趙慶亮 楊素芳 梁田 張殿卿 楊霞 盛金良

（石河子大學(xué)動物科技學(xué)院 人獸共患病實(shí)驗(yàn)室，石河子 832003）

嗜吞噬細(xì)胞無形體msp4蛋白的生物信息學(xué)分析及表達(dá)鑒定

趙慶亮 楊素芳 梁田 張殿卿 楊霞 盛金良

（石河子大學(xué)動物科技學(xué)院 人獸共患病實(shí)驗(yàn)室，石河子 832003）

分析預(yù)測嗜吞噬細(xì)胞無形體msp4蛋白的抗原性，對嗜吞噬細(xì)胞無形體的msp4蛋白采用生物信息學(xué)對其進(jìn)行分析二級結(jié)構(gòu)，親水性，疏水性，B細(xì)胞線性表位；根據(jù)分析的優(yōu)勢抗原表位區(qū)，進(jìn)行基因合成并亞克隆至pET32a表達(dá)載體，在大腸埃希菌中獲得重組蛋白。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示msp4蛋白由283個(gè)氨基酸組成，分子量為29.8 ku，理論等電點(diǎn)為6.05，不穩(wěn)定系數(shù)為32.79，總平均疏水性為0.063；二級結(jié)構(gòu)預(yù)測msp4蛋白主要以無規(guī)卷曲、延伸鏈、α-螺旋為主；B細(xì)胞表位預(yù)測msp4蛋白有14個(gè)線性表位；根據(jù)分析的結(jié)果選取msp4蛋白親水性高的膜外區(qū)的28-158位序列克隆至pET32a進(jìn)行原核表達(dá)，在34 ku出有目的蛋白的表達(dá)。成功對嗜吞噬細(xì)胞無形體的msp4蛋白原核表達(dá)及純化，為無形體病血清學(xué)檢測方法的建立奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

嗜吞噬細(xì)胞無形體；生物信息學(xué)分析；msp4蛋白；原核表達(dá)

人粒細(xì)胞無形體病（human granulocytic anaplasmosis，HGA）是由嗜吞噬細(xì)胞無形體經(jīng)蜱傳播一種新發(fā)的人獸共患病，臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、不適、頭痛及肌痛等，并伴有白細(xì)胞和血小板減少，轉(zhuǎn)氨酶升高和多器官功能損傷。1994年美國首次報(bào)道該病例后［1］，2006年我國首次在安徽省發(fā)現(xiàn)人粒細(xì)胞無形體病例［2］。該病臨床癥狀與某些病毒性疾病相似，容易誤診，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡［3］。

嗜吞噬細(xì)胞無形體（Anaplasma phagocytophilum，APH）屬立克次氏體目無形體科無形體屬，是專性的胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性球桿菌，直徑約為0.2-2 μm，中性粒細(xì)胞是它的特異性宿主細(xì)胞［4］。嗜吞噬細(xì)胞無形體的傳播媒介在我國主要為硬蜱，宿主主要有白足鼠、山羊、綿羊等家畜動物［5，6］。

目前診斷該病原的方法主要依據(jù)PCR檢測和IFA（間接免疫熒光），病原分離等方法，但是這些方法要求試驗(yàn)條件高，不易操作，成本高等缺點(diǎn)。目前通過生物信息學(xué)的方法分析嗜吞噬細(xì)胞無形體的msp4基因，獲取其優(yōu)勢抗原表位區(qū)，進(jìn)行原核表達(dá)和純化，經(jīng)WB驗(yàn)證蛋白的免疫原性，可作為候選診斷抗原，為研究形體病的血清學(xué)檢測方法的建立提供生物材料。

1 方法與材料

1.1 材料

嗜吞噬細(xì)胞無形體msp4蛋白的氨基酸序列來源于GenBank，序列登錄號為AFD54597.1，E. coil DH5α和BL21（DE3）菌株及pET32a載體均由本實(shí)驗(yàn)室保存。瓊脂糖膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司，T4 連接酶、EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 從NCBI網(wǎng)站（http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/）GenBank上查找嗜吞噬細(xì)胞無形體（NY18 株）MSP4膜蛋白完整的基因序列（JQ522935.1）和氨基酸序列（AFD54597.1）；利用ExPASy蛋白分析專家（http：//www.Expasy.org/tools）服務(wù)器中的ProtParam程序預(yù)測蛋白的基本組成，等電點(diǎn)、吸光系數(shù)、脂肪族系數(shù)、親水系數(shù)等；利用ExPASy蛋白分析專家服務(wù)器中的SOPMA程序預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)；利用在線軟件TMHMM 2.0（http：// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測蛋白的跨膜區(qū)；利用抗原表位分析軟件（Immune Epitope Database Analysis Resource）（http：//tools.immuneepitope.org/ main/html/bcell_tools.html） 的Parker Hydrophilicity， Bepipred Linear Epitope方法預(yù)測蛋白親水性和氨基酸水平的B細(xì)胞表位。

