喬 寧 李美芹* 郭寶太 劉永光 裴華麗 竺曉平

（1 濰坊科技學(xué)院蔬菜花卉研究所，山東壽光 262700；2 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東青島266109；3 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東泰安 271018）

番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）屬于雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus），主要通過煙粉虱（Bemisia tabaci）傳播，可以侵染茄科、豆科等多種植物（Harrison et a1.，1977；Harrison & Robinson，1999），是分布廣泛的世界性番茄病毒之一。由TYLCV 引起的番茄黃化曲葉病毒病是一種毀滅性病害，自1964年發(fā)現(xiàn)以來，已給許多國(guó)家和地區(qū)造成了嚴(yán)重危害（Hanley-Bowdoin et a1.，1999；Moriones & Navas-Castillo，2000）。

番茄（Lycopersicon esculentumMill．）是山東省壽光市種植面積最大的蔬菜品種之一，常年種植面積達(dá)1.3 萬hm2。自2009年起在壽光主要番茄種植區(qū)相繼發(fā)現(xiàn)疑似番茄黃化曲葉病毒病的病害，該病害傳播速度快，危害程度高，致使受災(zāi)面積達(dá)7 000～8 000 hm2，給番茄生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失（龔一帆，2009；劉國(guó)霞 等，2009）。因此，應(yīng)盡快建立快速有效的TYLCV檢測(cè)方法。張玉滿等（2001）對(duì)番茄黃化曲葉病毒（TYLCV-CHI）外殼蛋白基因在大腸桿菌中的表達(dá)進(jìn)行研究，證實(shí)了以病毒外殼蛋白基因的原核表達(dá)產(chǎn)物為抗原制備抗血清是一條行之有效的途徑。本試驗(yàn)克隆了壽光地區(qū)TYLCV 分離物的外殼蛋白（CP）基因，并構(gòu)建其原核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了目的基因的高效表達(dá)，為抗血清的制備奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病株采集

2009～2011年在山東省壽光市蔬菜研究院番茄種植基地及壽光市稻田鎮(zhèn)、田柳鎮(zhèn)的番茄種植區(qū)進(jìn)行調(diào)查，采集番茄植株頂部卷曲黃化及矮縮等具有典型癥狀的葉片樣本10 份；陽性對(duì)照由浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所謝艷老師惠贈(zèng)；健康植株是由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院竺曉平老師提供的番茄組培苗。試驗(yàn)在濰坊科技學(xué)院蔬菜花卉研究所植物生理生化實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 工具酶及化學(xué)試劑

pEASY-T1 Simple 克隆試劑盒、T4-DNA 連接酶均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；XhoI和EcoR I 限制性內(nèi)切酶、DNA Marker、中等分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白均購(gòu)自MBI 公司；植物基因組DNA提取試劑盒、2xTaqMasterMix、Ni2+-NTA 親和層析柱、堿性磷酸酶標(biāo)記二抗、BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽）/NBT（四唑硝基藍(lán)）底物顯色試劑盒均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；硝酸纖維素膜、抗His 標(biāo)簽單克隆抗體和IPTG 均購(gòu)自Sigma 公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 載體及宿主菌

原核表達(dá)載體pET-32a 由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院竺曉平老師惠贈(zèng)，E.coliDH5α（用于克隆載體的轉(zhuǎn)化）、E.coliBL21（DE3）（用于表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化）感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 DNA 提取 取番茄病葉，按照試劑盒說明書提取植物總DNA。

1.4.2 病原PCR 分子鑒定 根據(jù)雙生病毒共同區(qū)及外殼蛋白基因保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物PA 和PA：5′-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3′；PB：5′-TGGACYTTRCAW GGBCCTTCACA-3′。PCR 反應(yīng)體系：2xTaqMasterMix 12.5 μL；10 pmol·L-1PA 1.0 μL；10 pmol·L-1PB 1.0 μL；模板DNA 1.0 μL，加ddH2O 至終體積25.0 μL。PCR 反應(yīng)條件為94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃繼續(xù)延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，并用DNAMAN 及NCBI網(wǎng)站上的BLAST 程序進(jìn)行比對(duì)分析。

1.4.3TYLCV-CP基因克隆 根據(jù)TYLCV-CP基因序列設(shè)計(jì)并合成引物TYCP1 和TYCP2，序列分別為 5′-GCGGAATTC ATGTCGAAGCGACCAGGCGAT-3′、5′-GCGCTCGAGATTTGATTTGAA TCATAG-3′，下劃線部分為酶切位點(diǎn)。內(nèi)切酶分別為EcoR I，XhoI。所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

