劉黎明孫偉張金噸趙麗霞李樹裕王標(biāo)陳楊林胡樹香吳寶江李喜和，

（1.內(nèi)蒙古大學(xué)蒙古高原動(dòng)物遺傳資源研究中心，呼和浩特010021；2.內(nèi)蒙古賽科星繁育生物技術(shù)股份有限公司，呼和浩特011517）

Xist基因抑制對(duì)牛SCNT早期胚胎發(fā)育的影響

劉黎明1孫偉2張金噸1趙麗霞2李樹裕2王標(biāo)1陳楊林1胡樹香2吳寶江2李喜和1，2

（1.內(nèi)蒙古大學(xué)蒙古高原動(dòng)物遺傳資源研究中心，呼和浩特010021；2.內(nèi)蒙古賽科星繁育生物技術(shù)股份有限公司，呼和浩特011517）

Xist是與X染色體失活相關(guān)的非編碼基因，它在合子期基因組開始表達(dá)，是胚胎發(fā)育早期表達(dá)的第一個(gè)印記基因。探討了特異性抑制Xist的TALER-REPRESSOR（TALER）載體轉(zhuǎn)染到胎牛成纖維細(xì)胞對(duì)Xist基因的抑制作用，并以抑制Xist基因表達(dá)的細(xì)胞作為核供體制作克隆胚胎，研究Xist基因抑制對(duì)?？寺∨咴缙诎l(fā)育的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組細(xì)胞相比，TALER載體將Xist相對(duì)表達(dá)量下調(diào)了93.85%，說明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的載體轉(zhuǎn)染系統(tǒng)能夠有效抑制Xist基因的表達(dá)。選取Xist抑制表達(dá)陽性的轉(zhuǎn)染細(xì)胞用于體細(xì)胞核移植試驗(yàn)，克隆胚胎發(fā)育結(jié)果顯示，試驗(yàn)組和對(duì)照組的卵裂率、8細(xì)胞發(fā)育率、桑葚胚發(fā)育率和囊胚發(fā)育率分別為78.8% vs 75.1%（P＞0.05，無顯著差異）、54.4% vs 50.6%（P＞0.05，無顯著差異）、12.3% vs 27.8%（P＜0.01，差異極顯著）、0 vs 26.6%（P＜0.01，差異極顯著）。綜上所述，試實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的特異性抑制Xist表達(dá)的TALER載體可有效抑制雌性胎牛成纖維細(xì)胞中Xist的表達(dá)。供體細(xì)胞Xist這種基因下調(diào)可使克隆胚胎2-8細(xì)胞率略有提升，但囊胚期和桑葚胚率明顯降低。因此，其機(jī)制尚待于進(jìn)一步探討。

Xist基因；TALER載體；胎牛成纖維細(xì)胞；克隆胚胎早期發(fā)育

Xist（X-inactive specific transcript）是一個(gè)與X染色體失活相關(guān)的非編碼RNA基因，在受精合子期開始激活，是胚胎早期發(fā)育表達(dá)的第一個(gè)印記基因［1］。盡管Xist是在雌性動(dòng)物中參與X染色體失活，但Xist RNA的功能尚未被完全認(rèn)知［2］。在動(dòng)物克隆胚胎發(fā)育中，許多的基因表達(dá)異常［3］，Xist也是這些異常表達(dá)基因之一［4］。前期研究表明，利用Xist基因缺陷型供體細(xì)胞用于克隆試驗(yàn)，可成功將小鼠克隆效率提高8-9倍［5］。目前，尚未有研究抑制牛供體細(xì)胞Xist基因表達(dá)水平對(duì)牛體細(xì)胞核移植影響的研究。

TALER（TALE-REPRESSOR）技術(shù)是利用TALE（Transcription activator-like effector）蛋白特異性識(shí)別DNA序列的特性將轉(zhuǎn)錄抑制因子REPRESSOR結(jié)合到目標(biāo)基因上進(jìn)而抑制基因轉(zhuǎn)錄的技術(shù)［6-8］。TALE蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域由33-35個(gè)氨基酸的重復(fù)序列組成，每一個(gè)重復(fù)序列的第12、13是兩個(gè)不同的氨基酸，可以識(shí)別不同的堿基。根據(jù)目標(biāo)基因?qū)⑷舾蓚€(gè)重復(fù)序列順序組裝就可以對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行特異性識(shí)別。REPRESSOR 是來自于Krüppel家族鋅指蛋白中廣泛存在且十分保守的KRAB（Krüppelassociated box）結(jié)構(gòu)域，由75個(gè)氨基酸構(gòu)成，具有轉(zhuǎn)錄抑制功能［9，10］。將人工組裝的TALE蛋白與轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域KRAB融合，即構(gòu)成TALER載體［11］，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄抑制。

