（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶市蔬菜學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，重慶400715）

大頭芥〔Brassica juncea（L.）Czern.et Coss.var.megarrhizaTsen et Lee〕為根芥的一個變種，其中紅葉大頭芥（以下簡稱紅葉芥）在三峽庫區(qū)長江流域栽培面積大、經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量高。其肉質(zhì)根主要做腌漬用，營養(yǎng)豐富、味道鮮美；其葉片可作為天然紅色素提取的優(yōu)質(zhì)原料，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。通過對紅葉芥色素的LC-MS 分析表明，紅葉芥葉片中的紅色素主要由矢車菊素構(gòu)成（張欣，2008），矢車菊素是常見的6 種花青素之一?；ㄇ嗨卮x途徑是類黃酮代謝的一個重要分支?；ㄇ嗨氐纳锎x起始于苯丙氨酸，通過苯丙氨酸解氨酶PAL，查爾酮合成酶CHS，查爾酮異構(gòu)酶CHI，黃烷酮-3′-羥化酶F3′H，二氫黃酮醇還原酶DFR 以及花青素合成酶ANS等關(guān)鍵酶參與的一系列酶促反應(yīng)合成，隨后經(jīng)過不同的羥基化、甲基化和?；男揎椇筠D(zhuǎn)運(yùn)到液泡中匯集。這些直接調(diào)控花青素形成的關(guān)鍵酶類主要是通過花青素生物合成途徑中結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄而來，所以花青素代謝途徑的調(diào)控主要發(fā)生在結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄水平上，受多種轉(zhuǎn)錄因子在不同時間、空間上的調(diào)控，還有一些受到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（包滿珠，1997；張寧 等，2008）。

花青素類色素廣泛存在于葡萄、血橙、紫甘藍(lán)、藍(lán)莓、紫甘薯、矮牽牛等高等植物組織中，其生物合成途徑現(xiàn)在也已經(jīng)有相當(dāng)深入的研究（Fabienne & Christiane，1999；Cotroneo et al.，2006；Hironori et al.，2007；Lu et al.，2009）。植物花青素生物合成主要是受到外界環(huán)境因素的影響，這些環(huán)境因素主要包括光照（光照強(qiáng)度、光質(zhì)和光照時長等）、溫度、逆境脅迫、元素缺失等，環(huán)境因素的影響使花青素合成的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因表達(dá)上調(diào)或表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)或抑制花青素的合成與積累，最終使植物表現(xiàn)出不同的葉色或花色（Koes et al.，2005；Lepiniec et al.，2006）。目前對紅葉芥花青素的研究主要集中在對其葉片花青素色素理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的分析上，而對于紅葉芥花青素合成的分子機(jī)制并沒有進(jìn)行系統(tǒng)的研究，因此，對環(huán)境脅迫下紅葉芥花青素生物合成的研究具有重要的理論意義。本試驗選取了花青素生物合成途徑中上游和下游對花青素種類和積累量具有較大影響的CHI、DFR和ANS基因進(jìn)行了研究。首次克隆得到紅葉芥花青素生物合成途徑中編碼CHI、DFR和ANS的關(guān)鍵基因，并根據(jù)獲得的cDNA 序列重新設(shè)計熒光實(shí)時定量RT-PCR 引物，檢測模擬干旱、低溫和強(qiáng)光等環(huán)境脅迫對CHI、DFR和ANS表達(dá)的影響，并初步分析了環(huán)境脅迫下紅葉芥花青素累積與CHI、DFR和ANS表達(dá)的關(guān)系，有利于紅葉芥葉片呈色機(jī)理的深入研究，對芥菜色澤育種也具有重要意義，在花青素的食品應(yīng)用方面具有一定的應(yīng)用潛力和研究價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為紅葉大頭芥，由重慶市蔬菜學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室提供。

蘋果為異花授粉植物，要栽植授粉樹才能正常結(jié)實(shí)。授粉樹要求與主栽品種的花期一致，只有花期相遇才能保證授粉；開花多，花粉量大，與主栽品種親和性好。

1.2 環(huán)境脅迫處理

2009年11 月播種，待子葉展開后移至RXZ-300D 型人工氣候箱培養(yǎng)。光周期為12 h 光照（光照強(qiáng)度200 μmol·m-2·s-1，溫度22 ℃，相對濕度70%），12 h 暗培養(yǎng)（溫度18 ℃，相對濕度65%）。在保證材料正常生長的情況下，6 片真葉時開始進(jìn)行如下處理（每處理64 株，種植于64 孔穴盤，栽培基質(zhì)為Klasmann-Deilmann TS1 泥炭，處理前使用Scotts General Purpose水溶性復(fù)合肥灌根）。

