紀(jì) 佳

鄭州人民醫(yī)院藥劑科，河南鄭州 450000

黃連是一種我國(guó)常用的中藥，味苦，性寒，有清熱燥濕、瀉火解毒的治療功效，臨床上用來(lái)治療心煩、腹痛、嘔吐、脈促、下利等。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)黃連中主要含有的生物堿有小檗堿、黃連堿、巴馬汀等原小檗堿型的生物堿。本研究觀察薄層色譜和熒光分析法測(cè)定黃連生物堿在高速逆流色譜溶劑體系中分配系數(shù)的方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

國(guó)產(chǎn)高速逆流色譜儀（T300B），日本產(chǎn)熒光分光光度計(jì)（F4500），國(guó)產(chǎn)紫外儀，國(guó)產(chǎn)超聲波清洗器（KQ250B），國(guó)產(chǎn)旋渦混合器（XW80A），國(guó)產(chǎn)微量高速離心機(jī)（TG16W），國(guó)產(chǎn)薄層色譜硅膠板。

1.2 試藥

黃連堿標(biāo)準(zhǔn)品，小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品，巴馬汀標(biāo)準(zhǔn)品，表小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品（以上藥品均購(gòu)自中藥藥品生物制品檢定所），色譜純乙腈，分析純其他試劑。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別精密稱取黃連堿、小檗堿、巴馬汀、表小檗堿的對(duì)照品2 mg，分別于4 mL無(wú)水乙醇中100 KHz超聲溶解5 min，即得對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液，放置在0℃環(huán)境中進(jìn)行保存?zhèn)溆肹1]。

2.2 樣品溶液的制備

稱取黃連70%的乙醇提取物浸膏4 g（已知含有黃連堿9.21%，巴馬汀3.98%，表小檗堿3.45%，小檗堿18.50%）于4 mL無(wú)水乙醇中100 KHz超聲溶解5 min，即得樣品溶液，放置在0℃環(huán)境中進(jìn)行保存?zhèn)溆肹2]。

2.3 供試品溶液的制備

稱取適量的黃連總生物堿粗提物，將其溶解于氯仿（4）︰甲醇（1.5）︰0.2 mol/L鹽酸（2）溶液體系中，進(jìn)行完全溶解后靜置等待分層，收集等量的上下相，即得對(duì)供試品溶液，放置在0℃環(huán)境中進(jìn)行保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 薄層色譜條件

使用10 cm×10 cm，厚度為3 mm的薄層板；使用的展開(kāi)劑為環(huán)己烷（3）︰乙酸乙酯（3.5）︰異丙醇（1）︰甲醇（1.5）︰水（0.5）︰三乙胺（1）。首先將適量的黃連生物堿樣品用毛細(xì)管在硅膠薄層板上進(jìn)行點(diǎn)板，然后將點(diǎn)好樣品的薄層板放置在已使用氨水預(yù)飽和20 min的展開(kāi)缸里，進(jìn)行展開(kāi)，展開(kāi)后取出晾干，放置在365 nm紫外燈下進(jìn)行檢測(cè)[3]。

2.5 熒光分析方法

將點(diǎn)有樣品溶液的薄層色譜板展開(kāi)后放置在365 nm紫外燈下進(jìn)行檢測(cè)，在對(duì)應(yīng)的熒光斑點(diǎn)的位置畫出標(biāo)記，進(jìn)行定量的樣品刮取，將樣品放置在1.5 mL的離心管中后，加入1 mL的無(wú)水乙醇進(jìn)行渦旋搖勻后使用超聲儀20 min進(jìn)行提取，在使用設(shè)定在4 000轉(zhuǎn)/min的離心儀進(jìn)行5 min離心操作后，移取上清液放置在1.5 mL的離心管中，再吸取樣品適量加入無(wú)水乙醇2 mL，搖勻后進(jìn)行樣品的熒光強(qiáng)度分析，設(shè)定熒光光譜的波長(zhǎng)為409 nm，激發(fā)光波長(zhǎng)為365 nm，入射狹縫帶寬為5 nm，出射狹縫帶寬為5 nm，設(shè)定環(huán)境溫度為25℃。

2.6 線性關(guān)系考察

精密分別吸取濃度為0.5g/L的含4種黃連堿的標(biāo)準(zhǔn)品溶液 1、2、3、4、5、6 μL，進(jìn)行點(diǎn)板、展開(kāi)、刮板、提取，按“熒光分析方法”下進(jìn)行各樣品熒光強(qiáng)度的檢測(cè)，以樣品濃度和熒光強(qiáng)度進(jìn)行線性回歸，計(jì)算4種生物堿的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的線性范圍以及回歸方程。

