才蕾 矯麗媛 王繼華 唐時(shí)幸

（廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司，廣州 510660）

甲胎蛋白的原核表達(dá)及復(fù)性優(yōu)化

才蕾 矯麗媛 王繼華 唐時(shí)幸

（廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司，廣州 510660）

構(gòu)建甲胎蛋白的原核表達(dá)載體pET32a-AFP，對(duì)包涵體形式表達(dá)的甲胎蛋白進(jìn)行復(fù)性優(yōu)化。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET32a-AFP轉(zhuǎn)化入E.coli，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)親和層析純化獲得AFP包涵體，通過對(duì)復(fù)性過程、pH、添加劑等的研究摸索，獲得最佳復(fù)性條件。當(dāng)采用添加0.5 mol/L L-精氨酸的一步法透析復(fù)性方法，且透析液pH值為8.5，重組人AFP包涵體蛋白起始濃度為1.0 mg/mL時(shí)，復(fù)性效率最高。該復(fù)性方法獲得蛋白質(zhì)具有較高的回收率且操作簡(jiǎn)便。

甲胎蛋白；原核表達(dá)；復(fù)性

甲胎蛋白（Alpha fetoprotein，AFP）是存在于人胚胎血清中的主要糖蛋白，其蛋白質(zhì)部分包含590個(gè)氨基酸殘基，與維生素D結(jié)合蛋白，人L-白蛋白以及人血清白蛋白共同組成血清樣蛋白家族。這類蛋白質(zhì)高度同源并且具有相似的分子量，均為65-70 kD間。甲胎蛋白可以作為多種疾病的檢測(cè)標(biāo)志物，如婦科腫瘤、肝癌［1］以及甲狀腺功能減退和神經(jīng)退行性疾病等［2］。

甲胎蛋白質(zhì)的重組表達(dá)已有文獻(xiàn)報(bào)道，如劉繼洪等［3］構(gòu)建表達(dá)載體以大腸桿菌表達(dá)甲胎蛋白，鄧小玲［4］和Yamamoto等［5］成功將甲胎蛋白在真核細(xì)胞中，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母中進(jìn)行表達(dá)等。已有的文獻(xiàn)均顯示，原核表達(dá)的AFP均以包涵體形式存在于大腸桿菌［6］，而蛋白質(zhì)的復(fù)性條件對(duì)其構(gòu)象和活性有著重要的影響［7］。包涵體蛋白復(fù)性是一個(gè)復(fù)雜的過程，除了對(duì)復(fù)性條件和過程進(jìn)行控制外，很大程度上與蛋白自身的氨基酸組成和結(jié)構(gòu)特性相關(guān)。本研究在成功以原核方式表達(dá)重組人甲胎蛋白（rhAFP）并獲得純化蛋白之后，對(duì)影響rhAFP復(fù)性進(jìn)程和條件等進(jìn)行研究，最終摸索出可獲得較高復(fù)性率的復(fù)性條件。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性核酸內(nèi)切酶Hind III、BamH I和T4 DNA ligase購(gòu)自TaKaRa公司；蛋白質(zhì)分子量Marker購(gòu)自Fermentas公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和小量質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；純化樹脂購(gòu)自GE公司。

控溫控速搖床（智誠(chéng)ZHWY-200B）；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝）；臺(tái)式低溫離心機(jī)（Thermo Legend RT+）；微量分光光度計(jì)（Thermo NanoDrop 2000c）；電泳儀（Bio-Rad PowerPac Basic）；凝膠成像儀（Bio-Rad Gel Doc XR+）；蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)（GE AKTA Purifier 100）。

1.2 方法

1.2.1 表 達(dá) 質(zhì) 粒pET32a-AFP的 構(gòu) 建 根 據(jù)Genbank：NM_001134.2的人甲胎蛋白基因mRNA的編碼序列，合成可表達(dá)該蛋白質(zhì)的DNA長(zhǎng)片段。為便于克隆，在5'端和3'端分別設(shè)計(jì)加入BamH I和Hind III酶切位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)兩側(cè)各加3個(gè)保護(hù)堿基。將上述合成片段和pET32a載體分別進(jìn)行雙酶切，回收目的片段并連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-AFP，并轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，通過提質(zhì)粒和質(zhì)粒雙酶切來驗(yàn)證陽性克隆，最后測(cè)序。