低溫脅迫下紅葉芥的花青素含量在處理24 h 時出現(xiàn)明顯的增長，至96 h 達(dá)到最大值（圖4）。

取樣部位為處理后植株的第4、5 片真葉，取0.1 g 樣品用于目標(biāo)基因的表達(dá)分析（3 次樣品重復(fù)，3 次技術(shù)重復(fù)），余下部分進(jìn)行花青素含量測定（3 次試驗重復(fù)）。處理前取樣1 次作為對照，記為0 h。

1.3 總RNA提取及第一鏈cDNA 合成

花青素含量的測定參照Haskins 和Gorz 的方法（1986）進(jìn)行。

1.4 CHI、DFR 和ANS 基因克隆

杭州畫院作為全額撥款的公益性事業(yè)單位，徹底解決了畫院發(fā)展的后顧之憂，可以全力投入到藝術(shù)創(chuàng)作和畫院發(fā)展中去；在浙江省文化建設(shè)的標(biāo)志性建筑——西湖文化廣場中有了畫院的展覽、創(chuàng)作、辦公和休閑活動的場所，可以安居樂業(yè)了；畫師們揮灑著對國畫技藝的追求，肩負(fù)著傳承文藝的社會責(zé)任。近年來，圍繞杭州西湖和運(yùn)河申遺大事，做足“五水共導(dǎo)”文章，將“江河湖海溪”作為杭州美術(shù)創(chuàng)作重要題材，分別舉辦了“西溪視覺藝術(shù)展”、“三評西湖十景”美術(shù)展覽、“運(yùn)河春秋—全國中國畫名家邀請展”、“相聚大運(yùn)河 彩墨新杭州—美術(shù)作品展”、“新杭州—‘三江兩岸’油畫名家作品展”、“錢塘自古繁華—全國著名畫家畫杭州”等重大展覽活動。

表1 基因克隆所用引物

1.5 實(shí)時熒光定量RT-PCR 表達(dá)分析

實(shí)時熒光定量RT-PCR 試驗方法采用Livak Method（2ΔΔCt）在C1000 Thermal Cycler（Bio-Rad）上進(jìn)行。以β-Actin為內(nèi)參基因，樣品第一鏈cDNA 為模板，使用TransStartGreen qPCR SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司）配制反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件為：95 ℃，3 min（1 個循環(huán)）；95 ℃，20 s；57.5 ℃，20 s；72 ℃，20 s（35 個循環(huán)）。

1.6 花青素含量測定

取樣品0.1 g，使用RNAisoTMPlus（Takara）和RNAiso-mate for Plant Tissue（Takara）試劑盒提取總RNA，然后用DNase I（Takara）去除gDNA，最后使用TransScriptFirst-Strand cDNA Synthesis Super Mix（北京全式金生物技術(shù)有限公司）合成第一鏈cDNA。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅葉芥花青素合成途徑相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的克隆與分析

根據(jù) Genbank 上已發(fā)布的蕓薹屬植物花青素合成途徑相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的保守區(qū)域設(shè)計引物（表2），以紅葉芥葉片cDNA 為模板通過PCR 方法得到CHI、DFR和ANS3 個結(jié)構(gòu)基因的保守序列，序列的基本特征如表3所示。

表2 實(shí)時熒光定量RT-PCR 分析所用特異引物

表3 紅葉芥CHI、DFR 和ANS 基因基本特征

（3）形態(tài)觀察：采用透射電子顯微鏡（TEM）觀察膠束粒子的形態(tài)。將TPGS-CS載藥膠束溶液用水稀釋后，滴至表面有支持膜的銅網(wǎng)上，自然晾干后，用1%磷鎢酸染色，自然晾干后，送檢。從圖5可見，載藥膠束呈球形，有清晰的核-殼結(jié)構(gòu)，呈橢圓形，粒徑約為160 nm。

將獲得的基因片段提交NCBI、EMBL 和ExPASy 進(jìn)行核苷酸和推導(dǎo)氨基酸同源性比對，結(jié)果顯示，紅葉芥中CHI、DFR和ANS基因與蕓薹屬植物來源的3 個結(jié)構(gòu)基因具有極高的同源性。紅葉芥CHI基因推導(dǎo)編碼的氨基酸序列含有查爾酮異構(gòu)酶超家族基因的保守結(jié)構(gòu)域，該酶在植物體內(nèi)的類黃酮合成途徑中將查爾酮異構(gòu)化為4，5，7-三羥黃烷酮；DFR基因推導(dǎo)氨基酸殘基序列含有1 個Rossmann 折疊NAD（P）H/NAD（P）（+）結(jié)合位點(diǎn)（NADB）保守結(jié)構(gòu)域，其主要功能為結(jié)合底物并進(jìn)行特異的催化反應(yīng)；ANS基因推導(dǎo)氨基酸殘基序列屬于Fe（Ⅱ）2-酮戊二酸雙加氧酶超家族基因，其包含C 端的脯氨酰-4-羥化酶α亞基，推導(dǎo)得到的氨基酸殘基第210～219 位為ArgE/dapE/ACY1/CPG2/yscS，家族活性位點(diǎn)為LGVEAHtDVS。

