姜代勛，陳益山，鞏忠福，穆 祥，陳 武

［1．北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)（中醫(yī)藥）北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 昌平 102206；2．中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 海淀 100081］

白芍為毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall．）的干燥根，性微寒，味苦、酸，入肝經(jīng)。具有平肝止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)和斂陰止汗等功效，主要用于頭暈、脅痛、腹痛、四肢攣痛、血虛萎黃、月經(jīng)不調(diào)、自汗等證［1］，為中（獸）醫(yī)臨床上最常用的中藥之一?，F(xiàn)代研究表明，白芍具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用［2－4］，其中，以白芍的抗炎作用研究引人注目［5－9］。

研究表明，白芍提取物為高效PDE4活性抑制劑［10］。通過(guò)抑制PDE4活性，可使多種炎癥和免疫細(xì)胞（如嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞等）c AMP達(dá)到足以抑制炎癥細(xì)胞活化的濃度而發(fā)揮抗炎作用。白芍提取物雖經(jīng)多步操作制作而成，但對(duì)其內(nèi)部成分和含量仍然未知，因此難于控制其質(zhì)量。為了使其內(nèi)部成分及含量以“圖譜”形式反映出來(lái)，本試驗(yàn)通過(guò)用HPLC方法建立了白芍提取物的指紋圖譜，為全面控制其質(zhì)量并為獸醫(yī)臨床開(kāi)發(fā)新型、高效、低毒副作用的純天然抗炎中藥積累資料。

1 材料與方法

1．1 主要儀器和試劑 安捷倫1100高效液相色譜，色譜柱Eclipse XDB-C185μm，4．6×150 mm，Millipol超純水儀，日立SCR20BA高速冷凍離心機(jī)，上海精密p HS-2C型精密酸度計(jì)，ACCULAB分析電子天平。色譜乙腈（Merck），芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所），其他化學(xué)試劑均為分析純。

1．2 白芍提取物的制備 白芍提取物參考以前的方法制備［8］。簡(jiǎn)言之，即以蒸餾水煎煮提取2次，合并煎液減壓濃縮；加入3倍量95%乙醇，充分?jǐn)嚢栌?℃靜置；濾取上清液用氫氧化鈉調(diào)p H值至7．5～8．0，再次靜置；濾取上清液，揮發(fā)掉乙醇，將藥液濃縮至1 g生藥／m L。

1．3 白芍提取物指紋圖譜分析 白芍提取物指紋圖譜分析參考張克榮等人的方法［11］，對(duì)白芍提取物指紋圖譜的檢測(cè)條件及其穩(wěn)定性等進(jìn)行研究。

1．3．1 溶液制備 精密稱取芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇配制成0．25 mg／m L的溶液。白芍提取物用流動(dòng)相稀釋至10 mg生藥／m L，搖勻，0．22μm微孔濾膜過(guò)濾備用。

1．3．2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 取標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液，分別在210 nm、230 nm、254 nm和270 nm共4個(gè)波長(zhǎng)處檢測(cè)，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行190 nm～400 nm的全波長(zhǎng)掃描。1．3．3 色譜條件 色譜柱Eclipse XDB-C18 5μm，4．6×150 mm。HPLC分析流動(dòng)相為乙腈和水（12／88）。流速0．8 m L／min，柱溫25℃。

1．3．4 方法學(xué)考察 根據(jù)文獻(xiàn)［12-13］等分別對(duì)液相色譜的精密度、樣品的重復(fù)性及穩(wěn)定性等進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2．1 運(yùn)行時(shí)間 依據(jù)《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》，考察了運(yùn)行時(shí)間為120 min的HPLC圖譜，確定60 min之后再無(wú)峰出現(xiàn)，因此，確定每次色譜的運(yùn)行時(shí)間為60 min。

2．2 HPLC精密度試驗(yàn) 取新制備的白芍提取物樣品，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄指紋圖譜，考察色譜精密度。結(jié)果表明，5個(gè)主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積比值均無(wú)明顯變化（RSD≤2．49），符合指紋圖譜技術(shù)要求（RSD均在3以內(nèi)），表明儀器具有良好的精密度。結(jié)果見(jiàn)表1。