1.2.2 原核表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)生物信息學(xué)分析的結(jié)果，選取msp4蛋白的優(yōu)勢抗原區(qū)，進(jìn)行人工基因合成，在兩端分別添加限制性酶EcoRⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)。用限制性酶切酶EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切目的基因，同法酶切pET32a載體。用瓊脂糖膠回收試劑盒將酶切的目的基因和載體回收，然后16℃過夜連接轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布氨芐抗生素抗性平板，挑取抗性平板上的單個(gè)細(xì)菌進(jìn)行液體培養(yǎng)之后，進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，PCR驗(yàn)證的陽性克隆菌進(jìn)行37℃過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.2.3 原核表達(dá)及純化 將酶切鑒定的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化表達(dá)菌進(jìn)行培養(yǎng)，37℃搖床培養(yǎng)至OD600為0.45-0.6，在不同濃度（0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L）誘導(dǎo)劑IPTG，不同時(shí)間（2、6、6和8 h）條件下誘導(dǎo)pET32a-msp4重組蛋白的表達(dá)，于誘導(dǎo)前收菌1 mL，誘導(dǎo)的不同時(shí)間段收菌1 mL，離心菌液進(jìn)行SDSPAGE分析。此外，另取100 mL經(jīng)誘導(dǎo)6 h的菌液，收集菌體沉淀，用5 mL的PBS重懸菌體，超聲破碎菌體（工作循環(huán)30次，超聲10 s，間隔10 s），然后將裂解液離心，分別收集上清和沉淀（包涵體）進(jìn)行SDS-PAGE分析。鑒別目的蛋白是以可溶性形式存在于上清液中還是以包涵體形式存在于沉淀中。對以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白用8 mol/L濃度尿素進(jìn)行變性處理，包涵體溶解后采用鎳離子親和層析法純化，將純化的蛋白利用透析袋復(fù)性，對復(fù)性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.4 重組msp4蛋白的多抗制備及Western blotting鑒定 取純化的msp4重組蛋白200 μg與等量的弗氏完全佐劑混合，充分乳化后免疫小白鼠，2周后100 μg的蛋白與等量的弗式不完全佐劑混合進(jìn)行加強(qiáng)免疫，末次加強(qiáng)免疫劑量為50 μg/只，第3次免疫10 d后心臟采血，分離血清，進(jìn)行Western blotting 鑒定。純化的msp4重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分析后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h，將免疫過小白鼠分離的血清作為一抗（1∶100）作用1 h，用TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠（1∶5 000）作用1 h，TBST緩沖液洗滌3次，在二氨基聯(lián)苯胺（DAB）緩沖溶液中顯色3-5 min后加去離子水終止。

2 結(jié)果

2.1 msp4的生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.1.1 ProtParam工具分析結(jié)果 根據(jù)ProtParam軟件預(yù)測表面msp4基因編碼的蛋白分子式為：C1333H2035N347O413S10，分子量為29.8 ku，理論等電點(diǎn)為6.05；msp4蛋白的組成含量最多的氨基酸是：Ser（13.5%），Ala（11%），Gly（9.6%），Val（8.2%）；Leu（6.0%），Asn（5.7%），Tyr（5.7%）；帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）為24，帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）為21；不穩(wěn)定系數(shù)為32.79，為穩(wěn)定蛋白（標(biāo)準(zhǔn)40以下的為穩(wěn)定蛋白）；預(yù)測的半衰期30 h（體外哺乳動物網(wǎng)狀細(xì)胞），＞20 h（酵母菌體內(nèi)），＞10 h（大腸桿菌體內(nèi)）；脂肪系數(shù)平均為78.90，總平均疏水性為0.063。

2.1.2 SOPMA預(yù)測msp4蛋白的二級結(jié)構(gòu) 利用ExPASy蛋白分析專家服務(wù)器中的SOPMA程序?qū)sp4蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。預(yù)測msp4蛋白的二級結(jié)構(gòu)包括282個(gè)氨基酸，其中129個(gè)氨基酸（占45.74%）可能形成無規(guī)卷曲（c），75個(gè)氨基酸（占26.60%）可能形成延伸鏈（e），57個(gè)氨基酸（占20.21%）可能形成α-螺旋（h），21個(gè)氨基酸（占7.45%）可能形成β-轉(zhuǎn)角（t）。無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)主要位于氨基酸的第10-12、30-40、52-61、87-99、154-161、242-260區(qū)段；α-螺旋結(jié)構(gòu)主要位于氨基酸的第1-8、13-20、126-135、205-212區(qū)段，延伸鏈結(jié)構(gòu)在氨基酸中的分布均一。由以上預(yù)測結(jié)果可知該蛋白質(zhì)主要以無規(guī)卷曲、延伸鏈、α-螺旋為主。