本研究利用特異性識(shí)別牛Xist基因的TELER載體，研究抑制牛成纖維細(xì)胞Xist基因表達(dá)效果，并進(jìn)一步探討了對(duì)?？寺∨咛ピ缙诎l(fā)育的影響，以期為進(jìn)一步提高牛體細(xì)胞克隆效率提供基礎(chǔ)技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞總RNA提取試劑盒（74104）、PCR試劑盒（200403）、基因組DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（A3500）購自Promega公司，細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒（VPI-1002）購自LONZA公司。強(qiáng)力霉素（Dox）誘導(dǎo)型Xist mCherry-TALER載體、rtTa載體、pBase載體由英國Sanger研究所劉鵬濤實(shí)驗(yàn)室提供。胎牛成纖維細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室建立儲(chǔ)存；牛卵巢由呼和浩特屠宰廠提供。

1.2 方法

1.2.1 PCR試驗(yàn) 分別用基因組DNA提取試劑盒與總RNA提取試劑盒提取牛胎兒成纖維細(xì)胞的基因組DNA、總RNA，并將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為PCR反應(yīng)的模板。根據(jù)NCBI中牛Xist cDNA序列（NR_001464.2），應(yīng)用primer5.0設(shè)計(jì)Xist引物、SRY引物，并由Invitrogen公司合成，引物序列及擴(kuò)增片段大小見表1。根據(jù)PCR試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，采用以下條件擴(kuò)增：94℃，4 min；94℃，30 s；60-68℃，30 s；72℃，30 s；30個(gè) 循 環(huán)；72℃，5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測。根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa）配制反應(yīng)體系，以β-actin為內(nèi)參用Real-time PCR儀（CFX96，BIO-RAD）檢測Xist基因表達(dá)量。選取相同來源、相同代次的雌性胎牛成纖維細(xì)胞作為對(duì)照，所得數(shù)據(jù)用2（-ΔΔCt）進(jìn)行計(jì)算。

表1 PCR引物

1.2.2 胎牛成纖維細(xì)胞電轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)雌性胎牛成纖維細(xì)胞至匯合度80%-90%時(shí)收集細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)。取1×106個(gè)細(xì)胞，加入100 μL電轉(zhuǎn)液重懸，向細(xì)胞懸液中加入5 μg Xist mCherry-TALER、5 μg rtTa、5 μg pBase載體，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯中，采用電轉(zhuǎn)儀（amaza Nucleofector II，LONZA）U023程序電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)后將電轉(zhuǎn)杯中的細(xì)胞懸液接入10 cm皿中，置于38.5℃，5% CO2培養(yǎng)箱。

1.2.3 流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞 將轉(zhuǎn)染后5 d的胎牛成纖維細(xì)胞（細(xì)胞匯合度達(dá)80%-90%）用0.25%胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞濃度稀釋為1×106個(gè)/mL。利用BD FACS Aria II流式細(xì)胞儀分選表達(dá)紅色熒光蛋白的細(xì)胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增cDNA，進(jìn)行Xist表達(dá)量檢測。

1.2.4 體細(xì)胞核移植 核移植操作前，將培養(yǎng)3-4d匯合度達(dá)100%的供體細(xì)胞——胎牛成纖維細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后胎牛成纖維細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化收集，最后用100 μL操作液重懸，制備成單細(xì)胞懸液，置于4℃ 備用。屠宰場取牛卵巢，置于25℃生理鹽水，3 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。生理鹽水洗滌3遍卵巢，用10 mL注射器吸取2-6 mm卵泡，顯微鏡下揀A級(jí)、B級(jí)卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）用于核移植試驗(yàn)。待卵母細(xì)胞成熟17 h后，采用盲吸法去核，再將供體細(xì)胞注入卵母細(xì)胞。細(xì)胞核移植后的重構(gòu)胚在融合液中平衡2 min后進(jìn)行電融合，融合后洗凈培養(yǎng)15 min后觀察融合情況。將融合的重構(gòu)胚胎用5 μmol/L離子霉素處理5 min，2 mmol/L 6-DMAP聯(lián)合激活處理4 h，然后將重構(gòu)胚置于覆蓋石蠟油的SOF培養(yǎng)液的4孔板中培養(yǎng)，培養(yǎng)氣相條件一種是置于38.5℃、5%CO2飽和濕度，48 h后觀察發(fā)育情況。