2．3 白芍提取物重復(fù)性試驗(yàn) 取同一白芍飲片，稱取5份，以相同方法制備進(jìn)行測(cè)定，考察色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的一致性。結(jié)果表明，5個(gè)主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的比值沒(méi)有顯著變化（RSD≤2．72），達(dá)到色譜指紋圖譜要求（RSD在3以內(nèi)），提示樣品和儀器的重現(xiàn)性良好。結(jié)果見(jiàn)表2。

2．4 白芍提取物穩(wěn)定性試驗(yàn) 取一新制備的白芍提取物樣品，分別在0、12、24、48、72 h進(jìn)樣，記錄指紋圖譜，檢測(cè)樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，各5個(gè)主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積比值基本一致（RSD≤2．96），符合指紋圖譜要求（RSD 在3以內(nèi)），表明樣品的穩(wěn)定性良好。結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 HPLC精密度試驗(yàn)結(jié)果

表2 白芍提取物重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表3 白芍提取物穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2．5 白芍提取物指紋圖譜 見(jiàn)圖1、2。

由圖1可見(jiàn)，白芍提取物主要存在峰1至峰5共5種成分，其中第4峰經(jīng)與對(duì)照品芍藥苷比較鑒定為芍藥苷。210 nm、254 nm、270 nm處各色譜圖與230 nm檢測(cè)結(jié)果基本一致，但峰面積、峰高較小，不能準(zhǔn)確積分，而以230 nm檢測(cè)，峰面積、峰高較大，峰數(shù)多，故最適合作白芍提取物指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。

由圖2可知，白芍提取物5種主要成分紫外吸收?qǐng)D譜類似，提示其存在同一官能基團(tuán)。

3 討論

中藥成分復(fù)雜，以少數(shù)指標(biāo)性成分控制產(chǎn)品質(zhì)量不能體現(xiàn)其整體性，因而如何對(duì)中藥制劑進(jìn)行整體質(zhì)量控制是目前中藥研究的熱點(diǎn)問(wèn)題［14］。中藥的質(zhì)量控制是中藥現(xiàn)代化的一個(gè)重要組成方面，中藥指紋圖譜作為中藥質(zhì)量穩(wěn)定性的重要檢定方法，在中藥制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)和中藥生產(chǎn)的質(zhì)量控制中有著廣泛的應(yīng)用［15－16］。指紋圖譜技術(shù)可整體上反應(yīng)內(nèi)在成分的情況，有可能最大化的獲得藥品內(nèi)在質(zhì)量的信息，并可指導(dǎo)生產(chǎn)企業(yè)對(duì)原料、半成品及成品進(jìn)行質(zhì)量控制，將中藥制劑成分含量的波動(dòng)控制在一定范圍內(nèi)，盡可能縮小各批次間的差異，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定和均一。

白芍主要含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷、去苯甲酰芍藥苷、沒(méi)食子酰芍藥苷等單萜苷類；沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸甲酯、沒(méi)食子酸乙酯、兒茶素、五沒(méi)食子酰葡萄糖等鞣質(zhì)類成分［17］。此外，尚含有苯甲酸、β－谷甾醇、揮發(fā)油、脂肪油、樹(shù)脂、糖、淀粉、黏液質(zhì)、蛋白質(zhì)和三萜類成分。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，色譜儀的精密度、白芍提取物樣品的重復(fù)性及穩(wěn)定性均符合指紋圖譜要求。由圖可見(jiàn)，白芍提取物在不同波長(zhǎng)各峰分離度均較好，但以230 nm檢測(cè)，峰面積、峰高較大，峰數(shù)較多。從指紋圖譜可見(jiàn)白芍提取物主要存在5種成分，因僅獲得標(biāo)準(zhǔn)品芍藥苷，鑒定出第4峰為芍藥苷，其他4種成分正在進(jìn)一步鑒定中。另外，我們通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)芍藥苷對(duì)PDE4活性影響較小，因而其余4種成分的分離及鑒定有助于從白芍提取物中發(fā)現(xiàn)新的高效PDE4活性抑制劑，有利于新型抗炎藥的研發(fā)。鑒于白芍提取物在動(dòng)物炎癥模型上顯示的良好抗炎作用［8－9］，提示其有望成為用于獸醫(yī)臨床的一種新型純中藥抗炎藥，但對(duì)于它的安全性及其臨床療效等仍需進(jìn)一步研究。

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