2.7 加樣回收實(shí)驗(yàn)

精密稱取4種已知含量的生物堿樣品溶液，在1.0、1.5、2.0 g/L 3個(gè)水平加入混合對(duì)照品溶液在每個(gè)水平進(jìn)行6次平行檢測(cè)，計(jì)算回收率。

2.8 薄層色譜和熒光分析法測(cè)定分配系數(shù)計(jì)算

使用毛細(xì)管對(duì)黃連生物堿的上下相溶液進(jìn)行等量吸取，并均點(diǎn)于同一個(gè)硅膠薄層板之上，在“薄層色譜條件”下進(jìn)行展開(kāi)后，使用“熒光分析方法”下進(jìn)行刮板和提取，測(cè)定上下相中的4種黃連生物堿各自的熒光強(qiáng)度，并且在第3、5、8、10日進(jìn)行重復(fù)性的測(cè)量，將測(cè)定值進(jìn)行相比計(jì)算出樣品各自的分配系數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度

得到黃連素的回歸方程是I=442.79+139.86c（r=0.999 9），線性范圍為0.5~2.5 g/L；表小檗堿的回歸方程是I=489.89+153.80c（r=0.999 8），線性范圍為0.5~2.5 g/L；小檗堿的回歸方程是I=395.5+167.45c（r=0.999 9），線性范圍為 0.5~2.5 g/L；巴馬汀的回歸方程是I=356.9+173.89c（r=0.999 9），線性范圍為1.0~3.0 g/L。在線性范圍內(nèi)4種生物堿均具有良好的線性關(guān)系。見(jiàn)表1。

表1 4種生物堿的線性回歸方程以及回歸系數(shù)

3.2 實(shí)驗(yàn)回收率

得出黃連堿的平均加樣回收率為98.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.93%；表小檗堿的平均加樣回收率為103.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.61%；小檗堿的平均加樣回收率為95.3%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為3.36%；巴馬汀的平均加樣回收率為97.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為3.72%。

3.3 薄層色譜和熒光分析法測(cè)定分配系數(shù)

黃連堿的Rf值是0.74，分配系數(shù)是2.20；表小檗堿的Rf值是0.61，分配系數(shù)是1.60；小檗堿的Rf值是0.29，分配系數(shù)是0.83；巴馬汀的Rf值是0.21，分配系數(shù)是0.83。

4 討論

本研究當(dāng)黃連生物堿的樣品在溶劑體系分配平衡之后，收集等量的上下相，使用薄層色譜法進(jìn)行點(diǎn)板，展開(kāi)等操作后使用熒光分光光度分析法對(duì)黃連生物堿的樣品熒光值進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算黃連生物堿在高速逆流色譜溶劑體系中的分配系數(shù)。確定在線性范圍內(nèi)4種生物堿均具有良好的線性關(guān)系；黃連堿的Rf值是0.74，分配系數(shù)是2.20；表小檗堿的Rf值是0.61，分配系數(shù)是1.60；小檗堿的Rf值是0.29，分配系數(shù)是0.83；巴馬汀的Rf值是0.21，分配系數(shù)是0.83。不但有效的避免了中藥復(fù)雜成分中的相互之間的干擾[4]，同時(shí)也顯著性的提高進(jìn)行中藥化學(xué)分析的真確度和靈敏度。綜上所述，使用薄層色譜和熒光分析法對(duì)黃連生物堿在高速逆流色譜溶劑體系中分配系數(shù)進(jìn)行測(cè)定具有檢測(cè)時(shí)間短、準(zhǔn)確度高、應(yīng)用范圍比較廣的諸多優(yōu)點(diǎn)，值得推廣使用。

[1] 賀凱，李學(xué)剛，陳紅英，等.薄層色譜—熒光法測(cè)定黃連素生物堿分配系數(shù)[J].分析化學(xué)，2011，39（4）：572-575.

[2] 蘇本正.黃連配方顆粒薄層鑒別方法研究[J].山西中醫(yī)，2011，27（11）：49-50.

[3] 王道武，龐雪，趙全成，等.黃連生物堿的反相高效液相—電噴霧離子阱串聯(lián)質(zhì)譜的研究[J].分子科學(xué)學(xué)報(bào)，2011，27（3）：189-193.

[4] 于俊林，楊文娣，王朝暉.鮮黃連生物堿成分研究[J].中藥材，2003，26（10）：727-728.