1.2.2 rhAFP蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）中的表達(dá) 將測(cè)序正確的pET32a-AFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），培養(yǎng)挑取單菌落，接種至5 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，以1%接種量接種至200 mL LB培養(yǎng)基中，待OD600nm達(dá)到0.8時(shí)，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)結(jié)束離心收集菌體，超聲破碎后取裂解產(chǎn)物，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.3 rhAFP蛋白的提取、變性與純化 BL21（DE3）表達(dá)的rhAFP主要以包涵體形式存在于超聲后沉淀中。將誘導(dǎo)后菌體在4℃，8 000 r/m離心10 min，收集菌體沉淀，以超聲緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，含100 mmol/L NaCl和2% Tween20）重懸，超聲裂解菌體（超聲時(shí)長(zhǎng)15 min，超聲2 s，間斷4 s，功率300 W）后再以4 ℃，12 000 r/min離心10 min，收集沉淀并將該沉淀進(jìn)行洗滌（20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，含2 mol/L尿素，2%TritonX-100和500 mmol/L NaCl），4℃，12 000 r/min離心10 min，獲得洗滌后的沉淀即為AFP包涵體粗提物，將該粗提物溶于8 mol/L尿素緩沖液中（20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，8 mol/L尿素），充分溶解后靜置室溫放置2 h，4℃，12 000 r/min離心30 min取上清即為AFP包涵體蛋白液。pET32a表達(dá)的AFP蛋白帶有6×His標(biāo)簽，可使用GE Healthcare的Ni-NTA填料進(jìn)行裝柱，親和層析純化變性后的AFP包涵體蛋白。

1.2.4 rhAFP蛋白的復(fù)性優(yōu)化 rhAFP包涵體蛋白復(fù)性采用透析復(fù)性法，考察了復(fù)性進(jìn)程（多步尿素梯度透析復(fù)性和一步法透析復(fù)性）對(duì)AFP包涵體復(fù)性后活性的影響。多步尿素梯度透析復(fù)性方案為，將上述制備好的AFP包涵體蛋白液裝入透析袋中，依次放置在4 mol/L尿素、2 mol/L尿素、1 mol/L尿素和0 mol/L尿素溶液中，分別在4℃磁力攪拌條件下透析12 h，最后將透析袋放置在蛋白保存液中繼續(xù)透析，最終獲得有活性的AFP蛋白；而一步法透析復(fù)性是直接將裝有AFP包涵體蛋白液的透析袋放置在0.8 mol/L尿素溶液中，4℃磁力攪拌條件下透析24 h，之后同樣將透析袋放置在蛋白保存液中繼續(xù)透析獲得有活性的AFP蛋白。

多步尿素梯度透析復(fù)性方案所選用的緩沖液配方分別為：（1）4 mol/L尿素溶液：4 mol/L尿素，20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，0.015% SDS，pH 8.0；（2）2 mol/L尿素溶液：2 mol/L尿素，20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，2 mmol/L DTT，0.015%SDS，pH 8.0；（3）1 mol/L尿素溶液：1 mol/L尿素，20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，2 mmol/L DTT，0.015%SDS，1 mmol/L GSH-0.2 mmol/L GSSG，pH 8.0；（4）0 mol/L尿素溶液：20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，2 mmol/L DTT，0.015% SDS，1 mmol/L GSH-0.2 mmol/L GSSG，pH 8.0；

一步法透析復(fù)性選用的緩沖液配方為：（1）0.8 mol/L尿素溶液：0.8 mol/L尿素，20 mmol/LTris-HCl，1 mmol/L EDTA，1.33 mmol/L GSH-1.33 mmol/L GSSG，pH 8.0；（2）蛋白保存液：20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，20%甘油，0.02%NaN3，pH 7.5。并在以上復(fù)性方案的基礎(chǔ)上，考察添加精氨酸、透析復(fù)性起始蛋白質(zhì)量濃度以及透析液pH值對(duì)復(fù)性后rhAFP活性的影響，進(jìn)而在優(yōu)化的復(fù)性條件下，實(shí)現(xiàn)rhAFP的最高復(fù)性效率。

1.2.5 rhAFP蛋白的分子量以及純度鑒定 配制濃度為12%的SDS-PAGE電泳膠，分別將誘導(dǎo)后、超聲上清與純化后蛋白溶液進(jìn)行上樣檢測(cè)，電泳后染色脫色，以Bio-Rad凝膠成像儀記錄電泳情況。

1.2.6 透析復(fù)性后rhAFP蛋白的活性檢測(cè)及復(fù)性效果評(píng)價(jià) 將透析復(fù)性后的rhAFP蛋白用蛋白保存液進(jìn)行稀釋，使用Wondfo甲胎蛋白（AFP）定量檢測(cè)試劑盒（熒光免疫層析法，檢測(cè)范圍5-400 ng/mL）對(duì)稀釋后的rhAFP蛋白進(jìn)行活性檢測(cè)，并計(jì)算AFP復(fù)性效率（具有AFP活性的蛋白質(zhì)量/全部蛋白總量）作為評(píng)價(jià)透析復(fù)性方法。