2 結(jié)果

2.1 胎牛成纖維細(xì)胞性別鑒定

分別以荷斯坦種公牛（M）與荷斯坦高產(chǎn)母牛（F）的DNA為對(duì)照，擴(kuò)增兩個(gè)胎牛成纖維細(xì)胞（F1，F(xiàn)2）的SRY基因。瓊脂糖凝膠電泳顯示，胎牛成纖維細(xì)胞F1有，而F2沒有SRY基因擴(kuò)增（圖1），因此胎牛成纖維細(xì)胞F1為雄性，F(xiàn)2為雌性。

圖1 性別鑒定結(jié)果

2.2 胎牛成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果

Xist mCherry-TALER、rtTA與pBase載體共轉(zhuǎn)染雌性胎牛成纖維細(xì)胞F2后，培養(yǎng)液加入Dox。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后20 h細(xì)胞陽性率（紅色熒光細(xì)胞，顏色標(biāo)識(shí)見電子版）在90%以上，培養(yǎng)5 d后陽性細(xì)胞比例逐漸下降（圖2）。

圖2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后20 h結(jié)果

2.3 流式細(xì)胞分選

將轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)至5 d的細(xì)胞用胰酶消化，用不含血清的培養(yǎng)液重懸，使細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測及篩選。先對(duì)對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行篩選確定陰性細(xì)胞區(qū)域，再對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行篩選，結(jié)果陽性率為18.4%（圖3）。經(jīng)分選得到約5×105個(gè)陽性細(xì)胞，用于RNA提取，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 流式細(xì)胞儀進(jìn)行陽性率檢測轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)5 d的細(xì)胞

2.4 Xist表達(dá)抑制效果檢測

用SYBR Premix Ex TaqTM擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板，β-actin為內(nèi)參、未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對(duì)照，檢測Xist 表達(dá)量。試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果見表2，圖4。

表2 Xist 表達(dá)抑制效果檢測結(jié)果

圖4 Xist 相對(duì)表達(dá)量檢測

2.5 體細(xì)胞核移植獲得早期胚胎效率比較

選取表達(dá)紅色熒光的細(xì)胞用于體細(xì)胞核移植試驗(yàn)，用正常胎牛成纖維細(xì)胞做對(duì)照。試驗(yàn)組和對(duì)照組的卵裂率、8細(xì)胞發(fā)育率、桑葚胚發(fā)育率和囊胚發(fā)育率分別為78.8% vs 75.1%、54.4%及50.6%、 12.3% vs 27.8%、26.6% vs 0。

3 討論

本試驗(yàn)使用特異性抑制Xist基因的TALER載體轉(zhuǎn)染雌性胎牛成纖維細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選獲得陽性細(xì)胞后檢測Xist基因的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Xist TALER 載體可以成功轉(zhuǎn)染胎牛成纖維細(xì)胞并能顯著下調(diào)Xist基因表達(dá)量。Cong等［12］將識(shí)別多能性基因Sox2的TALE分別與KRAB和SID（一種轉(zhuǎn)錄抑制因子）融合構(gòu)建TELER載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，TELER載體可以顯著下調(diào)Sox2 的表達(dá)。Garg等［7］將識(shí)別CMV啟動(dòng)子的TELER載體與CMV-CFP載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TELER可以顯著抑制CFP表達(dá)，同時(shí)與RNA干擾試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)TELER的抑制效率比RNA干擾高5倍以上。綜上所述，本試驗(yàn)所使用Xist TALER載體適合在牛體細(xì)胞水平抑制Xist基因表達(dá)，能夠用于進(jìn)一步研究。

表3 體細(xì)胞核移植獲得早期胚胎效率比較

圖5 發(fā)育到4細(xì)胞階段的克隆胚胎

圖6 發(fā)育到8細(xì)胞階段的克隆胚胎

Xist基因主要參與雌性動(dòng)物的X染色體失活［2］，但Xist RNA的功能還需進(jìn)一步深入研究。Matoba等［13］用siRNA方法降低植入前的早期胚胎Xist RNA，盡管Xist RNA下調(diào)的效果是暫時(shí)的，但可以提高重構(gòu)胚胎的早期發(fā)育能力；但在胚胎植入后期仍有負(fù)面影響。有研究將Xist 的干擾序列片段整合到?；蚪M中，在 8 細(xì)胞時(shí)期加入誘導(dǎo)劑四環(huán)素誘導(dǎo)干擾片段的表達(dá)，成功糾正雄性動(dòng)物某些異常表達(dá)的基因［14］。Dean等［15］發(fā)現(xiàn)，牛體外受精胚胎從受精卵至8細(xì)胞，甲基化程度逐步下降，到16細(xì)胞時(shí)又開始再甲基化?？寺∨咛ピ趩渭?xì)胞時(shí)期甲基化程度下降，但之后的發(fā)育并未進(jìn)一步去甲基化，而是提前開始甲基化?？寺∩］嘏唠A段卵裂球核高度甲基化，程度和供核細(xì)胞胎牛成纖維細(xì)胞相同。本試驗(yàn)選取陽性的轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為核供體進(jìn)行SCNT試驗(yàn)，與對(duì)照組相比，桑葚胚和囊胚發(fā)育率都顯著降低，可能與DNA非正常甲基化相關(guān)。但是關(guān)于確切的牛X染色體基因表達(dá)失活時(shí)期及其與DNA甲基化、組蛋白修飾等的關(guān)系，目前還沒有確定［16］。