2.2 紅葉芥花青素合成結(jié)構(gòu)基因在環(huán)境脅迫下的表達(dá)及花青素含量變化

2.2.1 模擬干旱脅迫 模擬干旱脅迫處理后，DFR基因和ANS基因在72 h 時表達(dá)量劇烈上漲，在處理96 h 后DFR基因仍持續(xù)小幅增長，而ANS基因表達(dá)量減少至最大值的一半左右；CHI基因在干旱脅迫下雖有增長趨勢，但變化幅度不大（圖1）。

模擬干旱脅迫下紅葉芥的花青素含量隨著處理時間的延長也隨之增加，在處理48 h 時增幅較大，此后增加緩慢（圖2）。

2.2.3 強(qiáng)光脅迫 強(qiáng)光脅迫下，DFR基因與ANS基因的表達(dá)隨時間延長而增加，處理后24 h 開始出現(xiàn)明顯上漲趨勢，72 h 時表達(dá)量陡增，隨后增幅減小，至96 h 達(dá)到最大；CHI基因的表達(dá)極低（圖5）。

設(shè)計引物（表1），以紅葉芥第一鏈cDNA 為模板，使用ExTaqDNA Polymerase（Takara）分別擴(kuò)增CHI、DFR和ANS，E.Z.N.ATMGel Extraction Kit（OMEGA）回收目的片段，將回收的片段克隆至pMD19-T Simple Vector（Takara），將菌液PCR 為陽性的重組子送至Invitrogen 測序。CHI通過引物CHI90-f 和CHI90-r 得到部分目的片段后，使用3′-Full RACE Core Set Ver.2.0（Takara）得到3′端cDNA 序列。

2.2.2 低溫脅迫 在8 ℃低溫脅迫下，DFR基因和ANS基因的表達(dá)隨著處理時間的推移持續(xù)增長，在處理48 h 時達(dá)到最大，以后小幅下降；CHI基因在整個處理過程中相對于其他兩個基因表達(dá)量極低，僅在處理24 h 時表達(dá)量有所上升，隨后又降至最低（圖3）。

模擬干旱脅迫：光溫條件不變，用10% PEG6000灌根模擬干旱脅迫。處理后12、24、48、72、96 h 各取葉片1 次。低溫脅迫：光照強(qiáng)度、光照時長和相對濕度保持不變，光照培養(yǎng)與暗培養(yǎng)溫度調(diào)整為8 ℃進(jìn)行處理。處理后1、6、12、24、48、96 h 各取葉片1 次。強(qiáng)光脅迫：溫度、光照時長、相對濕度保持不變，將光照強(qiáng)度提高至405 μmol·m-2·s-1進(jìn)行處理。處理后3、12、24、48、72、96 h 各取葉片1 次。

桐廬縣氣象臺7月26日9時、12時發(fā)布的短期天氣預(yù)報指出:“明天晴到多云,午后局部有陣雨或雷雨,偏南風(fēng)3級,氣溫26～38 ℃”。15時、18時發(fā)布的短期天氣預(yù)報指出:“明天晴到多云,午后局部有陣雨或雷雨,雷雨時短時風(fēng)雨較大,偏南風(fēng)3級,氣溫27～38 ℃”。

圖1 CHI、DFR 和ANS 基因在模擬干旱脅迫下的表達(dá)

圖2 模擬干旱脅迫下花青素含量的變化

表4 模擬干旱、低溫、強(qiáng)光脅迫下CHI、DFR、ANS 基因表達(dá)量和花青素含量的Pearson 相關(guān)性分析

圖3 CHI、DFR 和ANS 基因在低溫脅迫下的表達(dá)

圖4 低溫脅迫下花青素含量的變化

如表4所示，低溫脅迫下，CHI、DFR和ANS基因表達(dá)量與花青素含量呈現(xiàn)極顯著相關(guān)，且DFR基因和ANS基因相關(guān)性更高，基因間ANS與DFR也達(dá)到了極顯著相關(guān)，而CHI基因與ANS、DFR基因的相關(guān)性較低。

