尹 姣， 馮紅林， 李克斌， 曹雅忠

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

昆蟲與植物在長期協(xié)同進(jìn)化過程中形成了各種針對性的適應(yīng)機(jī)制。昆蟲會(huì)有目的地選擇性取食不同的寄主植物，通過消化和吸收植物食料中的營養(yǎng)物質(zhì)，并分解排泄有毒物質(zhì)，才能正常地生長發(fā)育及繁殖。由于不同寄主植物的營養(yǎng)成分及次生代謝物質(zhì)不同，昆蟲取食后體內(nèi)的生理生化反應(yīng)亦有所不同，進(jìn)而會(huì)對其生長發(fā)育產(chǎn)生明顯影響。因此，在長期的演化過程中，昆蟲在生理功能上產(chǎn)生了相應(yīng)的適應(yīng)機(jī)制，其中一系列解毒酶系的出現(xiàn)，是這種適應(yīng)的主要方式之一［1］。

正常情況下，生物體細(xì)胞內(nèi)自由基如單線態(tài)氧（1O2）、過氧化氫（H2O2）、氫氧自由基（HO·）等的產(chǎn)生與清除是在超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）3種酶協(xié)調(diào)一致，處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，使自由基維持在一個(gè)低水平，從而防止自由基毒害，一旦這種平衡受到破壞，就可能產(chǎn)生傷害作用［2］。因此，F(xiàn)ridovich把以上3種酶統(tǒng)稱為保護(hù)酶系統(tǒng)［3］。保護(hù)酶系統(tǒng)的形成是昆蟲在進(jìn)化過程中逐步形成的抵抗外源刺激物和不良因素影響的有效途徑。

草地螟（Loxostege sticticalis L．）是在我國東北、華北和西北地區(qū)嚴(yán)重發(fā)生的多食性害蟲之一，可嚴(yán)重為害大豆、甜菜、苜蓿、向日葵等作物及牧草，對農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)造成了很大威脅。草地螟具有廣泛的寄主范圍，同時(shí)對其寄主植物又有一定的選擇性，這在其生物學(xué)記載中已有相應(yīng)研究報(bào)道［4－7］，研究發(fā)現(xiàn)草地螟的寄主植物可分為適宜寄主植物和非適宜寄主植物，草地螟幼蟲在3齡以前對寄主植物的?；砸筝^高，但老齡幼蟲卻存在明顯的轉(zhuǎn)主為害習(xí)性，取食非適宜寄主植物亦可發(fā)育、繁殖，表明老齡幼蟲體內(nèi)對于非適宜寄主存在一定的適應(yīng)機(jī)制［8－9］。目前有關(guān)不同寄主植物對昆蟲體內(nèi)解毒酶的影響作用已經(jīng)進(jìn)行了較廣泛研究［10－17］，但是草地螟對不同寄主植物的生理適應(yīng)機(jī)制仍然缺乏系統(tǒng)研究，尤其老齡幼蟲取食寄主范圍擴(kuò)大的內(nèi)在機(jī)理尚不夠清晰。因此，作者利用5種不同寄主植物飼養(yǎng)草地螟4齡幼蟲，探討了草地螟老齡幼蟲中腸酶系對不同寄主植物的反應(yīng)變化，為闡明草地螟老齡幼蟲對不同寄主植物生理適應(yīng)機(jī)理奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為解析草地螟與寄主植物之間的相互關(guān)系以及在長期進(jìn)化過程中的適應(yīng)性對策提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 蟲源及飼養(yǎng)條件

蟲源來自內(nèi)蒙古烏蘭浩特市郊采集的越冬代蛹，經(jīng)室內(nèi)飼養(yǎng)繁殖后作為試驗(yàn)材料。羽化后的草地螟成蟲用5%的葡萄糖水飼養(yǎng)；卵孵化后幼蟲用藜（Chenopodium album L．，俗名灰菜）飼養(yǎng)至4齡。成蟲和幼蟲的飼養(yǎng)條件為（22±1）℃，L16∥D8，RH 70%～80%。

1．2 寄主植物

試驗(yàn)所用植物材料分別選取適宜寄主藜、向日葵、大豆和非適宜寄主玉米、馬鈴薯5種植物的幼苗葉片，其中向日葵、大豆、玉米、馬鈴薯在北京郊區(qū)的中國農(nóng)科院植保所試驗(yàn)田種植，藜采自試驗(yàn)田內(nèi)和周邊的自生植株。試驗(yàn)前用蒸餾水沖掉各試驗(yàn)植物葉面的異物，晾干后飼喂試蟲。

