吳海濱 羅少波 羅劍寧* 龔 浩 何曉莉

（1 廣東省農業(yè)科學院蔬菜研究所，廣東廣州 510640；2 廣東省蔬菜新技術研究重點實驗室，廣東廣州 510640）

DNA 分子標記在分子遺傳學的建立和發(fā)展過程中起著舉足輕重的作用，同時也是作物遺傳育種的重要工具。其中SSR（Simple Sequence Repeats）又稱簡單序列重復，是一種在PCR 基礎上發(fā)展起來的分子標記技術。與其他分子標記相比，它具有標記潛在數量豐富，等位位點變異多，信息含量高，共顯性，操作簡便，重復性好等優(yōu)點。因此，20 世紀90年代以來，在一些大田作物中，SSR 標記已經被遺傳學家和育種學家廣泛應用于遺傳多樣性分析、親緣關系鑒定、遺傳圖譜構建、功能基因的定位和克隆、分子標記輔助育種等研究領域（方宣鈞 等，2000）。根據SSR 標記的序列性質不同，SSR 標記可分為基因組SSR（Genomic SSR，gSSR）和表達序列標簽SSR（Expressed sequence tag SSR，EST-SSR），其中EST-SSR 是近年來建立起來的新型分子標記。

1 EST-SSR 標記概述

EST（Expressed Sequence Tags）即表達序列標簽，是將mRNA 反轉錄成cDNA，構建成cDNA文庫后，大規(guī)模隨機挑選文庫中cDNA 克隆，對其3′或5′端進行單向測序所獲得的一段cDNA序列。EST 是表達基因的窗口，它能反映mRNA 的信息，可代表生物體某種組織或細胞在某一時間的一個表達基因（于鳳池，2005）。目前，EST 數據庫作為基因組學與后基因組學研究的橋梁和工具，已經被廣泛應用于功能基因組分析、比較基因組分析、新基因的發(fā)現、基因表達調控及基因芯片的制作等研究領域。

研究表明，10%的 EST 序列中包含有簡單重復序列，可以用作 EST-SSR 標記的開發(fā)（Yammanoto & Sasaki，1997；Hatey et al.，1998）。EST-SSR 標記的開發(fā)和應用原理與gSSR 相似，兩者區(qū)別在于EST-SSR 來源于基因組的編碼區(qū)，更能反映出生物功能基因的信息（Li et al.，2004）。與gSSR 相比，EST-SSR 標記還具有開發(fā)費用少和難度相對較低、通用性好、信息量大等優(yōu)點。作為一種新的SSR 標記的來源，EST-SSR 標記已經在眾多生物種類中得到證實和應用。

2 EST-SSR 標記在蔬菜作物中的研究進展

2.1 植物EST 數據庫研究進展

植物EST 計劃作為植物基因組計劃的一個重要組成部分，已經在擬南芥、水稻、玉米、小麥、油菜等多種植物中得到開展。隨著EST 計劃在不同物種間的不斷擴展和研究的深入，以及DNA 測序技術的不斷進步，EST 的數量呈指數級的驚人速度增長。1991年各個公共數據庫的EST數目尚不足2 000 條，但隨著EST 數據的增多，1993年美國國家生物技術信息中心（National center of Biotechnology information，NCBI）建立了一個專門的EST 數據庫dbEST（data base of EST）用來收集和保存所有的EST 數據。截止2011年2月28日，該數據庫收集的水稻、玉米、小麥EST 序列數目已分別達到1.6×106、2.0×106、1.1×106條，蔬菜作物中黃瓜、甜瓜、番茄、辣椒的EST序列數目也已經分別達到8.1×103、3.6×104、2.9×105、1.1×105條。EST 資源數據庫的不斷擴充極大地方便和加快了人們在生命科學領域的研究，也為利用這些數據來開發(fā)EST 分子標記奠定了基礎。

