劉雪莉 郭慶 王靜 王霄 肖捷 王斌 余巍

(1.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 671003；2.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第920醫(yī)院，云南 昆明 650031；3.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650214)

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展極大地推進(jìn)了現(xiàn)代生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于單克隆抗體的制備、重組蛋白藥物的研發(fā)、人造器官移植等行業(yè)，成為生物制藥領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)之一[1]。由于血清具有終止胰蛋白酶消化，提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的貼壁因子、免疫球蛋白、胰島素等其它營養(yǎng)成分及細(xì)胞因子，因此成為體外細(xì)胞培養(yǎng)液中的常用添加成分，其對(duì)細(xì)胞的培養(yǎng)意義重大[2,3]，其為細(xì)胞生長(zhǎng)和維持提供了必要的活性成分[4]。胎牛血清(FBS)從母體內(nèi)胎兒中獲取，含有多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，可模擬細(xì)胞增殖和維持[5]，含有大量的蛋白成分，最主要的蛋白成分有白蛋白、A1抗胰蛋白酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白、Ig類抗體，還有含量不等的如A2巨球蛋白、A1和B1脂蛋白、膽固醇、纖維結(jié)合蛋白、膽紅素和類胡蘿卜素等成分[6]，是許多重組蛋白及藥物生產(chǎn)和研發(fā)用細(xì)胞培養(yǎng)基中的關(guān)鍵成分，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的需要仍難以大規(guī)模的用其它物質(zhì)所代替。另外，胎牛血清中胎球蛋白A(fetuin-A)等成分的差異在培養(yǎng)細(xì)胞粘附中已發(fā)揮重要作用[7]。研究表明，細(xì)胞通過其粘附蛋白包括纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)n)和體外連接蛋白(Vitronectin，Vn)吸附在人工材料的培養(yǎng)皿上。不同比例的白蛋白和胎牛血清混合溶液等復(fù)雜介質(zhì)對(duì)Fn和Vn通過培養(yǎng)皿表面自組裝單分子膜對(duì)細(xì)胞粘附的作用有較大差異[8]。在日常的細(xì)胞培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)使用不同來源生產(chǎn)廠家的胎牛血清配制培養(yǎng)液，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)速率及狀態(tài)的影響存在明顯差異，尤其在更換培養(yǎng)裝置后，差異更為明顯。分析可能是不同胎牛血清的細(xì)胞粘附相關(guān)因子之間的差異所致，因此推測(cè)胎牛血清的細(xì)胞粘附效應(yīng)可能是影響貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、繁殖及凋亡等生命活動(dòng)的關(guān)鍵因素。

明膠是一種公認(rèn)安全的水膠體，應(yīng)用范圍廣泛，是膠原的部分水解產(chǎn)物，存在細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)，酶解產(chǎn)物無毒且易被吸收，具有生物相容性高和親細(xì)胞性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可增加細(xì)胞粘附力，促進(jìn)細(xì)胞貼壁、增殖，可改變細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境，為細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境提供力學(xué)支持[9-11]。本研究主要以0.1%明膠包被培養(yǎng)裝置，用重組藥物生產(chǎn)細(xì)胞——中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)細(xì)胞為培養(yǎng)物，將CHO細(xì)胞培養(yǎng)于不同的培養(yǎng)裝置并連續(xù)培養(yǎng)3代，通過對(duì)比1種常用的進(jìn)口胎牛血清與2種國產(chǎn)胎牛血清在不同培養(yǎng)裝置培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，使用0.1%明膠包被培養(yǎng)裝置前后為對(duì)比，分析在改變貼壁效應(yīng)后，3種胎牛血清在細(xì)胞生長(zhǎng)密度、活力等指標(biāo)的變化差異，以驗(yàn)證血清的貼壁效應(yīng)決定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的推測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

CHO-K1細(xì)胞株(ATCC 編號(hào)為CCL-61)。

1.1.2 胎牛血清

國產(chǎn)1號(hào)購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，TBD優(yōu)級(jí)胎牛血清，貨號(hào)：TBD25HY；國產(chǎn)2號(hào)購自上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)：MP20001胎牛血清；進(jìn)口購自以色列BI Biological Industries，貨號(hào)：04-102-1ACS。