1．3 寄主植物對草地螟幼蟲中腸解毒酶的影響

1．3．1 酶液的制備

每種材料加入1．5 mL預(yù)冷的相應(yīng)的酶緩沖液，羧酸酯酶用0．04 mol／L、p H7．0的PBS提取；乙酰膽堿酯酶用0．1 mol／L、p H7．4的PBS提取。材料在冰浴中勻漿，勻漿12 000 g，10 min，取上清液作為酶液。

1．3．2 羧酸酯酶（Car E）活性測定

參考Van Asperen的方法［18］，并加以改進(jìn)。取3．6 mLα－乙酸萘酯（α－NA），0．1 mL酶液混勻后，置30℃水浴15 min后，加1 mL DBLS試劑（1% 固藍(lán)B與5% 十二烷基硫酸鈉以2∶5混合），反應(yīng)15 min后，于600 n m波長測吸光值。

α－乙酸萘酯貯液配制方法：取5．58 mgα－乙酸萘酯，8．25 mg毒扁豆堿，1 mL丙酮溶于0．04 mol／L、p H7．0的PBS中，并在100 mL容量瓶中定容制成α－乙酸萘酯貯液。

1．3．3 谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶活力測定

參照Boot h方法［19］。反應(yīng)混合液含0．1 mL酶液，2．9 mL 0．1 mol／L 的 磷 酸 緩 沖 液 （p H 8．0），0．7 mL 0．03 mol／L的谷胱甘肽液，50μL 0．1 mol／L的CDNB液，在25℃水浴中反應(yīng)30 min，加熱使其失活，在350 n m比色。

1．3．4 乙酰膽堿酯酶（Ach E）活力測定

參照Ell man方法［20］。反應(yīng)混合液含有50μL酶液，2．8 mL 0．1 mol／L的磷酸緩沖液（p H 8．0），50μL 0．075 mol／L的碘化乙酰膽堿，0．1 mL 0．01 mol／L的DTNB液，在25℃水浴中保溫15 min，加入0．1 mL 10－3mol／L毒扁豆堿。410 n m 處比色。用谷胱甘肽作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．3．5 蛋白含量測定

參照 Bradfor d的方法［21］，取0．1 mL 酶液與5 mL考馬斯亮藍(lán)G250混勻，測定各酶液中可溶性蛋白含量，以牛血清蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．4 寄主植物對草地螟幼蟲中腸保護(hù)酶的影響

草地螟幼蟲取食不同寄主植物后中腸超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）活力測定按南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的SOD、CAT和POD試劑盒說明進(jìn)行。

1．5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SAS軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用Duncan氏多重比較進(jìn)行處理間的差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同寄主植物對草地螟幼蟲中腸解毒酶的影響

2．1．1 寄主植物對草地螟中腸羧酸酯酶的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，取食不同寄主植物會(huì)顯著影響草地螟幼蟲中腸羧酸酯酶活力（圖1）。其中，取食藜時(shí)中腸羧酸酯酶活力最高，顯著高于取食其他寄主植物時(shí)羧酸酯酶活力。同時(shí)，隨著取食時(shí)間的延長，羧酸酯酶活力明顯增加，其中，取食非適宜寄主植物（如馬鈴薯、玉米）比適宜寄主的羧酸酯酶（藜、大豆）活力增加迅速。盡管取食非適宜寄主植物能夠顯著刺激羧酸酯酶活力的增加，但是取食適宜寄主植物時(shí)中腸羧酸酯酶活力一直顯著高于取食非適宜寄主植物時(shí)的羧酸酯酶活力，說明取食適宜寄主植物會(huì)在短期內(nèi)刺激羧酸酯酶的快速增加，隨著取食時(shí)間的延長，羧酸酯酶活力不再顯著變化；取食非適宜寄主植物則會(huì)在較長時(shí)間內(nèi)刺激幼蟲中腸內(nèi)羧酸酯酶活力的改變，可能是草地螟幼蟲對于非適宜寄主植物的一種適應(yīng)機(jī)制。

