一方面，可能是日本沼蝦體內(nèi)的部分血細胞的結構與功能遭到破壞和血細胞的壽命縮短等原因，致使血細胞新生數(shù)量減少［18］，而SOD酶主要來自于血細胞，從而造成T-SOD活性下降。這與王玥等［19］研究報道的氨態(tài)氮和亞硝態(tài)氮對羅氏沼蝦超氧化物歧化酶活性影響結果相符。

本試驗中日本沼蝦不同組織T-SOD活性有一定差異，可能是T-SOD在日本沼蝦中存在一定的組織特異性。在青魚各組織中 SOD 含量大小依次為肝臟、鰓絲和肌肉［20］。孔祥會等［21］報道，T-SOD活性在鋸緣青蟹（Scylla serrata）肝胰腺、肌肉和鰓中差異極顯著。王偉偉［22］研究發(fā)現(xiàn)，克氏原螯蝦中T-SOD含量從高到低依次是肝胰腺、肌肉和鰓，日本對蝦中T-SOD含量從高到低依次是肝胰腺、肌肉和鰓，凡納濱對蝦中T-SOD含量從高到低依次是肝胰腺、鰓和肌肉。這些研究結果表明甲殼動物中T-SOD存在組織特異性，同時驗證了本試驗觀點的合理性。另外，本試驗結果顯示，日本沼蝦在感染停乳鏈球菌6 h后肌肉和鰓中T-SOD活性達到最大值，而肝胰腺5 d后達到最大值。產(chǎn)生這樣的組織差異可能還因為，本試驗停乳鏈球菌是通過肌肉注射的，所以短時間內(nèi)肌肉中T-SOD活性首先被激活增強，且肌肉中T-SOD酶活性峰值最高也就不足為奇了；而鰓由于裸露在外，是蝦體抵御不良刺激的第一道防線，所以T-SOD在鰓中亦快速增加，從而提高蝦體的免疫機能，而肝胰腺位于體內(nèi)，所以其應答時間最長，其T-SOD活性于感染后5 d才達到最大值。

本試驗研究了日本沼蝦感染停乳鏈球菌后T-SOD的活性變化，有助于了解鏈球菌感染對日本沼蝦生理生化的影響，對進一步研究SOD在甲殼動物機體中的免疫功能，以及對甲殼動物健康養(yǎng)殖和疾病防治等具有重要的參考價值。

4 結論

日本沼蝦肌肉注射停乳鏈球菌注射6 h后，肌肉和鰓中T-SOD活性均達到最大值，注射5 d后肝胰腺中T-SOD活性達到最大值，10 d后最高濃度組（6 ×106CFU/mL）肌肉、鰓和肝胰腺中和次高濃度組（4 × 106CFU/mL）肌肉中T-SOD酶活性均降至對照組的近一半，其他各組均逐漸降至對照組水平。另外，肌肉組織中T-SOD的峰值遠高于鰓和肝胰腺組織中的峰值。

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（責任編輯 李楠）

Effect of Streptococcus dysgalactiae equisimilis on Total SOD Activity in Macrobrachium nipponense

Zhao Weihong1，2Zhang Fengying3Yu Yebing1，2Wang Zisheng1，2Qi Zhitao1
（1. School of Marine and Bioengineering，Yancheng Institute of Technology，Yancheng 224051；2. Jiangsu Provincial Key Laboratory of Coastal Pond Aquaculture Ecology，Yancheng，224051；3. East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Science，Shanghai 200090）

Total superoxide dismutase（T-SOD）activities were investigated in hepatopancreas， muscle and gill of Macrobrachium nipponense at 3 h， 6 h， 9 h， 12 h， 24 h， 5 d and 10 d after being challenged by Streptococcus dysgalactiae equisimilis at levels of 0.6×106， 2×106，4×106or 6×106CFU/mL in this study. Results showed that activity of T-SOD in hepatopancreas of the prawn reached the maximum at 5 d after infection. The values in muscle and gill reached to a maximum at 6 h. The activities of T-SOD in the hepatopancreas and gill of prawns infected with 6×106CFU/mL bacteria， in the muscle of prawns infected with 4 × 106or 6 × 106CFU/mL bacteria at 10 d decreased to about half of that in the control group. And the maximum in muscles was higher than those in hepatopancreas and gills. The results showed that Streptococcus dysgalactiae equisimilis could affect the activity of SOD in M. nipponense， and the response of the prawn to the bacteria was different in hepatopancreas， muscle and gill.

Streptococcus dysgalactiae equisimilis；Macrobrachium nipponense；total superoxide dismutase（T-SOD）

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.032

2014-08-20

國家自然科學基金項目（31101887），江蘇省自然科學基金資助項目（BK2011419，BK2012675）

趙衛(wèi)紅，女，副教授，博士，研究方向：水產(chǎn)經(jīng)濟動物繁殖生理與營養(yǎng)；E-mail：misszwh@163.com

張鳳英，女，副研究員，研究方向：水產(chǎn)生物遺傳育種；E-mail：zhangfy76@126.com