李洪波 綜述 袁慧軍 韓東一 審校

近幾年，新一代測序技術(shù)（next－generation sequencing technology，NGS）已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用。該技術(shù)可以提供高質(zhì)量和處理數(shù)目龐大的測序數(shù)據(jù)，幫助研究人員深入地理解掌握基因組和轉(zhuǎn)錄組，并將深入到醫(yī)學(xué)病理分析、臨床診斷、疾病預(yù)測、表型鑒定和個體化的治療等各個領(lǐng)域，極大地推動生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)的研究和發(fā)展。但是這項技術(shù)目前依舊是非常復(fù)雜的，為了很好的將其用于生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)的研究，需要將分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)兩方面的知識結(jié)合。本綜述主要介紹新一代測序技術(shù)的特點、原理、應(yīng)用平臺和功能及其在耳聾基因研究中的應(yīng)用和面臨的挑戰(zhàn)。

1 新一代測序技術(shù)的特點

DNA 測序技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中常用的一種技術(shù)手段。1977年，第一代測序技術(shù)（Sanger測序法）出現(xiàn)。人類基因組計劃（human genome project，HGP）利用該技術(shù)加以自動化改進(jìn)之后，各國政府相繼投入資金幾十億美元，耗時約13年，完成了人類遺傳密碼30億對堿基序列的測定［1～4］。由于高昂的測序成本限制了該技術(shù)更常規(guī)的使用。2005年以后出現(xiàn)的新一代測序技術(shù)，由于測序成本的大幅度降低，使之能夠成為解決一般性的基因分子生物學(xué)問題的有效工具［5，6］。該技術(shù)的諸多優(yōu)點也為研究者快速確定疾病病因、促進(jìn)疾病的預(yù)防以及診斷技術(shù)和新藥的開發(fā)提供了越來越多的可能。

新一代測序技術(shù)主要分成兩大類［7～9］，即合成測序（sequenceing by synthesis，SBS）和DNA 單分子測序技術(shù)，其中合成測序又可以稱為第二代測序技術(shù)，而單分子測序技術(shù)可以稱為第三代測序技術(shù)。本文主要介紹第二代測序技術(shù)，其不同于傳統(tǒng)測序之處在于采用的測序策略為循環(huán)芯片測序法（cyclic－array sequencing）。所謂循環(huán)芯片測序法，就是對布滿DNA 樣品的芯片重復(fù)進(jìn)行基于DNA的聚合酶反應(yīng)（模板變性、引物退火雜交及延伸）以及熒光序列讀取反應(yīng)。該技術(shù)具有超高通量并行測序能力，一次可以讀取最大400萬條序列，讀取長度根據(jù)平臺不同從25bp到450bp，不同的測序平臺在一次實驗中，可以讀取1G 到14G 不等的堿基數(shù)，這樣龐大的測序能力是傳統(tǒng)測序技術(shù)所不能比擬的。傳統(tǒng)測序是對多個DNA 分子的混合物進(jìn)行測序，其測序結(jié)果是多個DNA 分子綜合的序列信息，而合成測序先對單個DNA 分子進(jìn)行PCR 以放大DNA 分子數(shù)量，再對這些DNA 分子進(jìn)行測序，就可以得到原來單個DNA 分子的序列信息。第三代測序技術(shù)也有其自身特點，它比第二代測序技術(shù)擁有更高的測序通量，更加低廉的測序價格。該技術(shù)不需要制備DNA 文庫及對DNA 片段進(jìn)行單分子擴(kuò)增［10，11］，因而具有更快的測序速度。

2 新一代基因測序技術(shù)的基本原理

第二代測序技術(shù)在Sanger等測序方法的基礎(chǔ)上，通過技術(shù)創(chuàng)新發(fā)展而來，該技術(shù)的核心思想是邊合成邊測序，其主要原理是通過把大量被測的模板DNA 片段在芯片上進(jìn)行固定，并在固定化的DNA測序模板上雜交結(jié)合通用的DNA 引物，利用不同的方法分別控制4 種堿基在DNA 引物上的延伸，通過檢測延伸反應(yīng)過程或延伸堿基，實現(xiàn)高通量并行的DNA 序列信息的檢測。目前，比較成熟的技術(shù)平臺主要包括美國Roche Applied Science公司的454 基因組測序儀、美國Illumina 公司和英國Solexa technology公司合作開發(fā)的Illumina測序儀和美國Applied Biosystems公司的SOLiD 測序儀。這三個技術(shù)平臺各有優(yōu)缺點，它們在測序原理上也有著不同的差別。