圖1 取食不同寄主植物后草地螟幼蟲體內(nèi)羧酸酯酶活力的時(shí)序變化

2．1．2 寄主植物對草地螟中腸谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶的影響

取食不同寄主植物對草地螟中腸谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶活力會(huì)產(chǎn)生顯著影響（圖2）。在取食時(shí)間較短時(shí)，取食藜的幼蟲中腸酶活力顯著高于取食其他寄主植物的酶活力，但是，隨著取食時(shí)間的延長，取食藜的幼蟲體內(nèi)谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶活力變化不大，但是取食另外4種寄主植物時(shí)幼蟲中腸的谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶活力具有非常顯著的變化，到24 h時(shí)取食5種不同寄主植物的中腸谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶活力已經(jīng)不再具有顯著差異。

圖2 取食不同寄主植物后草地螟幼蟲體內(nèi)谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶活力的時(shí)序變化

2．1．3 寄主植物對草地螟中腸乙酰膽堿酯酶的影響

取食不同寄主植物后草地螟幼蟲中腸的乙酰膽堿酯酶活力具有顯著差異（圖3）。在取食時(shí)間較短時(shí)（如6 h），草地螟幼蟲中腸乙酰膽堿酯酶活力無顯著差異。但是，隨著取食時(shí)間的延長，取食適宜寄主后中腸的乙酰膽堿酯酶活力增長顯著高于取食非適宜寄主植物后的中腸酶活力，取食96 h后，取食適宜寄主植物后的中腸乙酰膽堿酯酶活力比6 h時(shí)增加了6～8倍，而取食非適宜寄主植物時(shí)則酶活力變化不大，說明適宜寄主植物可以刺激幼蟲中腸內(nèi)乙酰膽堿酯酶活力。

圖3 取食寄主植物不同時(shí)間后草地螟幼蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活力的變化

由圖1～3可以看出，寄主植物對于幼蟲中腸的解毒酶影響顯著，取食適宜寄主植物時(shí)酶活力較高，但是隨著取食時(shí)間的延長，取食非適宜寄主植物的羧酸酯酶和谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶的酶活力也會(huì)逐漸增加，表明取食適宜寄主植物時(shí)可刺激草地螟幼蟲解毒酶活力立即升高，而非適宜寄主植物長時(shí)間的刺激可以引起部分解毒酶的快速增加。

2．2 不同寄主植物對草地螟幼蟲中腸保護(hù)酶的影響

2．2．1 寄主植物對草地螟中腸超氧化物歧化酶的影響

圖4顯示，取食初期（6、12、24 h），取食不同寄主植物的幼蟲中腸SOD活力差異顯著，其中取食藜、大豆和馬鈴薯時(shí)SOD活力較高。但是隨著取食時(shí)間的延長，酶活力不再具有顯著差異，表明不同寄主植物可以明顯刺激草地螟幼蟲中腸超氧化物歧化酶活力變化。

圖4 取食寄主植物不同時(shí)間后草地螟幼蟲體內(nèi)超氧化物歧化酶活力的變化

2．2．2 寄主植物對草地螟中腸過氧化氫酶的影響

圖5顯示，取食不同寄主植物對草地螟中腸CAT活力有一定影響，其中取食馬鈴薯48 h時(shí)酶活力較高，但是隨著取食時(shí)間的延長，取食不同寄主植物的CAT活力逐漸趨于一致。

圖5 取食寄主植物不同時(shí)間后草地螟幼蟲體內(nèi)過氧化氫酶活力的變化

2．2．3 寄主植物對草地螟中腸組織過氧化物酶的影響

取食不同寄主植物對草地螟中腸過氧化物酶產(chǎn)生一定的影響（圖6），除馬鈴薯之外，取食其他寄主植物隨取食時(shí)間的延長變化幅度不大。

圖6 取食寄主植物不同時(shí)間后草地螟幼蟲體內(nèi)組織過氧化物酶活力的變化

從圖4～6可以看出，盡管在取食初期不同寄主植物會(huì)對幼蟲中腸不同的保護(hù)酶產(chǎn)生影響，但是隨著取食時(shí)間的延長，取食不同寄主植物的草地螟其中腸保護(hù)酶活力趨于一致，相互間不再具有顯著差異。