1.1.3 主要試劑

RPMI 1640，購自以色列BI Biological Industries，貨號(hào)：11-100-1N；碳酸氫鈉(NaHCO3)購自中國美侖生物，貨號(hào)：MB0115；青霉素-鏈霉素-兩性霉素B(100×)購自中國新賽美生物科技有限公司，貨號(hào)：C125C8；胰蛋白酶-EDTA消化液購自中國Solarbio公司，貨號(hào)：T1300；1%明膠購自中國Solarbio公司，貨號(hào)：G0040；培養(yǎng)皿購自美國CORNING公司；T25培養(yǎng)瓶購自中國Crystalgen公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)液的配制

具體見表1。

表1 1L細(xì)胞培養(yǎng)液的配制

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

試驗(yàn)時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞分為2組。將CHO細(xì)胞以相同的起始量接種于T25瓶和培養(yǎng)皿內(nèi)，T25瓶和培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液總體積固定為10mL，每種血清、每種培養(yǎng)裝置分別設(shè)3個(gè)重復(fù)，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中密閉培養(yǎng)。以使用進(jìn)口胎牛血清的細(xì)胞為對(duì)照，將使用國產(chǎn)胎牛血清的培養(yǎng)裝置，用0.1%的明膠包被，將細(xì)胞以相同的起始量接種于T25瓶和培養(yǎng)皿內(nèi)，T25瓶和培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液總體積固定為10mL，每種血清、每種培養(yǎng)裝置分別設(shè)3個(gè)重復(fù)，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中密閉培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%以上時(shí)，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化細(xì)胞，分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算每組細(xì)胞密度、細(xì)胞均數(shù)、細(xì)胞活力。

1.2.3 明膠使用方法

使用無菌去離子水將1%的明膠稀釋成0.1%，取適量體積0.1%的明膠，加入待用的培養(yǎng)裝置中，均勻分布在培養(yǎng)裝置的底部，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中放置1h后取出，吸棄多余明膠，無菌干凈操作臺(tái)吹干備用。

1.2.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞活力計(jì)算

細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%后，使用臺(tái)盼藍(lán)染色法，在生物顯微鏡下計(jì)數(shù)。細(xì)胞活力的計(jì)算公式：

細(xì)胞活力=(細(xì)胞總數(shù)-死細(xì)胞總數(shù))/活細(xì)胞總數(shù)×100%

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Origin Pro 8.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)分析，若P<0.05，說明數(shù)據(jù)之間有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 胎牛血清在不同培養(yǎng)裝置對(duì)細(xì)胞密度及活力的影響

通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞，使用進(jìn)口胎牛血清配制的培養(yǎng)基的細(xì)胞匯合度已經(jīng)達(dá)到90%以上，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化細(xì)胞，使用臺(tái)盼藍(lán)染色法，在生物顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，分別計(jì)每組細(xì)胞的死細(xì)胞與活細(xì)胞數(shù)量，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，計(jì)算每毫升培養(yǎng)液中細(xì)胞的密度，見圖1a、圖1b。結(jié)果顯示，在T25瓶?jī)?nèi)進(jìn)口胎牛血清對(duì)細(xì)胞密度的影響與國產(chǎn)1號(hào)胎牛血清之間呈極顯著差異，與國產(chǎn)2號(hào)胎牛血清之間無顯著差異；國產(chǎn)2號(hào)與國產(chǎn)1號(hào)胎牛血清之間也有顯著差異。在培養(yǎng)皿內(nèi)，進(jìn)口胎牛血清對(duì)細(xì)胞密度的影響與國產(chǎn)1號(hào)胎牛血清之間有顯著差異，與國產(chǎn)2號(hào)胎牛血清之間無顯著差異，而國產(chǎn)1號(hào)與國產(chǎn)2號(hào)胎牛血清無顯著差異。即無論在T25瓶?jī)?nèi)還是在培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)CHO細(xì)胞，國產(chǎn)2號(hào)胎牛血清與進(jìn)口胎牛血清對(duì)細(xì)胞密度的影響均無顯著差異，但是國產(chǎn)1號(hào)與國產(chǎn)2號(hào)之間的差異在不同培養(yǎng)裝置中則表現(xiàn)不同。