如表4所示，模擬干旱脅迫下，CHI、DFR和ANS基因表達(dá)量與花青素含量的變化極顯著相關(guān)，其中CHI基因與花青素含量的相關(guān)性最高。CHI、DFR和ANS基因間也呈現(xiàn)極顯著相關(guān)，ANS基因與DFR基因相關(guān)性較其他更高。

教育教學(xué)是情感的互動交流過程；是有溫度教育的具體體現(xiàn)；是實(shí)現(xiàn)全人教育的關(guān)鍵所在；是學(xué)生自我價值體現(xiàn)的關(guān)鍵。教育是充滿人性光輝的事業(yè)，是實(shí)現(xiàn)人的全面發(fā)展的教育，尊重學(xué)生情惑展現(xiàn)的是教師專業(yè)水平，也是教育的核心要素，沒有情感的教育是畸形的，也是無意義的教育，只有將情感融入教育教學(xué)全過程，在教學(xué)中傳遞情感是教師的職責(zé)所在，尊重學(xué)生的情感也是教育成敗的關(guān)鍵，學(xué)生情感得不到尊重，學(xué)生就不愿意融入教學(xué)，更不可能接受知識，只有“親其師，信其道”，教育才會高效進(jìn)行。

強(qiáng)光脅迫下紅葉芥的花青素含量從處理12 h 后開始緩慢增長，48 h 后增長變緩（圖6）。

(一)上馬石和銀庭寺。古道通過的里灣村口有一上馬峧(gǎo)，峧中有兩方大石，高約1.2～1.6米，當(dāng)?shù)卮迕穹Q這兩方大石為王羲之的上馬石；里、外灣村的村民們叫庵基崗的地方，龍皇堂村民稱為銀庭寺，當(dāng)?shù)卮迕裾f：“先有銀庭寺，后有金庭觀，古代是這樣傳下來的?！?/p>

如表4所示，CHI、DFR和ANS基因的表達(dá)量與花青素含量呈現(xiàn)極顯著相關(guān)，且DFR和CHI基因與花青素含量的相關(guān)性高于ANS基因與花青素含量的相關(guān)性。DFR基因與CHI基因的表達(dá)量無顯著相關(guān)。

圖5 CHI、DFR 和ANS 基因在強(qiáng)光脅迫下的表達(dá)

圖6 強(qiáng)光脅迫下花青素含量的變化

3 結(jié)論與討論

存在于葉片表皮細(xì)胞中的花青素等植物次生代謝產(chǎn)物，在植物遇到低溫、強(qiáng)光或干旱等逆境時大量合成，從而起到保護(hù)植物減輕損傷的作用（Holton & Cornish，1995；胡可 等，2010；Huang et al.，2010）?；ㄇ嗨氐暮铣蓮谋奖彼衢_始，通過兩類基因的調(diào)節(jié)：一類是植物共有的結(jié)構(gòu)基因，他們直接編碼花青素生物合成途徑中的生物合成酶類，比如苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）、查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI）、二氫黃酮醇還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）、花青素合成酶（anthocyanindin synthase，ANS）等，而且還通過與WD40、R2R3-MYB 和bHLH 等轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)構(gòu)基因啟動子中相應(yīng)的順式作用元件的結(jié)合（de Vetten et al.，1997；Quattrocchio et al.，1999；Spelt et al.，2000），從而激活或者抑制花青素生物合成途徑中一個或多個結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)（Ramsay & Glover，2005），最終控制花青素在時空上的變化。在結(jié)構(gòu)基因中，DFR在不同品種間表達(dá)的變化存在空間轉(zhuǎn)移性基因調(diào)節(jié)，其表達(dá)與CHI相協(xié)調(diào)。對DFR基因的調(diào)控通常都導(dǎo)致了花青素成分的改變，最終能產(chǎn)生新奇的葉色或花色（張劍亮，2008）。