2.2 EST-SSR 標記在蔬菜作物中的研究現狀

蔬菜是一大類作物的總稱，種類多、范圍廣。初步統(tǒng)計，現在全國栽培的蔬菜種類（含亞種、變種）已有209 種，其中普遍栽培的種類也有60～120 種。目前，EST-SSR 標記在一些主要蔬菜作物中已經得到了一定程度的開發(fā)和應用（表1）。為了便于敘述，本文將主要蔬菜作物大致分為葉菜類、茄果類和瓜類進行綜述。

2.2.1 葉菜類 在大白菜和普通白菜的EST-SSR 研究中，忻雅等（2006）對4 584 條大白菜和普通白菜EST 進行了SSR 搜索，共檢索出474 個SSR 位點，檢出率為10.3%。根據這些序列，設計了15 對EST-SSR 引物，在合適的PCR 反應體系下，以大白菜自交系A 的DNA 為模板，進行引物的篩選，發(fā)現15 對EST-SSR 引物都能擴增出產物。進一步用這些可擴增的引物對28 個大白菜和普通白菜品種進行PCR 擴增，發(fā)現7 對引物顯示多態(tài)性，占引物總數的46.7%。李麗和鄭曉鷹（2009）研制了由3 個引物對組成的6 套EST-SSR 復合標記組合，用于鑒定白菜〔Brassica campestrisL.ssp.chinensis（L.）Makino〕和大白菜〔Brassica campestrisL.ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕品種，并形成了多重SSR 的最佳試驗條件。這6 套標記組合完全鑒別了43 個白菜和大白菜品種，并且比較了單引物標記與復合標記的鑒定效率，確認其可以高效、準確和全面地鑒別白菜和大白菜品種的真實性和雜交種純度。

表1 蔬菜作物EST-SSR 標記開發(fā)進展

關于甘藍的EST-SSR 研究，陳琛等（2010）從NCBI 數據庫下載62 567 條甘藍相關EST，處理后得到19 611 條無冗余的EST，通過對其進行SSR 搜索，共得到1 219 個SSR，分布在1 176條EST 上，分布密度為1/11.48 kb，包括273 種重復基元。針對這1 176 條含有SSR 的EST 序列，設計合成了978 對引物，用兩份甘藍自交系對978 對引物進行初篩，897 對引物有擴增產物，共擴增出1 026 條擴增帶；128 對引物表現出多態(tài)性，共有258 條多態(tài)性帶（占總帶數的25.15%）。利用4 對多態(tài)性引物，初步構建了中甘11 號、8398、中甘15 號、中甘21 號甘藍雜交新品種及其親本的指紋圖譜。以上結果說明從甘藍相關EST 數據庫中開發(fā)的SSR 引物有較好的可用性。