3 討論

羧酸酯酶、谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿酯酶等是昆蟲體內(nèi)重要的解毒酶，對分解外源毒物、維持正常生理代謝起重要作用。其中谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶主要功能是催化某些內(nèi)源性或外來有害物質(zhì)的親電子基團(tuán)與還原型谷胱甘肽的巰基偶聯(lián)，增加其疏水性使其易于穿越細(xì)胞膜，分解后排出體外，從而達(dá)到解毒的目的［22］。已有研究表明，虎鳳蝶（Papilio glaucus）、月尾大蠶蛾（Actias l una）、棉蚜（Aphis gossypii）、小菜蛾（Pl utell a xylostella）、繡線菊蚜（Aphis citricol a）、棉鈴蟲（Helicover pa ar miger a）、南美斑潛蠅（Liriomyza huidobrensis）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）、豆莢野螟（Mar uca testulalis）、斜紋夜蛾（Spodoptera litur a）等昆蟲取食不同寄主植物時(shí)其體內(nèi)各種解毒酶活性也不同［10－17，23－25］。 本 文 研 究 結(jié) 果 亦 表 明 草 地 螟 幼 蟲 取食不同寄主植物對中腸解毒酶羧酸酯酶、谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿酯酶活性產(chǎn)生顯著影響。比較取食適宜寄主與非適宜寄主的幼蟲中腸解毒酶活性差異發(fā)現(xiàn)，其相互間酶活力不僅存在量的差異，而且存在質(zhì)的差異，相對而言，較短時(shí)間內(nèi)，取食適宜寄主植物時(shí)中腸解毒酶活力較高，但是隨著取食時(shí)間的延長，取食非適宜寄主的幼蟲中腸酶活力快速上升，96 h后酶活力可增加3～7倍，從而縮小取食不同寄主植物的幼蟲中腸解毒酶活力的差值。分析中腸解毒酶活力的這種適應(yīng)性變化，推測可能是由于草地螟老齡幼蟲取食量暴增，僅靠適宜寄主無法滿足種群生存的需要，因而需要擴(kuò)展取食范圍，不斷試探取食非適宜寄主，而非適宜寄主植物對中腸解毒酶系不斷產(chǎn)生刺激，在長期進(jìn)化過程中誘導(dǎo)其對非適宜寄主產(chǎn)生了適應(yīng)性，這種誘導(dǎo)是長期積累的結(jié)果，也需要一定時(shí)間的刺激才能獲得，所以草地螟幼蟲在取食非適宜寄主一定時(shí)間后酶活力會(huì)顯著升高。但是，由于不同寄主植物次生物質(zhì)種類和含量不同，所以刺激中腸產(chǎn)生的解毒酶含量和種類也不盡相同，從而幼蟲對不同寄主植物的適應(yīng)程度也各不相同，與原來的試驗(yàn)結(jié)果相符［8］。另外，非適宜寄主植物對中腸乙酰膽堿酯酶活力改變不大，表明寄主植物僅對部分中腸解毒酶具有明顯的刺激作用。總之，這是昆蟲在進(jìn)化過程中對食物代謝途徑的適應(yīng)性調(diào)整，另外可滿足解毒和節(jié)省能源兩種需要。

目前已有試驗(yàn)表明實(shí)驗(yàn)昆蟲體內(nèi)存在的過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）的活性和昆蟲對外界刺激物相應(yīng)強(qiáng)度的反應(yīng)有關(guān)［26－30］。超氧物歧化酶（SOD）雖然是生物細(xì)胞內(nèi)最重要的清除自由基的酶，但其清除O2而成H2O2后，H2O2與O2形成毒性更強(qiáng)的HO·必須由過氧化氫酶和過氧化物酶來分解H2O2，所以CAT和POD兩種酶在生命系統(tǒng)的保護(hù)作用上顯得更為重要。本文研究結(jié)果表明草地螟幼蟲取食不同寄主植物后對中腸保護(hù)酶SOD、CAT和POD活力均有一定影響，但是隨著取食時(shí)間的延長，不同處理之間酶活力不再具有顯著差異，推測可能是取食初期，草地螟幼蟲對于不同寄主植物的刺激產(chǎn)生了較強(qiáng)的反應(yīng)，所以酶活力變化較大，但是隨著取食時(shí)間的延長，幼蟲逐步適應(yīng)了不同的寄主植物從而酶活力也趨于較平穩(wěn)的狀態(tài)。草地螟幼蟲對于不同寄主植物的這種適應(yīng)性是其種群發(fā)展和延續(xù)的保證。

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