本試驗用熒光實(shí)時定量RT-PCR 分析了CHI、DFR 和ANS基因在紅葉芥葉片中受環(huán)境脅迫（模擬干旱脅迫、低溫和強(qiáng)光）誘導(dǎo)后的表達(dá)情況及其與花青素積累的關(guān)系。結(jié)果表明，這些基因在脅迫處理前表達(dá)量都很低甚至不表達(dá)，其中DFR和ANS基因在低溫、強(qiáng)光脅迫處理后隨著處理時間的延長表達(dá)量顯著增加，而CHI基因處理后表達(dá)量極低。CHI基因雖然表達(dá)量極低，但在不同脅迫的每個處理過程中都有微量表達(dá)（可在模擬干旱脅迫的結(jié)果中觀察到，CHI基因隨著處理時間的延長有微量增長，其變化與干旱脅迫下花青素積累量的變化呈極顯著正相關(guān)），由此推斷CHI基因在紅葉芥葉片花青素的合成過程中的表達(dá)不同于在強(qiáng)光和低溫誘導(dǎo)條件下的調(diào)控類型，其表達(dá)可能受到其他調(diào)控機(jī)制的影響。因此，紅葉芥中CHI基因在本試驗設(shè)定的環(huán)境脅迫條件下與花青素的合成不顯著相關(guān)，這一結(jié)果可能有以下原因：①紅葉芥中CHI基因受到轉(zhuǎn)錄后或翻譯后修飾；②查爾酮異構(gòu)酶超家族基因中的其他家族基因影響了紅葉芥中的花青素合成，本試驗中克隆得到的CHI基因并非控制紅葉芥花青素合成的查爾酮異構(gòu)酶家族基因；③在沒有相應(yīng)調(diào)控機(jī)制的情況下，CHI基因表達(dá)量低。

在干旱脅迫下，DFR和ANS基因在脅迫初期表達(dá)量較高，處理12 h 后開始下降至很低的水平，至48 h 達(dá)到最低，此后表達(dá)量升高?？赡茉诿{迫初期存在于花青素途徑共享上游部分途徑的其他次生代謝產(chǎn)物合成途徑，比如類黃酮和原花青素的合成途徑，在整個干旱脅迫的過程中，花青素途徑代謝活躍，參與合成大量的花青素，這兩個基因的表達(dá)很可能參與了調(diào)控紅葉芥葉片花青素的生物合成（Nakatsuka et al.，2005）。

光照能夠影響花青素的積累及其結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，低溫也被認(rèn)為是另一個重要的因素（Boss et al.，1996；Lewis et al.，1999；Mori et al.，2005）。在本試驗中，經(jīng)過低溫處理的紅葉芥葉片花青素含量（本試驗中花青素含量包括無色花青素）隨著時間的延長持續(xù)增長，在經(jīng)過一定時間的處理后，增長更為明顯，這與DFR和ANS基因在此期間表達(dá)量的上升是一致的。經(jīng)過模擬干旱脅迫和強(qiáng)光脅迫處理后這兩個基因的表達(dá)量也具有相同的變化趨勢，這說明了紅葉芥中花青素的大量積累和結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)需要一定處理時間的誘導(dǎo)。由此可以推斷，在強(qiáng)光或低溫脅迫下DFR和ANS基因表達(dá)上調(diào)，對紅葉芥葉片花青素的合成起到了重要的調(diào)控作用，這與DFR基因在埃塞俄比亞芥的葉片、洋蔥鱗莖和水稻中的呈色作用相似（Marles et al.，2003；Kim et al.，2004，2005；Furukawa et al.，2007；Park et al.，2007）。DFR和ANS基因表達(dá)量的顯著增長與花青素的產(chǎn)生有著明顯的關(guān)系，這在后來的Pearson 相關(guān)性分析中也得到證實(shí)，相關(guān)性分析結(jié)果表明DFR和ANS基因表達(dá)量與花青素含量呈完全正相關(guān)，由此推斷本試驗中檢測的DFR和ANS基因?qū)儆诩t葉芥花青素生物代謝途徑，在強(qiáng)光和低溫脅迫下對花青素的合成具有重要影響。另外，在強(qiáng)光脅迫下花青素含量與低溫脅迫下花青素含量相差不大，但強(qiáng)光脅迫下DFR基因與ANS基因的表達(dá)量是低溫脅迫下表達(dá)量的2 倍左右，在強(qiáng)光處理96 h 后DFR與ANS基因的表達(dá)量仍是最大值，而低溫脅迫處理48 h 后DFR與ANS基因的表達(dá)量開始下降，由此推斷強(qiáng)光和低溫可能誘導(dǎo)了不同的調(diào)控機(jī)制。

所有面包的基本制作工藝流程是一致的，只是不同的面包品種在面團(tuán)攪拌、面團(tuán)發(fā)酵環(huán)節(jié)有差異，也僅僅是增加攪拌、松弛、發(fā)酵的次數(shù)。

本試驗?zāi)壳皟H對紅葉芥花青素合成途徑的主要結(jié)構(gòu)基因表達(dá)特性進(jìn)行了初步的探討，還沒有較為全面地解釋，而紅葉芥葉片的呈色還受到調(diào)控基因和其他因素（輔色素、pH 值等）的影響，還有待于對調(diào)控基因以及類黃酮代謝途徑中的其他基因進(jìn)行進(jìn)一步的分析和研究。

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