2.2.2 茄果類 在茄果類蔬菜中，有關辣椒的EST-SSR 分子標記研究相對較多。Yi 等（2006）對辣椒10 232 條非冗余的EST 序列進行SSR 搜索，獲得1 201 個SSR 位點，平均每3.8 kb 有1個SSR 位點。利用所含SSR 的EST 序列，設計了812 對EST-SSR 引物，其中513 對引物（63.1%）有擴增產物，150 對引物（29.2%）在辣椒屬種間不同品種 TF68（C.annuum）和 Habanero（C.chinense）顯示出多態(tài)性。研究發(fā)現，包含AC 二核苷酸重復的EST-SSR 標記的多態(tài)性最高，多態(tài)性與基序長度和重復數成正比。同時將139 個多態(tài)性EST-SSR 引物整合于之前構建的遺傳連鎖圖上，使得該連鎖圖包含了14 個連鎖群，覆蓋長度2 201.5 cM。這些EST-SSR 標記均勻分布于各個連鎖群。這種基于SSR 標記的遺傳連鎖圖譜對于辣椒屬的比較作圖和分子標記輔助育種作用很大。李晶晶等（2008）對4 000 條辣椒EST 序列進行篩選，獲得了119 條含有SSR的EST，共設計出35 對EST-SSR 引物，占所有EST 序列的0.87%。以辣椒細胞質雄性不育系（CMS）21A，保持系21B 基因組DNA 為模板，利用新合成的EST-SSR 引物進行篩選，首次獲得編號為Pe21、Pe26 和Pe27 的3 對與辣椒育性相關的特異引物。這些信息對進一步研究辣椒細胞質雄性不育分子機理有一定的促進作用。張宇等（2010）利用SSRIT 軟件從NCBI 數據庫中的19 173 條辣椒EST 序列中篩選到612 個SSR，檢出率為3.19%。研究發(fā)現辣椒EST-SSR 以5～10 次重復為主，基序長度集中在15～20 bp 范圍內。利用含SSR 的576 條EST 序列共設計357對引物，在合適的PCR 條件下，337 對（94.40%）引物擴增出清晰條帶，75 對（21.01%）引物表現多態(tài)性，表明EST-SSR 標記在辣椒遺傳分析中是有價值且可行的。Ince 等（2010）利用辣椒屬EST 序列數據，設計了45 對EST-SSR 標記。將所設計的標記在辣椒屬的多個種內進行驗證，包括一年生辣椒（C.annuumL.）、灌木狀辣椒（C.frutescensL.）、中國辣椒（C.chinense）、下垂辣椒（C.baccatum）和柔毛辣椒（C.pubescens）。結果顯示，這些EST-SSR 標記在辣椒屬內不同種間具有良好的通用性。同時，研究發(fā)現包含二核苷酸重復的SSR 標記比三核苷酸重復的SSR 標記具有更好的多態(tài)性。

Stàgel 等（2008）篩選了超過3 300 條茄屬的EST 序列和基因組編碼區(qū)序列，獲得了64 條序列共含有70 個SSR 位點，其中50 條序列可以用于引物設計。用這些引物對38 個茄子栽培種和6 個茄屬近緣種進行分析，其中39 對（78.0%）引物有擴增產物，31 對（79.5%）引物在茄屬種間有多態(tài)性，僅有 11 對（28.2%）引物在茄屬栽培種內顯示多態(tài)性。通過試驗證明這些EST-SSR 標記在遺傳多樣性分析和構建系統(tǒng)進化樹方面作用顯著。

2.2.3 瓜類 在葫蘆科瓜類作物中，甜瓜、黃瓜、西瓜的EST-SSR 標記研究相對較多。Kong 等（2007）將GenBank 和Melon EST Database 數據庫中收錄的5 474 條來自甜瓜的EST 和mRNA序列進行拼接，共得到3 188 條Unigene，覆蓋長度為1.8 Mb。對這些序列進行SSR 位點搜索，共獲得分布于309 條Unigene 的383 個EST-SSR 位點，SSR 平均分布距離為1/4.7 kb。在這些鑒定出的SSR 位點中，191（49.9%）個位點為二核苷酸重復，167（43.6%）個位點為三核苷酸重復，12（3.1%）個位點為四核苷酸重復，8（2.1%）個位點為五核苷酸重復，5（1.3%）個位點為六核苷酸重復。選擇合成56 對EST-SSR 引物，其中47 對引物能夠擴增出預期產物，22 對引物在27 個甜瓜種質資源中擴增出特異性的多態(tài)性產物，平均每個位點能夠檢測到2.9 個等位基因?？赊D移性分析表明，有15 個引物對在黃瓜上獲得了特異性擴增產物，占總數的68.2%。Fernandez-Silva 等（2008）根據甜瓜EST 序列和基因組文庫序列設計了225 對SSR 引物，其中包括183 對EST-SSRs 引物和42 對gSSRs 引物。用這些引物在甜瓜種質資源中進行擴增驗證，結果表明144 對（79%）EST-SSRs 引物和36 對（86%）gSSRs 引物有擴增產物。其中126 對EST-SSRs 引物和31 對gSSRs 引物在甜瓜種質資源中顯示出多態(tài)性，多態(tài)性引物占有擴增產物引物的87%，EST-SSR 和gSSR 引物的多態(tài)率相似，分別為87.5%和89.0%。為了驗證EST-SSR引物在葫蘆科內部的通用性，將這些引物在南瓜屬中的中國南瓜、美洲南瓜和印度南瓜中進行擴增驗證。結果表明，有12.7%的引物至少在一種南瓜中有擴增產物，僅有5.4%的標記顯示出多態(tài)性。并將其中121 個新開發(fā)的SSRs 標記整合到以往構建的甜瓜遺傳圖譜中。