2 結(jié)果

2.1 pET32a-AFP表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

將提取的質(zhì)粒pET32a-AFP用BamH I和Hind III雙酶切，鑒定酶切后的條帶與載體片段和基因片段大小吻合（圖1），且質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果正確，重組質(zhì)粒pET32a-AFP構(gòu)建成功。

圖1 表達(dá)質(zhì)粒pET32a-AFP的酶切鑒定

2.2 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

AFP基因編碼590個(gè)氨基酸，其理論分子量為66.3 kD，選用的pET32a載體上含有硫氧還蛋白融合蛋白和多肽（Trx-tag）及S-tag、His-tag等，所以最終獲得AFP融合蛋白的理論分子量約為85.5 kD。圖2-A所示在85 kD左右有明顯的蛋白表達(dá)條帶，以未誘導(dǎo)基因工程菌株作為對(duì)照，可證實(shí)為目的蛋白，與預(yù)期結(jié)果一致，且目的蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。凝膠掃描成像，Bio-Rad軟件分析顯示目的蛋白表達(dá)量可達(dá)細(xì)菌總蛋白的20.1%。通過Ni親和純化后，可獲得純度達(dá)90%以上的AFP蛋白（圖2-B）。

圖2 AFP表達(dá)產(chǎn)物及其純化后蛋白的SDS-PAGE分析

2.3 復(fù)性過程對(duì)rhAFP活性的影響

包涵體蛋白復(fù)性過程是一個(gè)去除變性劑，使蛋白由完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常折疊結(jié)構(gòu)的過程，大多數(shù)包涵體蛋白進(jìn)行折疊發(fā)生在尿素濃度為4 mol/L到2 mol/L之間，但是由于蛋白自身的氨基酸組成和結(jié)構(gòu)特性的差異，復(fù)性過程也不盡相同，選擇合適的復(fù)性進(jìn)程和方案對(duì)最終獲得有活性的蛋白至關(guān)重要。另外，L-精氨酸可以通過提高蛋白折疊中間體的溶解性或者阻礙聚集體的形成來促進(jìn)包涵體蛋白的有效復(fù)性。

試驗(yàn)考察了多步尿素梯度和一步法透析復(fù)性，以及在一步法透析復(fù)性緩沖液中添加0.5 mol/L L-精氨酸，對(duì)rhAFP復(fù)性后活性的影響。設(shè)置最高AFP蛋白活性為100%，以相對(duì)蛋白活性來表征各透析復(fù)性方案對(duì)其復(fù)性后活性的影響，圖3所示，rhAFP蛋白復(fù)性，一步法的快速透析復(fù)性方案較多步尿素梯度緩慢復(fù)性效果好，且添加精氨酸有助于rhAFP的復(fù)性，可提高rhAFP蛋白活性。

2.4 rhAFP起始濃度對(duì)AFP復(fù)性的影響

rhAFP包涵體蛋白采用添加0.5 mol/L L-精氨酸的一步法透析復(fù)性，復(fù)性透析液pH8.0，設(shè)置不同起始蛋白質(zhì)量濃度（0.1-1.5 mg/mL），以最高的AFP蛋白活性為100%，用相對(duì)蛋白活性來表征各起始蛋白質(zhì)量濃度對(duì)其復(fù)性后活性的影響。結(jié)果如圖4所示，不同濃度rhAFP蛋白液對(duì)其透析復(fù)性后的活性影響較大，活性隨著濃度升高，先升高后降低，在1.0 mg/mL時(shí)，活性值為最大。

圖3 各包涵體蛋白透析復(fù)性方案對(duì)AFP活性的影響

圖4 起始蛋白質(zhì)量濃度對(duì)復(fù)性后活性的影響

2.5 pH對(duì)rhAFP復(fù)性的影響

復(fù)性透析液中rhAFP起始濃度為1.0 mg/mL，檢測(cè)不同pH值對(duì)復(fù)性后AFP活性的影響，以最高的AFP蛋白活性為100%，用相對(duì)蛋白活性來表征各pH值對(duì)其復(fù)性后活性的影響，結(jié)果如圖5所示，不同pH值的透析液對(duì)其復(fù)性后的活性影響較大，活性隨著透析液pH值升高而逐漸提高，且pH值在8.5時(shí)活性值趨于平衡，堿性條件有利于AFP包涵體蛋白復(fù)性。