根據(jù)不同培養(yǎng)裝置比較每組細(xì)胞的細(xì)胞活力，如圖1c、圖1d所示，T25瓶?jī)?nèi)3組數(shù)據(jù)中P>0.05，說明3組數(shù)據(jù)無顯著性差異；但在培養(yǎng)皿內(nèi)3組數(shù)據(jù)中P<0.05，說明3組數(shù)據(jù)有顯著性差異，即進(jìn)口胎牛血清與國產(chǎn)1號(hào)、國產(chǎn)2號(hào)胎牛血清對(duì)細(xì)胞活力的影響之間均呈顯著差異；但國產(chǎn)1號(hào)與國產(chǎn)2號(hào)之間無顯著差異。結(jié)果表明，使用培養(yǎng)皿與T25培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，3種胎牛血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)活力存在顯著性差異。

圖1 未使用明膠時(shí)不同胎牛血清于不同培養(yǎng)裝置對(duì)CHO細(xì)胞密度及細(xì)胞活力的比較注：**表示在P<0.01水平上的顯著關(guān)系；*表示在P<0.05水平上的顯著關(guān)系。

2.2 胎牛血清在明膠包被的培養(yǎng)裝置中對(duì)細(xì)胞密度及活力的影響

考慮到胎牛血清中粘附因子與不同培養(yǎng)裝置之間可能存在粘附效應(yīng)的區(qū)別。用0.1%的明膠對(duì)不同的培養(yǎng)裝置進(jìn)行包被，研究3種胎牛血清配制的培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)是否有差異。

細(xì)胞培養(yǎng)24h后，在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞，如圖2，顯示未使用明膠時(shí)，進(jìn)口胎牛血清配制的培養(yǎng)液的細(xì)胞密度大于使用國產(chǎn)胎牛血清的細(xì)胞密度，國產(chǎn)2號(hào)的細(xì)胞密度大于國產(chǎn)1號(hào)。當(dāng)使用明膠后，使用國產(chǎn)2號(hào)胎牛血清的細(xì)胞密度優(yōu)于國產(chǎn)1號(hào)與進(jìn)口胎牛血清，國產(chǎn)1號(hào)與進(jìn)口胎牛血清無明顯差別。

圖2 使用明膠前后不同的胎牛血清之間細(xì)胞密度的比較(×10)

通過比較細(xì)胞密度和活力，結(jié)果如圖3所示，在T25瓶?jī)?nèi)，使用國產(chǎn)2號(hào)的細(xì)胞密度高于使用進(jìn)口胎牛血清的細(xì)胞，并與其有極顯著性差異(P<0.01)；在培養(yǎng)皿內(nèi)，使用進(jìn)口胎牛血清的細(xì)胞產(chǎn)量略高于使用國產(chǎn)胎牛血清的細(xì)胞，但P>0.05，三者無顯著性差異。細(xì)胞活力方面，無論在T25瓶?jī)?nèi)還是在培養(yǎng)皿內(nèi)，使用2種國產(chǎn)胎牛血清和進(jìn)口胎牛血清配制的培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞活力影響均無顯著性差異。

圖3 使用明膠后不同胎牛血清于不同培養(yǎng)裝置對(duì)CHO細(xì)胞密度及細(xì)胞活力的比較注：**表示在P<0.01水平上的顯著關(guān)系；*表示在P<0.05水平上的顯著關(guān)系。

研究表明，當(dāng)培養(yǎng)裝置使用0.1%明膠包被后，2種國產(chǎn)胎牛血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)密度和活力的影響發(fā)生顯著變化。另外，用明膠提高培養(yǎng)裝置的粘附效應(yīng)后，培養(yǎng)裝置之間的差異也消失了，表明不同胎牛血清中的粘附分子與培養(yǎng)裝置產(chǎn)生的粘附效應(yīng)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和活力的影響非常重要。

3 討論

胎牛血清由于生長(zhǎng)因子含量豐富，已成為細(xì)胞培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)充劑[12]，其優(yōu)勢(shì)包括細(xì)胞增殖和維持所需的大多數(shù)因子的混合物；幾乎是通用的生長(zhǎng)補(bǔ)充劑，對(duì)大多數(shù)類型的人和動(dòng)物細(xì)胞都有效(包括昆蟲)；使用補(bǔ)充血清的培養(yǎng)基減少了為每種細(xì)胞類型開發(fā)特定的、優(yōu)化的培養(yǎng)基配方所需的時(shí)間和精力[13]。對(duì)胎牛血清質(zhì)量的評(píng)價(jià)是發(fā)展國產(chǎn)高端胎牛血清的重要基礎(chǔ)。