Gonzalo 等（2005）對比了甜瓜的EST-SSR 標記和gSSR 標記的多態(tài)性差異，研究表明EST-SSR 的多態(tài)性比例為45.5%，gSSR 的多態(tài)性比例為51.2%，兩者多態(tài)性值類似，并把EST-SSR 標記整合到甜瓜的遺傳圖譜上。

Kong 等（2006）從GenBank 中共獲得了5 268 條來自于黃瓜的EST 和基因序列，通過對這些序列分別進行組裝，獲得3 558 條黃瓜的Unigene。以重復基序長度為2～6 bp、最低重復次數5 次為標準，在Unigene 上搜尋SSR 位點，在474 條Unigene 中共獲得了582 個SSR 位點。在SSR 位點中，二核苷酸重復占60%，三核苷酸重復占36%。選擇了54 個SSR 位點合成側翼引物，在20 個黃瓜基因型上評價這些SSR 位點的多態(tài)性，其中有49 對引物有預期的擴增產物；20 對引物在20 個黃瓜種質材料中擴增出了特異性的具有多態(tài)性的產物。在多態(tài)性EST-SSR 位點上能夠檢測到2～6 個等位基因，平均每個位點能夠檢測到3.3 個等位基因?？赊D移性分析表明，有13 個引物對在甜瓜上有特異性擴增產物，占總數的65%，其中有7 個（35%）引物對在測試的甜瓜基因型上表現出多態(tài)性。Hu 等（2010）對GenBank 上公布的6 344 條黃瓜ESTs 進行SSRs 搜索，獲得533 個SSRs 位點，這些SSRs 位點主要為二核苷酸和三核苷酸重復，其中以AG和AAG 重復單元為主。392 條包含SSRs 位點的Unigene 適合用于引物設計。選擇合成了35 對SSR引物，28 對引物在黃瓜中有預期的特異性擴增產物，26 對引物在21 個黃瓜種質資源中擴增出特異性的多態(tài)性產物，平均每個位點能夠檢測到3.77 個等位基因。為了驗證EST-SSR 引物在葫蘆科內部的通用性，將28 對在黃瓜中有特異性擴增產物的引物在甜瓜、西瓜、南瓜和絲瓜中進行擴增驗證。結果表明，分別有26（92.9%）、16（57.1%）、15 對（53.6%）和17 對（60.7%）引物有擴增產物。這表明EST-SSR 標記有很好的物種間通用性，適合用于比較基因組分析。

鄒明學（2007）和鄒明學等（2009）對820 條來自西瓜的EST 序列進行了SSR 序列的篩選，共發(fā)現SSR 序列87 條，占整個EST 數據庫的10.6%。二核苷酸重復中AG、GA、CT 和TC 較高，三核苷酸重復以CAA 所占比例最大。根據篩選EST 數據庫得到的SSR 序列設計并合成了79 對EST-SSR 引物。經過PCR 擴增和銀染檢測表明，36 對引物在西瓜作圖親本材料P1296341 和97103 中顯示出穩(wěn)定清晰的帶型，并將其中的9 個EST-SSR 標記整合到以往構建的遺傳圖譜上。

