黃維佳 ，覃家錦 ，何 巍 ，戴 霞

(1.廣西壯族自治區(qū)柳州市人民醫(yī)院心胸外科，廣西 柳州 545001; 2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科，廣西 南寧 530021)

研究發(fā)現(xiàn)，活性氧(ROS)及氧化應(yīng)激在缺氧性肺動脈高壓和新生兒持續(xù)性肺動脈高壓的發(fā)病機(jī)制中有著重要的作用，但關(guān)于活性氧對其他類型肺動脈高壓的影響報(bào)道甚少。從理論上講，如果肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞活性氧的生成明顯減少，內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激得到緩解，或者肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生活性氧的還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶被抑制，就能達(dá)到緩解肺血管重構(gòu)和治療肺動脈高壓的目的。本研究中，擬用NADPH氧化酶抑制劑夾竹桃麻素(apocynin)干預(yù)左向右分流肺動脈高壓模型大鼠，觀察其對大鼠肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞NADPH氧化酶4(NOX4)表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響，探討夾竹桃麻素對左向右分流肺動脈高壓的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠，雄性，7周齡，體重180～200 g，廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。RM－6000型多通道生理記錄儀(日本);雙目顯微鏡(Olympus);電泳儀(美國Bio－Rad公司);Q550CW計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(德國Leica公司);凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio－Rad公司);2，7－二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH－DA)熒光探針(江蘇碧云天公司);夾竹桃麻素(美國Calbiochem公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

分組與給藥:將30只SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。分流給藥組于分流手術(shù)后第2天給予夾竹桃麻素0.2 g/kg灌胃，分流組于分流手術(shù)后第2天給予等體積的0.9%氯化鈉注射液灌胃，對照組開腹但不做分流，于手術(shù)后第2天給予等體積的0.9%氯化鈉注射液灌胃，3組均每日給藥1次，連續(xù)11周。3組大鼠均在實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件相同。

分流建立:取大鼠，以戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，取腹部正中切口，用棉簽游離后腹膜，顯露腹主動脈及下腔靜脈，于腹主動脈左腎動脈起始部下方及髂總動脈上方，分別用小動脈夾將腹主動脈夾閉，在腹主動脈左側(cè)壁擬切開處，用手術(shù)尖刀片劃出1 mm長的切口，通過該切口用20 G套管針以45度角穿透腹主動脈壁進(jìn)入相鄰下腔靜脈內(nèi)(以不刺破下腔靜脈對側(cè)管壁為度)。造成腹主動脈與下腔靜脈的瘺道后，拔出針頭，再用7－0線縫合腹主動脈壁切口。移走小動脈夾，觀察到大鼠下腔靜脈變粗、顏色由暗變紅，或下腔靜脈出現(xiàn)微弱搏動，提示分流存在。

平均肺動脈壓(mPAP)測定:于術(shù)后11周末處死大鼠，處死前均經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，分離右頸外靜脈，用聚乙烯導(dǎo)管經(jīng)右頸外靜脈進(jìn)行右心插管，導(dǎo)管另一端經(jīng)壓力換能器與多通道生理記錄儀連接并記錄mPAP。

肺小動脈HE染色:開胸取大鼠部分肺組織，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色。應(yīng)用Olympus雙目顯微鏡觀察染色情況，每只大鼠選取1張切片，每張切片中隨機(jī)選擇肺小動脈15條，使用Q550CW計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行血管形態(tài)計(jì)量，測量平均血管總面積(TA)和血管腔面積(IA)、管壁厚度(WT)、血管外徑(ED)，計(jì)算出血管管壁厚度占外徑的百分比(WT%)、管壁面積占血管總面積的百分比(WA%)，以此反映肺血管重建的程度。WT%=(2×WT/ED)×100%，WA%=(TAIA)/TA×100%。

肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)與鑒定:處死大鼠，完整取出大鼠肺動脈，按王琪等[1]介紹的方法分離、培養(yǎng)大鼠肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞，用第2～4代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。在倒置顯微鏡下觀察所培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，用免疫熒光法檢測所培養(yǎng)細(xì)胞中Ⅷ因子相關(guān)抗原的表達(dá)，以此鑒定是否為肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞。

肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞中活性氧水平測定:將培養(yǎng)的大鼠肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基洗2次，加5 mL無血清培養(yǎng)基和7 μL DCFH－DA到培養(yǎng)瓶中，在37℃下培養(yǎng)箱中孵育30 min，磷酸鹽緩沖液洗3次，用胰酶消化，加血清終止反應(yīng)，用無血清培養(yǎng)基洗2次，用3 mL無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。其中陽性對照組加陽性藥物rosup(試劑盒提供)3 μL，常溫下孵育1 h，磷酸鹽緩沖液洗2次，用流式細(xì)胞儀檢測每組細(xì)胞內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度。將未加DCFH－DA的陰性對照組的自發(fā)熒光值定為1，而其他各組的熒光值均為相對于陰性對照的比值。

大鼠肺動脈內(nèi)皮NOX4蛋白檢測:采用Western Blot法。傾去培養(yǎng)液，用4℃的磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞2次，加入預(yù)冷裂解液200 μL，冰上孵育20 min，收集細(xì)胞裂片及裂解緩沖液，于4℃下離心10 min，收集上清液，測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合后，100℃下煮沸5 min。將樣品放在10%的十二烷基硫酸鈉(SDS)－聚丙烯凝膠中電泳，后轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入NOX4抗體(1∶800)及β－actin抗體(1∶10 000)并常溫下過夜。以洗膜液洗膜3次后，加入二抗并作用1 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，并曝光于X光膠片上，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描并測定表達(dá)強(qiáng)度，以目的蛋白與β－actin的IOD值之比作為目的蛋白表達(dá)的相對水平，結(jié)果以IOD比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 平均肺動脈壓變化

結(jié)果見表1。與分流組比較，分流給藥組大鼠平均肺動脈壓明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 肺小動脈形態(tài)變化

結(jié)果見表1。HE染色顯示，與對照組比較，分流組、分流給藥組大鼠出現(xiàn)肺小動脈壁增厚、血管壁平滑肌細(xì)胞肥大增生、管壁面積增加、管腔狹窄等病理改變，但分流給藥組大鼠改變程度明顯較分流組輕;從表現(xiàn)肺血管重構(gòu)的指標(biāo)上看，分流給藥組較分流組肺血管重構(gòu)明顯改善(P＜0.05)。

2.3 肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞鑒定

倒置顯微鏡下可見，所培養(yǎng)細(xì)胞單層貼壁生長，呈鵝卵石樣排列;同時免疫熒光法檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)Ⅷ因子相關(guān)抗原(內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原是內(nèi)皮細(xì)胞所特有)陽性，胞內(nèi)可見綠色熒光，證實(shí)分離培養(yǎng)得到的細(xì)胞是肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞。

2.4 肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞中活性氧水平

結(jié)果見表1。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與分流組比較，分流給藥組大鼠肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞中活性氧的水平明顯降低(P ＜0.05)。

2.5 肺動脈內(nèi)皮中NOX4蛋白表達(dá)情況

結(jié)果見表1和圖1。與分流組比較，分流給藥組大鼠肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞中NOX4蛋白的表達(dá)雖有減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與對照組比較，分流給藥組、分流組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

圖1 肺動脈內(nèi)皮中NOX4蛋白表達(dá)情況

表1 各組大鼠mPAP，WT%，WA%，活性氧水平、IDO值比較(±s，n=10)

表1 各組大鼠mPAP，WT%，WA%，活性氧水平、IDO值比較(±s，n=10)

注:與分流給藥組比較，＊P ＜0.05。

對照組分流給藥組分流組15.9 ± 1.7 23.1 ± 2.4 31.2 ± 5.5＊10.1 ± 3.7 22.5 ± 2.2 35.3 ± 4.1＊22.4 ± 2.5 35.1 ± 2.8 5.12 ± 3.3＊1.9 ± 0.2 3.6 ± 0.7 5.8 ± 0.5＊0.31 ± 0.09 0.45 ± 0.07 0.52 ± 0.06

3 討論

活性氧是體內(nèi)一類含氧單電子還原產(chǎn)物的總稱，其造成的氧化應(yīng)激是許多心血管疾病的病理機(jī)制之一。越來越多的研究結(jié)果表明，內(nèi)皮素、轉(zhuǎn)化生長因子等細(xì)胞因子可以通過活性氧信號通路影響肺動脈的舒縮反應(yīng)和肺血管重塑過程，參與肺動脈高壓的形成[2－3]。因此，通過抑制NADPH氧化酶而阻斷活性氧產(chǎn)生[4]，或直接降低活性氧的水平，從而抑制肺血管平滑肌細(xì)胞的增殖，可能會成為治療肺動脈高壓的有效手段。