2.1.3 msp4蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果 借用TMHMM 2.0在線軟件預(yù)測蛋白的跨膜區(qū)（圖1）。從圖1中可看出大約第1-6位氨基酸位于膜內(nèi)的可能性比較大，第30-282位氨基酸位于膜外的可能性比較大，第7-29位氨基酸可能存在跨膜區(qū)。

圖1 TMHMM2.0預(yù)測msp4蛋白跨膜區(qū)

2.1.4 msp4蛋白的親水性預(yù)測結(jié)果 對msp4蛋白的親水性分析結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示該蛋白包含多個(gè)親水性區(qū)域，主要分布在27-43、51-56、64-98、110-145、152-159、217-221、235-238、249-269這個(gè)區(qū)段，其中27-43、64-98、135-145區(qū)段親水性較高。

圖2 msp4蛋白的親水性分析

2.1.5 msp4蛋白的抗原表位分析 根據(jù)蛋白表位分析中的B細(xì)胞線性表位分析模塊分析msp4蛋白結(jié)果見圖3，msp4蛋白包含有14個(gè)線性表位，其中以 28-42、50-59、65-77、87-100、111-118、135、137-138、140-143、154-158、188-190、245-251、253-257、259-263區(qū)段是msp4蛋白的優(yōu)勢抗原表位區(qū)段，明確msp4蛋白的線性表位區(qū)段，為獲得特異性的抗原區(qū)段提供了較好的依據(jù)。

圖3 msp4蛋白的B細(xì)胞線性表位預(yù)測

2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

選取msp4蛋白的優(yōu)勢抗原區(qū)段第28-158位氨基酸作為目的表達(dá)基因進(jìn)行人工合成，將目的基因連到pET32a原核表達(dá)載體，經(jīng)雙酶切驗(yàn)證目的基因插入到表達(dá)載體，測序結(jié)果表明，合成的基因序列正確無誤的插入到pET32a原核表達(dá)載體

2.3 pET32a-msp4原核表達(dá)和純化

在37℃、IPTG濃度為1.0 mmol/L誘導(dǎo)時(shí)間為6 h時(shí)，蛋白表達(dá)條件最佳（圖4）。將誘導(dǎo)收集菌液超聲破碎，分別收集上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示目的蛋白大部分都是以包涵體的形式存在，包涵體經(jīng)尿素變性、鎳離子親和層析法純化及透析復(fù)性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示獲得了分子量為34 ku的msp4重組蛋白。

圖4 msp4重組蛋白的SDS-PAGE電泳分析

2.4 重組msp4蛋白多抗效價(jià)測定和Western blotting鑒定

以純化的重組msp4蛋白為包被抗原，利用間接ELISA對純化后的多抗進(jìn)行了效價(jià)測定，以多抗孔的OD值對陰性對照孔的OD值的比值（P/N）大于2.1時(shí)，多抗的最高稀釋度為多抗的效價(jià)。結(jié)果表明，純化后的多抗效價(jià)為1∶51200。

取純化的重組msp4蛋白做SDS-PAGE，然后將純化的多抗作為一抗進(jìn)行Western blotting檢測。結(jié)果（圖5）表明多抗能與重組msp4蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。

圖5 Western blotting分析結(jié)果

3 討論

嗜吞噬細(xì)胞無形體作為一種新發(fā)的人獸共患病原體，可以引起反芻動物的蜱咬熱［7］、馬邊蟲病［8］、HGA［9］。自1994年美國首次報(bào)道人粒細(xì)胞無形體病例，嗜吞噬細(xì)胞無形體引起人粒細(xì)胞無形體病的報(bào)道日益增多，2010年Huang等［10］報(bào)道HGA是美國第二大的蜱傳播的疾病。美國從2000年至2010年人粒細(xì)胞無形體病的發(fā)病例由348例增加至1 761例，平均每百萬人1.4個(gè)病例上升至每百萬6.1個(gè)病例。分子生物學(xué)及人群血清學(xué)檢測證實(shí)該病原體在中國及周邊國家存在，2006年天津地區(qū)的高危人群人粒細(xì)胞無形體病的陽性率為8.8%［11］，2009年山東沂源地區(qū)正常人群人粒細(xì)胞無形體IgG抗體陽性率為26.7%［12］，2011年張麗娟等［13］報(bào)道新疆伊犁地區(qū)人無形體IgG抗體陽性率為5.3%，2013年劉志杰等［14］報(bào)道甘肅地區(qū)的綿羊的PCR檢出率為42.9%，山羊?yàn)?8.5%；說明我國存在自然感染的嗜吞噬細(xì)胞無形體，可能會給人們的健康安全帶來危害。