2.1 454 基因組測序平臺 美國Roche Applied Science公司的454測序技術(shù)平臺主要應(yīng)用焦磷酸測序（pyrosequencing）原理［12］：該技術(shù)是在DNA聚合酶、ATP 硫酸化酶（ATP sulfurylase）、熒光素酶（luciferase）和三磷酸腺苷雙磷酸酶（apyrase）的協(xié)同作用下催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在每一輪測序反應(yīng)中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出相同摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)（PPi）。PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號，通過CCD 光學(xué)系統(tǒng)即可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。反應(yīng)體系中剩余的dNTP 和殘留的少量ATP在apyrase的作用下發(fā)生降解，這樣，就可以在反應(yīng)體系中加入另一種dNTP，使以上反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的DNA 序列信息［13～16］。Roche Applied Science公司推出的GS FLX 系統(tǒng)［14］即應(yīng)用上述的焦磷酸測序（pyrosequencing）原理，將基因組分割為長度為300到500個堿基對的片段，然后將雙鏈解開，棄去互補(bǔ)鏈當(dāng)中的一條，將另一條鏈通過接頭（adaptor）與磁珠上的復(fù)合物結(jié)合，并使得每個珠子只與一條鏈發(fā)生結(jié)合，所有的磁珠即構(gòu)成了樣品文庫。隨后將包含磁珠和擴(kuò)增試劑的水溶液注入到礦物油中，水溶液分散形成小水滴，被礦物油包裹，形成了油包水（water－in－oil）的乳濁液結(jié)構(gòu)，每個小水滴中就是只包含一個磁珠及PCR 試劑的微反應(yīng)器。通過聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）對結(jié)合在小珠上的片段進(jìn)行復(fù)制，直到各個片段的拷貝完全覆蓋其所在的小珠為止。乳濁液PCR（emulsion PCR，emPCR）在每個微反應(yīng)器中獨(dú)立進(jìn)行，排除了其他序列的影響。每個片段擴(kuò)增后產(chǎn)生了幾百萬個相同的拷貝，這些拷貝也結(jié)合在磁珠上。接下來將珠子分散在一個包含大約160萬個直徑為44μm 小孔的平板（picotiter plate）上，先使特異性的測序引物和單鏈DNA 模板結(jié)合后，在多種酶和熒光素（luciferin）等的共同參與下，將每一個dNTP 的聚合與熒光信號的釋放偶聯(lián)起來。用CCD 將每個微球發(fā)出光及其強(qiáng)度進(jìn)行記錄同時成像，并將所記錄下的發(fā)光現(xiàn)象與當(dāng)時加入的核苷酸相關(guān)聯(lián)，可以得到同時發(fā)生的幾十萬個DNA 片段的延伸情況［12，17～19］。焦磷酸測序反應(yīng)在磁珠上進(jìn)行，每個磁珠都產(chǎn)生一條讀長，最新的GS FLX 系統(tǒng)，一次運(yùn)行可獲得一百多萬個讀長片段，高質(zhì)量讀長達(dá)到200～300bp，讀取超過5億個堿基信息，并通過GS FLX 系統(tǒng)進(jìn)行分析。