夾竹桃麻素即4－羥基－3－甲氧基－苯乙酮，最初從夾竹桃科植物中被提取，可降低肺血管通透性，減輕肺動脈壓力，降低體內(nèi)環(huán)氧化酶代謝產(chǎn)物濃度，改善體外循環(huán)(CPB)后的低氧血癥以及肺缺血－再灌注損傷導(dǎo)致的肺滲出性病變[5－7]。目前，對于夾竹桃麻素抗氧化應(yīng)激的具體機(jī)制，學(xué)者們有著不同的看法。Holland等[8]報(bào)道，夾竹桃麻素可能通過抑制NADPH氧化酶的組裝而影響其產(chǎn)生及活性，從而阻斷繼發(fā)的活性氧產(chǎn)生。而Vejrazka等[9]發(fā)現(xiàn)，夾竹桃麻素在吞噬細(xì)胞中以二聚體形式抑制NADPH氧化酶的作用，而在非吞噬細(xì)胞(如血管內(nèi)皮或平滑肌細(xì)胞)中則不具有抑制NADPH氧化酶的作用，在體外試驗(yàn)中甚至有刺激活性氧生成的作用。因此在血管系統(tǒng)中不應(yīng)該把夾竹桃麻素單純當(dāng)作NADPH氧化酶抑制劑。在本試驗(yàn)中，通過左向右分流肺動脈高壓大鼠模型，以主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的NOX4[10]和活性氧為觀察指標(biāo)進(jìn)行研究，結(jié)果證明，夾竹桃麻素是以抗氧化劑的形式直接影響肺動脈內(nèi)皮活性氧水平，產(chǎn)生緩解肺血管重構(gòu)及肺動脈高壓的作用，而對NADPH氧化酶的影響很小。此結(jié)論與Vejrazka等[9]的研究發(fā)現(xiàn)相似。筆者認(rèn)為，夾竹桃麻素通過清除高肺血流肺動脈高壓大鼠肺動脈內(nèi)皮中的活性氧，降低了肺血管內(nèi)氧化應(yīng)激的程度，進(jìn)而影響了活性氧在肺動脈高壓發(fā)病機(jī)制中的第二信使作用，可能阻斷了轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)的過度表達(dá)、磷脂肌醇信號途徑(PKC)激活、核轉(zhuǎn)錄因子NF－κB的激活等信號途徑，最終緩解了肺動脈平滑肌細(xì)胞的過度增殖及遷移，拮抗了肺血管重構(gòu)及肺動脈高壓的形成。

夾竹桃麻素作為一種抗氧化劑，能有效緩解大鼠左向右分流導(dǎo)致的肺血管重構(gòu)和肺動脈高壓形成，其通過影響活性氧水平來拮抗肺動脈高壓的具體信號途徑值得進(jìn)一步研究。

[1]王 琪，吳中立，鄭 尊，等.肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志，1991，13(1):31－34.

[2]Fike CD，Slaughter JC，Kaplowitz MR，et al.Reactive oxygen species from NADPH oxidase contribute to altered pulmonary vascular responses in piglets with chronic hypoxia－induced pulmonary hypertension[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，295(5):L881－L888.

[3]Clempus RE，Griendling KK.Reactive oxygen species signaling in vascular smooth muscle cells[J].Cardiovasc Res，2006，71(2):216－225.

[4]Shaw S，Wang X，Redd H，et al.High glucose augments the angiotensin Ⅱ－induced activation of JAK2 in vascular smooth muscle cells via the polyol pathway[J].J Biol Chem，2003，278(33):30 634－30 641.

[5]Dodd－oJM，Pearse DB.Effect of NADPH oxidase inhibitor apocynin on ischemia－reperfusion lung injury[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2000，279(1):H303－H312.

[6]Dodd－o JM，Welsh LE，Salazar JD，et al.Effect of NADPH oxidase inhibition on cardiopulmonary bypass－induced lung injury[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004，287(2):H927－H936.

[7]Pearse DB，Dodd－oJM.Ischemia－reperfusion lung injury is prevented by apocynin，a novel inhibitor of leukocyte NADPH oxidase[J].Chest，1999，116:55－56.

[8]Holland JA，Meyer JW，Schmitt ME，et al.Low－density lipoprotein stimulated peroxide production and endocytosis in cultured human endothelial cells:mechanisms of action[J].Endothelium，1997，5(3):191－207.

[9]Vejrazka M，Micek R，Stipek S.Apocynin inhibits NADPH oxidase in phagocytes but stimulates ROS production in non－phagocytic cells[J].Biochim Biophys Acta，2005，1 722(2):143－147.

[10]Geiszt M，Kopp JB，Varnai P，et a1.Identification of Renox，an NADPH oxidase in kidney[J].Proc Natl Acad Sic USA，2000，97(14):8 010－8 014.