以提取的總DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：2xTaqMasterMix 12.5 μL，10 pmol·L-1TYCP1 1.0 μL，10 pmol·L-1TYCP2 1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，加ddH2O 至終體積25.0 μL。PCR 反應(yīng)條件為94 ℃變性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃繼續(xù)延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，經(jīng)純化與pEASY-T1 Simple 載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR 和酶切鑒定獲得的重組克隆pT1-CP。

1.4.4TYLCV-CP基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建 用EcoR I 和XhoI 將TYLCV-CP基因從克隆載體pT1-CP 上切下，定向插入到同樣雙酶切的pET-32a，經(jīng)PCR 和酶切篩選陽性克隆，并將其命名為p32a-CP。提取該重組質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析重組表達(dá)載體中TYLCV-CP基因序列及讀碼框的正確性。

1.4.5TYLCV-CP基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 將重組載體p32a-CP 和pET-32a 分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3），挑取單菌落接種到LB 液體培養(yǎng)基〔含20 ug·mL-1Amp（氨芐青霉素）〕中，37 ℃培養(yǎng)過夜，將上述培養(yǎng)物接種于新鮮的LB 液體培養(yǎng)基（含20 ug·mL-1Amp）中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.8 時(shí)，加入終濃度為0.1～1.0 mmol·L-1的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h，取1 mL 離心收集菌體，12% SDS-PAGE 電泳檢測(cè)表達(dá)結(jié)果。將重組質(zhì)粒p32a-CP 擴(kuò)增培養(yǎng)至100 mL 后誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，經(jīng)超聲破碎后用Ni2+-NTA 親和層析柱純化目的蛋白，具體操作按照親和層析柱產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.4.6 Western blot 鑒定重組蛋白 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)12%的SDS-PAGE 凝膠電泳后，經(jīng)電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，轉(zhuǎn)移結(jié)束后，用5%脫脂牛奶37 ℃封閉轉(zhuǎn)移膜1 h；與1 000 倍稀釋的6×His 標(biāo)簽單克隆抗體室溫孵1 h；洗膜，用堿性磷酸酶標(biāo)記二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h；洗膜，用BCIP/NBT底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，陽性條帶出現(xiàn)后立即用蒸餾水漂洗中止反應(yīng)，拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原PCR鑒定

從采集的10 份病樣中任取3 份，分別提取番茄總DNA，并以此為模板利用雙生病毒簡(jiǎn)并引物PA/PB 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，3 份樣品均得到500 bp 左右的目的條帶，與陽性對(duì)照的片段大小一致，而健康番茄樣品中無此條帶。BLAST 分析測(cè)序結(jié)果顯示，該片段序列由 541 個(gè)堿基組成，與孫海霞等（2009）、褚棟等（2010）已發(fā)現(xiàn)的番茄黃化曲葉病毒具有極高的同源性（97%～99%），因此可以說明番茄病葉由TYLCV 壽光分離物侵染所致。

2.2 TYLCV-CP 基因克隆

以病葉總DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示得到約770 bp 的特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。重組質(zhì)粒pT1-CP 經(jīng)EcoR I 和XhoI 雙酶切以及以該重組質(zhì)粒為模板，TYCP1/TYCP2 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，均得到約770 bp 的目的條帶（圖2），說明克隆得到了TYLCV-CP基因的特異性DNA 片段。

圖1 感染TYLCV 番茄病葉DNA 的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

經(jīng)EcoR I 和XhoI 雙酶切的TYLCV-CP基因正確插入到表達(dá)質(zhì)粒pET-32a 中，獲得了陽性克隆p32a-CP。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR 擴(kuò)增與EcoR I、XhoI 雙酶切后，均可見約770 bp 的目的片段，而在EcoR I 和XhoI 單酶切圖譜上都只有1 條約6.6 kb 的DNA 條帶（圖3）。測(cè)序結(jié)果表明（圖4），該序列包含了TYLCV-CP基因的774 bp 編碼序列，編碼268 個(gè)氨基酸，與表達(dá)載體pET-32a連接正確，沒有發(fā)生移碼，堿基沒有改變，同GenBank 中報(bào)道的相關(guān)序列完全一致，其登錄號(hào)為FN256257（Zhang et al.，2009）。