2.2 Illumina Genome Analyzer測序平臺 Illumina公司和Solexa technology公司開發(fā)的Solexa測序平臺采用了與454基因組測序儀不同的合成測序原理［20～22］，其核心專利是DNA 簇和可逆性末端終結(jié)（reversible terminator）。DNA 簇是指將待測序的單個基因組DNA 片段固定在載玻片表面不同的位置上，形成DNA 文庫，并產(chǎn)生DNA 簇的過程。芯片表面連接有一層與接頭互補(bǔ)的寡核苷酸，DNA 片段兩端通過接頭與芯片固定后，形成橋（bridge）結(jié)構(gòu)，并以寡核苷酸為引物進(jìn)行PCR，復(fù)制過程將每個DNA 片段轉(zhuǎn)換為大約1 000個完全一樣的拷貝，并位于同一個DNA 簇之中，成為單克隆的DNA 簇群。可逆性末端終結(jié)是指在測序過程中，使用可逆終止子邊合成邊測序。該技術(shù)中使用的dNTP，經(jīng)過了特殊的修飾，四種不同的dNTP分別被標(biāo)記上了不同的熒光基團(tuán)，這些帶熒光標(biāo)記的dNTP就是可逆終止子，在所有的dNTP中加入了3’末端保護(hù)基團(tuán)，這些基團(tuán)能夠封閉dNTP 的3’端黏性，阻止另一個dNTP與之相連。因此，測序的每個循環(huán)只摻入單個堿基，直到其熒光信號被收集后，將熒光基團(tuán)去除，再將封閉基團(tuán)去掉，從而進(jìn)行下一步反應(yīng)，而每步反應(yīng)所收集到的熒光信號，則對應(yīng)了所要檢測的序列。具體過程是，序列合成反應(yīng)體系包括引物、DNA 聚合酶、4 種標(biāo)記了不同熒光的核苷酸，每個核苷酸的堿基被保護(hù)基團(tuán)封閉。引物與1個dNTP相連，激光掃描芯片表面，讀取各個位置的熒光信號之后，將基團(tuán)化學(xué)切割，恢復(fù)3’端黏性，繼續(xù)聚合下一個dNTP，直到測序完成。每次反應(yīng)摻入一個核苷酸，該核苷酸類別可通過標(biāo)記熒光進(jìn)行識別，經(jīng)過掃描，讀取該次反應(yīng)顏色后，位于堿基3’末端的保護(hù)基團(tuán)被除去，繼續(xù)下一輪反應(yīng)，如此反復(fù)，得出片段的精確序列。

2.3 SOLiD 測序平臺 Church等發(fā)明了另一種不同的測序方法［23，24］，后被美國Applied Biosystems公司發(fā)展為SOLiD（supported oligo ligation detection）測序技術(shù)。它與上述測序技術(shù)的不同之處在于以四色熒光標(biāo)記寡核苷酸的連續(xù)合成為基礎(chǔ)，取代了傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)，因此也被稱作為連接測序（sequenceing by ligation），可對單拷貝DNA片段進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增和高通量并行測序，同時利用了獨(dú)特的雙堿基編碼原理。SOLiD 在文庫構(gòu)建和PCR擴(kuò)增方面，與GS FLX 系統(tǒng)類似，微珠通過接頭捕獲DNA 片段，并進(jìn)行乳液PCR。不過SOLiD系統(tǒng)的微珠直徑只有1μm，而GS FLX 系統(tǒng)采用的磁珠是20μm。在該方法中，DNA 片段文庫生成以后，待測的短的DNA 片段的兩側(cè)，被連上SOLiD接頭，分別是P1接頭和P2接頭，然后，對加上接頭的待測片段，在特定的磁珠表面進(jìn)行擴(kuò)增，具體則是通過油包水PCR 反應(yīng)進(jìn)行的，其中，和P1接頭對應(yīng)的P1 引物，被固定在P1 磁珠的表面，在PCR 反應(yīng)前，將含有PCR 反應(yīng)所有成分的水溶液，注入高速旋轉(zhuǎn)的礦物油表面，形成了類似于GS FLX 系統(tǒng)的油包水乳濁液結(jié)構(gòu)。理想狀況下，形成每個小液滴中只包含一個磁珠及PCR 試劑的微反應(yīng)器，隨著PCR 反應(yīng)的進(jìn)行，磁珠上就形成了若干具有相同來源的擴(kuò)增產(chǎn)物，為后續(xù)的測序反應(yīng)做好了準(zhǔn)備，再加入測序引物，與固定在每個微珠上的DNA 片段中已知的起始序列發(fā)生結(jié)合，該測序引物與磁珠上的擴(kuò)增產(chǎn)物的P1 接頭可以互補(bǔ)雜交，隨后，向混合物中加入長度為8個堿基的熒光標(biāo)記寡核苷酸探針開始測序。最新的SOLiD3系統(tǒng)單次運(yùn)行可產(chǎn)生50GB 的序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于17倍人類基因組覆蓋度。同時由于SOLiD 系統(tǒng)在測序過程中對每個堿基判讀兩次，從而減少原始數(shù)據(jù)錯誤，并且該技術(shù)使用連接酶替代聚合酶能明顯減少因堿基錯配而出現(xiàn)的錯誤，測序過程中更換引物也能減少背景噪聲和錯誤率。多項措施的采用，確保了SOLiD 系統(tǒng)原始堿基數(shù)據(jù)的高準(zhǔn)確度。

