杜 爽，張 巖，王 軒

（天津市種子管理站，天津 300061）

玉米種子純度（是指品種在特征特性方面典型一致的程度）是檢查玉米種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，鑒別種子的純度對玉米生產(chǎn)具有決定性作用。目前，檢驗方法主要包括田間檢驗、室內(nèi)檢驗和田間種植檢驗。

隨著我國玉米種子市場的快速發(fā)展，傳統(tǒng)檢驗手段已存在很大局限性，所以，急需我們建立一套簡便、快速、經(jīng)濟(jì)和準(zhǔn)確的種子純度檢測技術(shù)體系。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)是以DNA堿基序列的差異進(jìn)行分析對比，從而鑒別不同品種。其檢測對象是種子DNA的片段（基因），并沒有器官的特異性，且不受外部環(huán)境的影響，所以，有較高的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。目前，在玉米品種鑒定中應(yīng)用的有RFLP技術(shù)、RAPD技術(shù)、AFLP技術(shù)和SSR技術(shù)等。

1 RFLP技術(shù)

限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，簡稱 RFLP）指一個品種的DNA片段長度多態(tài)性。它是在1974年由Grodzicker等創(chuàng)立一種以DNA-DNA雜交為基礎(chǔ)最早發(fā)展起來的第一代遺傳標(biāo)記。其原理是用限制性內(nèi)切酶酶切不同品種的DNA，由于DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)生了長度不等、分子質(zhì)量大小不同的片段，通過瓊脂凝膠電泳分離大小不同的DNA片段，轉(zhuǎn)移凝膠中的DNA到尼龍膜或硝酸纖維素膜上，用放射性同位素或生物素標(biāo)記的探針進(jìn)行Southern雜交，經(jīng)放射顯影后，可觀察待鑒定品種的RFLP指紋，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品種RFLP指紋圖譜比較后，即可對此品種進(jìn)行純度分析。它反映了DNA序列中核苷酸排列順序的差異，RFLP標(biāo)記的多態(tài)性來源于基因組限制性酶切位點(diǎn)的突變及相鄰位點(diǎn)間DNA結(jié)構(gòu)重排 （包括缺失、重復(fù)、異位和插入）。

玉米種子中存在豐富的限制性片段長度的多態(tài)性，可作玉米品種的DNA指紋鑒定。RFLP多態(tài)性穩(wěn)定，容易重復(fù)，結(jié)果準(zhǔn)確。但該技術(shù)多態(tài)有限、成本昂貴且耗時較長，同時放射性同位素的使用會影響人體安全，限制了在實(shí)踐中的應(yīng)用。

2 RAPD技術(shù)

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA（Random Amplified Polymorphism DNA，簡稱 RAPD）是 1990年由美國杜邦公司的Williams和加利福尼亞生物研究所的Welsh等人一起發(fā)明的分子標(biāo)記技術(shù)。以DNA為模板，以一個隨機(jī)的寡核苷酸序列為引物，通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生不連續(xù)的DNA產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳后，用EB或銀染色，以檢測DNA序列的多態(tài)性。膠上呈現(xiàn)出的每條譜帶對應(yīng)品種基因組中的一個遺傳位點(diǎn)，不同位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無構(gòu)成了品種的多態(tài)性。RAPD多態(tài)性主要與隨機(jī)引物結(jié)合的靶位點(diǎn)的突變、引物結(jié)合位點(diǎn)間DNA堿基序列的缺失和插入有關(guān)。RAPD技術(shù)與多種指紋圖譜分析軟件相結(jié)合，廣泛應(yīng)用于玉米種質(zhì)研究及品種純度鑒定和真實(shí)性檢測中，在生產(chǎn)上主要應(yīng)用于新品種（系）、優(yōu)良單株及有重要應(yīng)用價值的玉米遠(yuǎn)緣種鑒定等。

RAPD技術(shù)反應(yīng)靈敏、多態(tài)性強(qiáng)、操作簡便、速度快且費(fèi)用低，既有大量的隨機(jī)引物可供篩選之用，又不受種屬的限制。盡管RAPD具有穩(wěn)定性和重演性差的缺點(diǎn)，但是，有研究指出具有高質(zhì)量的DNA、穩(wěn)定的PCR反應(yīng)條件、穩(wěn)定的程序、適宜的引物以及在整個過程中設(shè)置重復(fù)，就能獲得理想的純度鑒定結(jié)果。