圖5 復(fù)性pH值對(duì)AFP復(fù)性后活性的影響

2.6 優(yōu)化后的rhAFP透析復(fù)性效率

綜合以上優(yōu)化的AFP包涵體蛋白透析復(fù)性條件，對(duì)rhAFP進(jìn)行復(fù)性，即添加0.5 mol/L L-精氨酸的一步法透析復(fù)性，透析液pH8.5，rhAFP包涵體蛋白濃度1.0 mg/mL，4℃透析24 h后，放入蛋白保存液中繼續(xù)透析，最后收集并測(cè)定AFP活性。此條件下，AFP復(fù)性效率達(dá)10%，即具有AFP活性的蛋白占蛋白總量的10%。

3 討論

甲胎蛋白是多種疾病，包括婦科腫瘤和肝癌等的檢測(cè)標(biāo)志物。獲得具有反應(yīng)活性的AFP蛋白質(zhì)不僅可以用作免疫原來免疫動(dòng)物制備抗體，而且可應(yīng)用在定量檢測(cè)試劑中作為質(zhì)控品使用。

原核表達(dá)體系不僅為蛋白質(zhì)研究提供了必要的工具，其成本低、周期短、易獲取的優(yōu)點(diǎn)使得其成為蛋白質(zhì)研究和生產(chǎn)的重要手段。但由于蛋白質(zhì)異源表達(dá)宿主可能缺乏某些蛋白質(zhì)折疊所需的輔助因子或調(diào)節(jié)蛋白折疊機(jī)制，以及環(huán)境不適等，使得折疊過程中無法形成正確的次級(jí)鍵，蛋白質(zhì)失去原有的特性和功能，最終以包涵體形成存在。包涵體蛋白復(fù)性方法的探索將最終決定其復(fù)性率的大小和獲得重組蛋白生物活性的高低，然而對(duì)于不同的包涵體，其自身結(jié)構(gòu)和特性的不同，決定了其特定的復(fù)性途徑［8］。而對(duì)于復(fù)性方法，被采用最多的方法包括稀釋復(fù)性［9］、透析復(fù)性以及柱上復(fù)性［10］等。對(duì)于包涵體蛋白，沒有哪一種方法是可以適用于所有蛋白的“萬金油”，只有針對(duì)相應(yīng)蛋白的特性，摸索最佳方法才可獲得更好的復(fù)性收率。甲胎蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)曾有多人報(bào)道［11］，復(fù)性方法的研究也有文獻(xiàn)報(bào)道［12］。本研究著重摸索最佳復(fù)性條件以獲得最高收率，同時(shí)也考慮了操作的簡(jiǎn)便性，最終對(duì)表達(dá)的AFP包涵體蛋白進(jìn)行透析復(fù)性方案和條件的研究，獲得了最佳AFP復(fù)性率可達(dá)到10%左右。

4 結(jié)論

利用pET-32a載體表達(dá)的甲胎蛋白以包涵體形式存在于大腸桿菌中，表達(dá)量約占總蛋白含量的25%。甲胎蛋白復(fù)性采用一步透析法，在透析液pH為8.5，添加終濃度為0.5 mol/L的L-精氨酸，且包涵體蛋白起始濃度為1.0 mg/mL時(shí)，復(fù)性效率最高。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Prokaryotic Expression of Alpha Fetoprotein and Optimization of Renaturation

Cai Lei Jiao Liyuan Wang Jihua Tang Shixing
（Guangzhou Wondfo Biotech Co.，Ltd，Guangzhou 510660）

Plasmid pET32a-AFP was constructed to express recombinant human alpha fetoprotein， which was in the form of inclusion body， and the protein was obtained after renaturing optimization. The recombinant plasmid pET32a-AFP was transformed in E.coli， after induced by IPTG and purified by affinity column， the inclusion body was renatured under different conditions， including renature method， pH and addictives. The results showed that it had the highest renature efficiency when 1.0 mg/ml AFP was processed under one-step dialysis renature method and the pH is 8.5， with 0.5 mol/L L-Arg. This renature process made the recombinant AFP protein having the highest efficiency and easy to manipulate.

alpha-fetoprotein；prokaryotic expression；renaturation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.029

2014-05-07

才蕾，女，工程師，博士，研究方向：診斷試劑研發(fā)；E-mail：leicai@wondfo.com.cn

唐時(shí)幸，男，高級(jí)工程師，博士，研究方向：診斷試劑研發(fā)；E-mail：tang.shixing@wondfo.com.cn