以上所描述的是幾種相對成熟的技術(shù)，但這三項技術(shù)還遠(yuǎn)談不上完美。例如，454 技術(shù)的樣品準(zhǔn)備過程過于復(fù)雜，Solexa技術(shù)的測序閱讀長度還比較短，而SOLiD 技術(shù)還需要得到更多科研群體的廣泛驗證，這些具體的問題，都需要一一解決［25］。事實上，除這幾種技術(shù)外，許多依據(jù)其它不同的原理的技術(shù)也正在研究中，即第三代測序技術(shù)，從目前看，它們的潛力是非常巨大的。

2.4 單分子測序 為了克服第二代合成測序的一些問題，比如閱讀長度過短，需要對測序的模板分子進(jìn)行擴(kuò)增，試劑的消耗量過大等，單分子測序應(yīng)運(yùn)而生。實現(xiàn)單分子實時測序，需要解決三個關(guān)鍵的技術(shù)，第一是熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸。目前的顯微鏡還無法真正的實時觀看到“單分子”，但是它可以實時記錄熒光的強(qiáng)度變化。第二是納米微孔。由于光的衍射作用，DNA 鏈周圍眾多熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸形成的強(qiáng)大的熒光背景會使單分子的熒光探測成為不可能。利用納米微孔技術(shù)，可以形成非常穩(wěn)定的背景熒光信號，便于顯微鏡捕捉閱讀。第三是共聚焦顯微鏡實時快速地對集成在板上無數(shù)的納米小孔同時進(jìn)行記錄。單分子測序技術(shù)解決了上述三個關(guān)鍵問題，不但能夠直接測定DNA 的序列［26］，同時還能夠?qū)NA 分子序列和甲基化的DNA 序列進(jìn)行測定。目前的第三代測序儀主要包括Helicos Biosciences 公司的 HeliScope 測序儀（http：／／www.helicosbio.com／）、Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time（SMRTTM）DNA Sequencing” （http：／／www.pacificbiosciences.com／）、VisiGen Biotechnologies公司的單分子合成測序儀、LI－COR Biosciences公司單分子測序儀（http：／／www.licor.com／bio／）、ABI（Ion Torrent）新一代測序儀（http：／／www.appliedbiosystems.com）、Oxford Nanopore 的納米孔測序技術(shù)（http：／／www.nanoporetech.com／）等，各個公司的測序儀和第二代測序技術(shù)有著顯著的不同：首先單分子測序不需要PCR 擴(kuò)增，更能反映細(xì)胞或組織內(nèi)分子的真實情況，特別是在需要定量分析的情況下［27］；其次該技術(shù)具有更高的通量［28］；最后該項技術(shù)擁有更高的測序準(zhǔn)確性。盡管如此，單分子測序也存在新的問題，比如：如何降低非檢測特異性背景的干擾，如何更準(zhǔn)確快速地記錄測序反應(yīng)的結(jié)果，如何自動快速處理巨量的DNA 序列信息等［29］。這些都是亟待進(jìn)一步研究解決的問題。