3 EST-SSR 標記開發(fā)存在問題及解決方案

大量高質量的EST 序列信息是EST-SSR 標記開發(fā)的根本。目前，對于蔬菜作物而言，雖然網絡公共數據庫中已經積累了大量EST 數據，但是對于部分非大宗蔬菜作物而言，公共數據庫中的可利用信息非常有限。例如，截止2011年10月2日，dbEST 數據庫所收集的苦瓜、冬瓜、絲瓜EST 序列分別僅有180、19 條和1 條，如此少的序列信息將無法開發(fā)EST-SSR 標記。缺乏EST 序列信息是EST-SSR 標記在蔬菜作物中的大規(guī)模開發(fā)和應用的瓶頸。近年來，隨著新一代高通量測序技術的快速發(fā)展，大規(guī)模測序的費用較以往已經大大降低，例如利用solexa 測序技術對一種新作物的轉錄組進行測序獲得理想數據量的費用一般可以控制在5 萬元以內。因此，對于某些特色蔬菜作物，即使通過自主測序來開發(fā)EST-SSR 標記，其費用對于大多數實驗室而言也是可以接受的。

4 展望

蔬菜種類繁多，不同蔬菜作物間研究水平參差不齊。在分子標記研究領域中，除個別優(yōu)勢蔬菜作物外，大部分蔬菜作物研究水平薄弱。由于缺乏相應的序列信息，蔬菜中大量使用的分子標記主要分為兩類：一類是隨機引物標記，如RAPD 標記、ISSR 標記、SRAP 標記等（Singh et al.，2007；夏軍輝和向長萍，2008；高山 等，2010；李懷志 等，2011），由于隨機引物PCR所擴增的DNA 區(qū)段是無法預知的，具有很強的隨機性和任意性，因此所獲得的試驗結果往往重復性差，準確度低；另一類是基于限制性酶切和PCR 技術的AFLP 標記（Gaikwad et al.，2008；楊衍 等，2009），該標記具有多態(tài)性條帶豐富、信息量大、特異性高等優(yōu)點。但是由于該技術步驟繁瑣、操作難度大、耗時長等缺點，大大限制了該標記的應用。

近年來，隨著測序技術的發(fā)展和各種生物體基因組、轉錄組測序的快速推進，單核苷酸多態(tài)性標記（single nucleotide polymorphism，SNP）越來越受到人們的重視。SNP 是指在基因組水平上單個核苷酸的變異所引起的DNA 序列多態(tài)性，它具有基因組分布密度高及數量巨大等優(yōu)點，被認為是應用前景最好的遺傳標記。目前，對于大多數蔬菜作物而言，SNP 的開發(fā)和檢測還存在一定困難：首先，SNP 的開發(fā)需要依賴大量基因組或轉錄基因的序列信息，而蔬菜作物中大多數物種的基因組信息未知，因此標記的開發(fā)難度極大；其次，SNP 標記的檢測難度相對較大，目前SNP 的檢測方法主要有直接測序法、DNA 芯片技術、酶切PCR 檢測法等。這些方法往往存在操作難度大、步驟繁瑣、花費高等缺點，對于一般實驗室而言，難以大規(guī)模應用。近年來，美國Idaho 公司開發(fā)出了高分辨熔解曲線檢測系統(tǒng)（High Resolution Melting，HRM）突變篩查和基因分型分析系統(tǒng)，能夠快速、大規(guī)模地檢測SNP。但是該系統(tǒng)對樣品和試驗條件要求較高，同時大規(guī)模檢測費用較高。因此，SNP 標記在蔬菜作物中的大規(guī)模應用還需要相當長的時間。

EST-SSR 標記與上述標記相比，具有操作簡單、共顯性、擴增穩(wěn)定、多態(tài)性高、物種間通用性較好等突出優(yōu)點，非常適合運用于蔬菜作物中。隨著測序技術的發(fā)展，將會有越來越多蔬菜作物的轉錄組序列被測定，這將使得EST-SSR 標記的開發(fā)費用大大降低，將為其在蔬菜作物中的應用提供更加廣闊的空間。到目前為止，EST-SSR 標記在一些蔬菜作物中已經得到了一定的應用，但是對于大多數蔬菜而言，其應用程度遠遠不夠?；贓ST-SSR 標記的諸多優(yōu)點，大力開發(fā)蔬菜作物中EST-SSR 標記，對于提高分子標記在育種中的應用，加快蔬菜分子標記輔助育種步伐，進一步推進蔬菜產業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

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