目前嗜吞噬細(xì)胞無形體診斷的主要方法有：外周血涂片鏡檢中性粒細(xì)胞內(nèi)可見桑葚狀包涵體；急性期特異性IgM陽性；急性期及恢復(fù)期雙份血清免疫熒光法（IFA）檢測到特異抗體（IgG）滴度升高或降低4倍及以上；急性期全血或血細(xì)胞標(biāo)本PCR檢測到嗜吞噬細(xì)胞無形體特異性核酸陽性，且序列分析證實(shí)與嗜吞噬細(xì)胞無形體的同源性達(dá)99%以上等，其中以IFA和PCR為重要的檢測手段。國內(nèi)關(guān)于無形體病的血清學(xué)檢測的方法研究較少，目前國內(nèi)的主要檢測使用的是美國FOCUS生產(chǎn)的無形體IgG免疫熒光試劑盒，缺少于成品檢測試劑盒，這就對國內(nèi)的嗜吞噬細(xì)胞無形體的快速診斷提出了挑戰(zhàn)。Zhi等［15］對嗜吞噬細(xì)胞無形體44 kD蛋白成功實(shí)現(xiàn)了原核重組表達(dá)，并對重組表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了血清學(xué)診斷評價(jià)，結(jié)果顯示用重組蛋白作為抗原進(jìn)行診斷特異性和一致性更明顯，而且通過原核表達(dá)制備重組蛋白遠(yuǎn)比培養(yǎng)細(xì)胞、轉(zhuǎn)染、收集菌體、純化抗原的途徑簡單得多。Msp4蛋白是嗜吞噬細(xì)胞無形體的一個(gè)主要表面蛋白，本試驗(yàn)利用生物信息的方法對msp4蛋白進(jìn)行分析，通過分析獲得msp4優(yōu)勢抗原區(qū)段，進(jìn)行原核表達(dá)，并進(jìn)行蛋白純化?？梢詫⒅亟M純化的msp4蛋白作為血清學(xué)檢測的備選材料，為無形體的血清學(xué)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

嗜吞噬細(xì)胞無形體的msp4基因含有完整的開放閱讀框（846 bp），編碼283個(gè)氨基酸，分子量為29.8 ku，理論等電點(diǎn)為6.05；二級結(jié)構(gòu)預(yù)測msp4蛋白主要以無規(guī)卷曲、延伸鏈、α-螺旋為主；B細(xì)胞表位預(yù)測msp4蛋白有14個(gè)線性表位。根據(jù)分析的結(jié)果選取msp4蛋白親水性高的膜外區(qū)的28-158位序列克隆至pET32a進(jìn)行原核表達(dá)，在34 ku出有目的蛋白的表達(dá)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Expression and Bioinformatics Analysis of the msp4 Protein of Anaplasma Phagocytophilum

Zhao Qingliang Yang Sufang Liang Tian Zhang Dianqing Yang Xia Sheng Jinliang
（College of Animal Science and Technology of Shihezi University，Shihezi 832003）

The purpose of this study was to analysis the antigenicity of msp4 protein of anaplamsa phagocytophilum. The informatics analysis was used to predict and analyze the important parameters of the msp4 protein， such as the physical and chemical properties， protein secondary structure， and its hydrophilicity， hydrophicity， bepipred linear epitope. According to the advantage epitope， we selected the high hydrophilic region of protein membrane outside domains， and cloned to pET32a prokaryotic expression vector. The bioinformatics analysis revealed that the msp4 protein was composed of 283 amino acids， and that its isoelectric point was 6.52. The msp4 protein was an stable hydropathilic protein（the instablility coefficient was 32.79， the grand average of hydropathicity was 0.063）. The secondary structure of the msp4 protein was mainly composed of random coils， extended strands， and alpha helixes. B cell epitope predicted that the msp4 protein has 14 linear epitopes. From the result of bioinformatics analysis， we selected the the 28-158 aa of the high hydrophilic region of protein membrane outside domains， and cloned to pET32a prokaryotic expression vector， the msp4 protein was successfully expressed and purified. The expressed and purified the recombinant msp4 protein lays a material foundation for the establishment of serological methods for anaplasma phaagocytophilum detection.

anaplasma phagocytophilum；bioinformatics analysis；msp4 protein；prokaryotic expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.034

2014-02-20

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃資助（2010CB53020X）

趙慶亮，男，碩士研究生，研究方向：動物疾病病理；E-mail：zhaoqingliang2009@126.com

盛金良，副教授，E-mai：sjlshz@126.com