圖2 重組質(zhì)粒pT1-CP 的酶切及PCR 鑒定結(jié)果

圖3 原核表達(dá)載體p32a-CP的酶切及PCR鑒定結(jié)果

圖4 TYLCV-CP 基因全序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將鑒定正確的重組質(zhì)粒 p32a-CP 轉(zhuǎn)入E.coliBL21（DE3），經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)4 h 后，12%SDS-PAGE 分析可見明顯的蛋白表達(dá)條帶，其大小為50 kD，是19 kD 硫氧還蛋白與推測(cè)的31 kD 的外殼蛋白分子量之和（圖5）。而未經(jīng)誘導(dǎo)的含有重組表達(dá)質(zhì)粒的菌株無此條帶。通過分析全菌蛋白和超聲波破碎后上清液的電泳圖譜發(fā)現(xiàn)，TYLCV-CP基因的表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在。通過凝膠掃描分析，目的蛋白的表達(dá)量約占細(xì)菌總蛋白的25%。經(jīng)Ni2+-NTA 親和層析柱純化后，SDS-PAGE 電泳顯示洗脫物中有清晰單一的特異性蛋白條帶，獲得了高純度的目的蛋白（圖6）。

圖5 TYLCV-CP 基因在大腸桿菌中的表達(dá)結(jié)果

2.5 重組蛋白的Western blot 分析

將表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上進(jìn)行Western Blot 檢測(cè)，通過圖7 可以看出泳道2 和5 所表達(dá)的蛋白條帶位置上有明顯的雜交條帶，而菌體蛋白條帶的位置（泳道3 和4）沒有出現(xiàn)雜交條帶；另外，泳道 1 中的目的蛋白含量非常少，故未出現(xiàn)較明顯的雜交條帶。表明壽光地區(qū)TYLCV-CP基因在E.coliBL21（DE3）中得到了融合表達(dá)，具有良好的免疫原性。

圖6 TYLCV-CP 基因表達(dá)產(chǎn)物的純化分析

圖7 重組蛋白的Western blot 分析

3 結(jié)論與討論

通過田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)番茄黃化曲葉病毒病已在山東壽光地區(qū)大面積發(fā)生，并有繼續(xù)蔓延的趨勢(shì)。紀(jì)文磊等（2010）發(fā)現(xiàn)，山東壽光地區(qū)的番茄黃化曲葉病毒與上海、安徽、日本登錄的番茄黃化曲葉病毒的同源性達(dá)到了99%，屬TYLCV-Israe l 株系的一個(gè)分離物。

本試驗(yàn)采用了超聲波法提取細(xì)菌總蛋白，SDS-PAGE 電泳結(jié)果顯示上清液中目的蛋白含量較少，而得到的沉淀經(jīng)尿素溶解后能純化出單一目的蛋白條帶，說明表達(dá)的重組蛋白主要以包涵體的形式存在，這可能與表達(dá)量過高、表達(dá)條件不夠完善等因素有關(guān)；盡管目的蛋白的N 端融合了硫氧還蛋白，但仍出現(xiàn)了不可溶現(xiàn)象，而安乃莉等（1999）發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白（TrxA）可促進(jìn)外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)，這就需要下一步通過優(yōu)化表達(dá)條件來提高CP 蛋白的可溶性。

目前國(guó)內(nèi)針對(duì)番茄黃化曲葉病毒的檢測(cè)主要是何自福等（2004）、葉青靜等（2008）應(yīng)用的PCR 法，但該法技術(shù)含量高、設(shè)備昂貴，不適合進(jìn)行大量樣品的田間檢測(cè)。在實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)大量樣品檢測(cè)的方法主要是ELISA 法（薛朝陽 等，1999；謝艷 等，2002），而大量制備特異性的抗血清是應(yīng)用該方法的前提。傳統(tǒng)方法多采用提純的病毒粒子為抗原制備抗血清，但存在一些弊端。據(jù)Neo 等（1993）報(bào)道，病毒外殼蛋白具有良好的抗原特異性。利用基因工程技術(shù)克隆病毒外殼蛋白，并以此為抗原制備抗血清，能夠克服常規(guī)途徑的諸多困難，已成為病毒抗血清制備的新途徑，該途徑現(xiàn)成功應(yīng)用于煙草（朱常香 等，2005）、辣椒（吳育鵬 等，2010）、黃瓜（陳紅運(yùn) 等，2007）、甜菜（姚華建 等，1994）等多種植物病毒的血清學(xué)檢測(cè)，但關(guān)于番茄黃化曲葉病毒的相關(guān)研究還比較少。本試驗(yàn)已成功構(gòu)建了TYLCV-CP基因的原核表達(dá)載體，下一步將制備針對(duì)目的蛋白的特異性抗血清，為TYLCV 的ELISA 檢測(cè)方法的建立奠定基礎(chǔ)。

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