3 新一代測序技術(shù)在遺傳性聾致病基因研究中的應(yīng)用

遺傳性聾分為非綜合征型聾（nonsyndromic hearing impairment，NSHI）和綜合征型聾（syndromic hearing impairment，SHI）。全部NSHI和絕大部分SHI是符合孟德爾遺傳規(guī)律的單基因遺傳病。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，與耳聾相關(guān)的基因的定位、分離、克隆及基因的突變得到深入的研究。目前，非綜合征型聾已確定了135 個基因座，65個非綜合征型聾基因被克隆，據(jù)預(yù)測耳聾相關(guān)基因可能有大約600 個［30］。檢測基因突變的篩查方法很多，直接測序是尋找突變的金標(biāo)準(zhǔn)。新一代測序技術(shù)作為生命科學(xué)的又一重大技術(shù)創(chuàng)新，以其固有的平行高效的檢測特點，與耳聾基因的高遺傳異質(zhì)性相契合，成為一種極具潛力的耳聾基因診斷和篩查工具。2010年，Shearer等［31］利用454基因組測序平臺和Illumina Genome Analyzer測序平臺分別對9名經(jīng)sanger技術(shù)確診的遺傳性聾患者進(jìn)行測序，證明了新一代測序技術(shù)的可靠性。同年，Rehman等［32］利用外顯子靶向捕獲技術(shù)聯(lián)合NGS，對來源于一個近親的常染色體隱性非綜合型遺傳性聾的DFNB79家系患者基因組DNA 進(jìn)行了分析，將致病基因定位于染色體9q34.3 中一個2.9 Mb區(qū)間內(nèi)，這個區(qū)間共包含有108個候選區(qū)基因，通過對402 554個序列讀長文庫進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了8個之前沒有報道過的突變，在這8個突變中，其中有6個是多態(tài)，一個是非編碼基因，剩下的一個為基因C9orf75，重新被命名為TPRN 的無義突變。同時對其他3個DFNB79連鎖的家系進(jìn)行分析，在這個基因上也發(fā)現(xiàn)了3個移碼突變。2011年，Schraders等［33］對一個X 連鎖語后聾荷蘭家系進(jìn)行基因定位連鎖分析時發(fā)現(xiàn)，在DXS7108 和DXS7110.之間12.9 Mb 的一個區(qū)間，包含了之前曾經(jīng)描述的DFNX4和75個候選基因，利用NGS檢測到SMPX一個無義突變，該基因主要編碼小肌肉蛋白，同時進(jìn)一步對26個來自X 連鎖遺傳性聾的小家系患者進(jìn)行篩查，沒有找到該基因的突變，只是找到一個該基因的框移突變，分離分析發(fā)現(xiàn)該突變與耳聾遺傳共分離。在眾多的學(xué)者利用NGS對遺傳性聾家系患者進(jìn)行DNA 測序、以期定位致病基因的同時，Mortazavi等［34］利用NGS對小鼠的大腦、肝臟和骨骼肌等組織器官RNA 進(jìn)行了測序，對測得的序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，約90%的數(shù)據(jù)顯示落在已知的外顯子中，同時，也發(fā)現(xiàn)了許多序列并不在已知的外顯子序列中，而那些在已知序列之外的信息，通過數(shù)據(jù)分析展示的是從未被報道過的RNA 剪切、3’端非翻譯區(qū)、變動的啟動子以及潛在的小分子RNA 前體等，而這些信息用傳統(tǒng)技術(shù)是無法發(fā)現(xiàn)的。在全基因組基因表達(dá)譜的分析上，相信利用NGS對內(nèi)耳基因表達(dá)情況進(jìn)行深入研究，也將有可能發(fā)現(xiàn)新的在內(nèi)耳表達(dá)的基因，并成為新的候選基因。2009年，Lewis等［35］開發(fā)了一個耳聾的小鼠模型，通過該模型人們首次證明microRNA 對形成此病有直接影響。microRNA 基因的相應(yīng)片斷可以對小鼠及人內(nèi)耳中的聽覺細(xì)胞產(chǎn)生影響。在隨后的研究中，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)一種被稱為miR－96［36］的一個特定的microRNA的突變引起的耳聾，突變的miR－96可以影響感覺毛細(xì)胞的生理發(fā)育。由于這些小分子RNA 的序列較短，并且高度同源，傳統(tǒng)的方法在檢測突變時具有一定的困難［37，38］，而NGS能很好的解決這個問題，同時測序方法還能在實驗中發(fā)現(xiàn)新的小分子RNA［39，40］。

4 總結(jié)與展望

在過去10年，人類基因組計劃的完成和測序技術(shù)的飛速發(fā)展，極大地促進(jìn)了遺傳性聾致病基因的研究進(jìn)展，雖然測序技術(shù)越來越成熟，成本也越來越低，但是目前依舊面臨許多的挑戰(zhàn)，其中一個很大的挑戰(zhàn)是如何認(rèn)識基因變異對遺傳性聾發(fā)生、發(fā)展的影響。雖然測序研究能夠提示那些可能導(dǎo)致遺傳性聾發(fā)生的基因，但是還需要相應(yīng)的功能研究來證實。目前，大量突變基因中只有部分得到了進(jìn)一步的研究，而遺傳性聾的發(fā)生和發(fā)展，除了基因本身的改變，還有轉(zhuǎn)錄、翻譯和表觀遺傳方面的改變。因此，需要重視各類數(shù)據(jù)的有效整合。相信隨著測序技術(shù)的逐步成熟，遺傳性聾的本質(zhì)會逐漸被揭示出來。

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