3 AFLP技術(shù)

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（Amplification Fragment Length Polymorphism，簡稱AFLP）是 1992年由荷蘭科學(xué)家Zabean等人于1993年發(fā)明的一項專利技術(shù)，它結(jié)合了RFLP與PCR的優(yōu)點(diǎn)，具RFLP的穩(wěn)定性和PCR技術(shù)的高效。 指植物基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶的酶切后，形成分子量大小不等的隨機(jī)限制性片段，然后將特定的接頭連接在這些DNA片段的兩端，形成一個帶接頭的特定片段.再通過接頭序列和PCR引物末端的識別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將這些特異的限制性片段分離開來，從而顯示出擴(kuò)增片段長度的多態(tài)性。得到的DNA圖譜可用于品種純度鑒定。

該技術(shù)避免了分子雜交的復(fù)雜程序，靈敏度高、快速、多態(tài)性強(qiáng)、DNA的用量少且具較好的重復(fù)性，在玉米種質(zhì)資源鑒定和類群劃分上得到廣泛研究。但是，操作技術(shù)較為繁瑣、時間長且步驟多，并對操作者實(shí)驗技能及儀器設(shè)備的精密度要求很高，且成本較高（專利技術(shù)受專利法保護(hù)），當(dāng)前使其在種子純度的快速檢測普及應(yīng)用仍存在一段距離，所以該法不適合大面積普及推廣。但是，如果該方法能簡化并降低成本，將成為極有推廣前途的一項種子純度檢測的實(shí)用技術(shù)。

4 SSR技術(shù)

在高等生物基因組合普遍分布著由1～6個堿基組成的簡單重復(fù)序列 （Simple Sequence Repeat，SSR)， 又稱為微衛(wèi)星 DNA（Microsatellite DNA）。微衛(wèi)星位點(diǎn)兩側(cè)的序列是相當(dāng)保守的單拷貝序列，可以根據(jù)兩側(cè)序列設(shè)計一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或高濃度瓊脂糖凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)EB或銀染色，從而精確地檢測出特定位點(diǎn)微衛(wèi)星DNA的長度多態(tài)性，這種多態(tài)性遠(yuǎn)多于RFLP的多態(tài)性，是一種較為理想的DNA標(biāo)記技術(shù)，在玉米品種鑒定上進(jìn)行了廣泛的研究。由于該標(biāo)記技術(shù)具有共顯性、多態(tài)性豐富、重復(fù)性強(qiáng)、操作簡便和快速的特點(diǎn)，非常適于在種子公司及管理部門推廣應(yīng)用，因此，當(dāng)前被認(rèn)為是用于玉米品種純度鑒定的最可靠且實(shí)用的分子標(biāo)記技術(shù)。

與其它方法相比，應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定玉米種子純度具有多態(tài)性豐富、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好及無器官發(fā)育時期的特異性等優(yōu)點(diǎn)，且不受環(huán)境影響，但所需儀器精密、藥品昂貴，程序復(fù)雜。每一種技術(shù)都有其自身的優(yōu)缺點(diǎn)，有些技術(shù)還不能大規(guī)模應(yīng)用，還需繼續(xù)深入完善和研究。因此，在進(jìn)行具體的種子純度檢測時，應(yīng)該根據(jù)具體情況靈活掌握，充分發(fā)揮各種技術(shù)優(yōu)勢，綜合應(yīng)用，建立有效的技術(shù)體系才能達(dá)到準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)和快速檢測的目的。

[1]宇文強(qiáng)，葉雨盛，戴保威，等.DNA分子標(biāo)記與玉米種子純度檢驗[J].種子，2005，24（12）：38-42.

[2]張秀娟.雜交玉米種子純度檢驗[J].中國種業(yè)，2009，8：50-51.

[3]張鳳.生化指紋圖譜技術(shù)在品種鑒定中的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].種子世界，2009，10： 33-34.

[4]李智軍，盧文佳，李春艷，等.鑒定甜玉米品種真?zhèn)渭胺N子純度的 RAPD 引物篩選[J].種子，2010（4）：19-22.

[5]辛景樹，郭景倫，張軟斌.幾種常用分子標(biāo)記技術(shù)在種子純度和品種真實(shí)性鑒定方面的比較與分析[J].種子，2005，24（1）：58-60.

[6]林清，楊華，雷開榮，等.渝糯系列玉米雜種遺傳純度的 RAPD 鑒定[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2006，19（2）：182-184.

[7]杜金友，靳占忠，徐興友，等.AFLP標(biāo)記在玉米種質(zhì)資源鑒定中的應(yīng)用[J].西北植物學(xué)報，2006，26（5）：927-932.

[8]李曉輝，李新海，李文華，等.SSR標(biāo)記技術(shù)在玉米雜交種純度鑒定中的應(yīng)用[J].作物學(xué)報，2003，29（1）：63-68.

[9]郭景倫，趙久然，王鳳格.適用于SSR分子標(biāo)記的玉米單粒種子DNA快速提取新方法[J].玉米科學(xué)，2005，13（2）：l6-l7.