前期研究顯示經(jīng)過藥物篩選的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞做核供體會(huì)降低哺乳動(dòng)物克隆的效率［17，18］，本試驗(yàn)未使用G418藥物篩選轉(zhuǎn)染陽性的胎牛成纖維細(xì)胞，排除了藥物篩選對(duì)供體細(xì)胞以及對(duì)早期克隆胚胎的不良影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)Xist TALER轉(zhuǎn)染獲得的Xist被抑制胎牛成纖維細(xì)胞作為供體時(shí)存在影響克隆早期胚胎發(fā)育的因素，其深層機(jī)理有待進(jìn)一步研究。在今后的研究中，進(jìn)一步探討抑制Xist基因表達(dá)對(duì)克隆胚胎的DNA甲基化、組蛋白修飾等的影響及其與早期克隆胚胎發(fā)育的相關(guān)性，為提高牛體細(xì)胞克隆效率和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論和技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

本研究使用mCherry-TALER載體轉(zhuǎn)染胎牛成纖維細(xì)胞，并通過紅色熒光儀進(jìn)行流式分選。分選細(xì)胞中Xist的表達(dá)量被mCherry-TALER載體極顯著地抑制。后續(xù)的核移植試驗(yàn)表明，抑制Xist基因表達(dá)，可以克隆胚8-細(xì)胞發(fā)育率，但是降低桑椹胚和囊胚發(fā)育率。由Xist抑制引起的克隆胚發(fā)育及相關(guān)表觀遺傳學(xué)修飾變化還需進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 李楠）

《中國食物與營養(yǎng)》2015年征稿征訂啟事

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Effect of Xist Gene Repression on Early Development of Bovine SCNT Embryos

Liu Liming1Sun Wei2Zhang Jindun1Zhao Lixia2Li Shuyu2Wang Biao1Chen Yanglin1Hu Shuxiang2Wu Baojiang2Li Xihe1，2
（1.Research Center for Animal Genetic Resources of Mongolia Plateau，Inner Mongolia University，Hohhot 010021；2. Inner Mongolia Saikexing Reproductive Biotechnology Co.，Ltd.，Hohhot 011517）

Xist is an X-inactivation related gene that produces a noncoding RNA， and it is one of the first imprinted genes to be expressed in the early embryo with expression beginning at zygotic genome activation. This experiment aimed at investigating Xist repression in fetal bovine fibroblast by TALE-REPRESSOR（TALER）which contains mCherry as reporter， and the impact of Xist repression on early development of cloned cattle embryos using the transfected cells as nuclei donor. The results showed TALER repressed Xist gene expression by 93.85% in fluorescence-activated sorted cells compared with wild type fibroblast， indicating the TALER vector designed in this experiment effectively suppressed expression of Xist. The mCherry positive cells were selected for somatic cell nuclear transfer（SCNT）. The 2-cell， 8-cell， morula and blastocyst rates of suppressed group vs. control group were 78.8% vs 75.1%（P＞0.05）， 54.4% vs. 50.6%（P＞0.05）， 12.3% vs. 27.8%（P＜0.01）and 0 vs. 26.6%（P＜0.01）， respectively. These results indicated that TALER vectors effectively inhibited Xist gene expression in female fetal bovine fibroblast. Suppression of Xist gene promotes the 2-8 cell embryonic development of cloned embryo， however， development of morula/blastocyst decreased significantly. Therefore， the mechanism by which Xist gene expression regulates early embryonic development of cloned embryos needs further investigation.

Xist gene；TALER vector；fetal bovine fibroblast；early embryonic development

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.033

2014-05-27

內(nèi)蒙古自治區(qū)家畜性控精液技術(shù)熟化與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)（20111701）

劉黎明，男，碩士，研究方向：動(dòng)物生殖生物學(xué)與生物技術(shù)；E-mail：nmgdxllm@163.com

李喜和，男，博士，教授，研究方向：動(dòng)物生殖生物學(xué)與生物技術(shù)；E-mail：Lixh@life.imu.edu.cn