根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)對(duì)比，以細(xì)胞密度變化為評(píng)估指標(biāo)時(shí)，在T25瓶?jī)?nèi)國產(chǎn)1號(hào)與進(jìn)口胎牛血清和國產(chǎn)2號(hào)胎牛血清對(duì)細(xì)胞密度的影響呈顯著差異，而在培養(yǎng)皿內(nèi)國產(chǎn)1號(hào)與國產(chǎn)2號(hào)之間差異則不顯著。當(dāng)以細(xì)胞活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，進(jìn)口胎牛血清與2種國產(chǎn)胎牛血清于T25瓶?jī)?nèi)對(duì)細(xì)胞活力的影響均無顯著性差異(P>0.05)，但在培養(yǎng)皿內(nèi)則呈有顯著性差異(P<0.05)。表明血清中粘附因子與培養(yǎng)裝置表面的粘附效應(yīng)是影響細(xì)胞生長(zhǎng)和活力的關(guān)鍵因素。使用0.1%明膠包被培養(yǎng)裝置后，改變培養(yǎng)皿表面的粘附效應(yīng)后，國產(chǎn)1號(hào)胎牛血清無論在T25瓶?jī)?nèi)還是培養(yǎng)皿內(nèi)，與進(jìn)口胎牛血清對(duì)細(xì)胞的密度及細(xì)胞活力之間都無顯著性差異(P>0.05)；而國產(chǎn)2號(hào)胎牛血清在T25瓶?jī)?nèi)，對(duì)細(xì)胞密度的影響甚至優(yōu)于進(jìn)口胎牛血清(P<0.01)。進(jìn)一步證明了胎牛血清中粘附分子產(chǎn)生的粘附效應(yīng)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和活力的關(guān)鍵影響。綜合來看，2種國產(chǎn)胎牛血清都可能因?yàn)檎掣椒肿拥膬?yōu)化組合導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)不同培養(yǎng)裝置的粘附效應(yīng)略遜于進(jìn)口胎牛血清，進(jìn)而導(dǎo)致了其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速度和活力影響的下降。該結(jié)果表明胎牛血清的粘附效應(yīng)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)非常重要，可作為評(píng)價(jià)胎牛血清質(zhì)量的重要指標(biāo)。

另外，細(xì)胞的培養(yǎng)除了對(duì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基有較高要求外，生命科學(xué)的快速發(fā)展對(duì)高分子材料的培養(yǎng)裝置表面性能如浸潤性、黏附性、生物相容性、電學(xué)性能、阻燃性等提出了更高的要求[14]。不同廠商生產(chǎn)的T25瓶和培養(yǎng)皿表面對(duì)細(xì)胞的粘附能力存在區(qū)別。當(dāng)培養(yǎng)裝置使用明膠包被后，可以通過增加其粘附性改變不同裝置對(duì)細(xì)胞粘附效應(yīng)的影響，從而從不同的角度評(píng)價(jià)3種胎牛血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

Kyungsook Kim等[4]研究表明，在含F(xiàn)BS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，含有較高的穩(wěn)定細(xì)胞粘附相關(guān)的β-肌動(dòng)蛋白和整合素β-1(ITGβ1)的基因表達(dá)水平，并且隨著細(xì)胞密度的增加而增加。細(xì)胞微環(huán)境以多因子(趨化因子、細(xì)胞外基質(zhì))協(xié)同的方式對(duì)細(xì)胞粘附與遷移進(jìn)行調(diào)控[15]。而胎牛血清以及高分子材料的細(xì)胞培養(yǎng)裝置，會(huì)對(duì)細(xì)胞的微環(huán)境產(chǎn)生一定的影響。當(dāng)細(xì)胞粘附在基底上時(shí)，細(xì)胞骨架會(huì)通過整合素(Integrin)與基底進(jìn)行連接，并通過粘著斑將肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白II產(chǎn)生的力學(xué)刺激傳遞給細(xì)胞外基質(zhì)[16]。推測(cè)本文所選的3種胎牛血清在細(xì)胞粘附因子的成分上有所差異，可能由于不同細(xì)胞粘附因子的組成與細(xì)胞培養(yǎng)容器表面分子發(fā)生相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)速度和活力的差異。

本研究發(fā)現(xiàn)胎牛血清中粘附因子成分與細(xì)胞培養(yǎng)容器表面分子相互作用對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生的影響，同時(shí)證明胎牛血清的粘附效應(yīng)是評(píng)價(jià)胎牛血清質(zhì)量的重要指標(biāo)。