曲春鶴，何付麗,，劉培福，紀(jì)明山，趙長(zhǎng)山*，高黎力

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽 110161；3.黑龍江省農(nóng)藥管理檢定站 哈爾濱 150090）

由于蔬菜栽培面積不斷增加，加之高密度栽培、長(zhǎng)期連作，致使土傳病害發(fā)生越來越嚴(yán)重。由 腐 皮 鐮 孢 菌（Fusarium.solani（Mart.）App.et Wollenw）侵染引起的辣椒根腐病是一種典型土傳病害，部分地區(qū)由于該病的危害，輕者辣椒減產(chǎn)20%～30%，重者達(dá)50%以上甚至絕產(chǎn)[1-2]。目前對(duì)土傳病害主要防治方法是殺菌譜廣、見效快的化學(xué)藥劑防治，但病原菌極易對(duì)其產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致化學(xué)農(nóng)藥施用量不斷增加，造成農(nóng)藥殘留量增大、生態(tài)平衡易被破壞，威脅人類健康和安全[3-5]。因此，尋找新藥劑或更有效的途徑防治土傳病害尤為重要。篩選對(duì)病原菌有拮抗作用的細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物，是采用生物防治手段控制土傳病害的有效途徑，國內(nèi)外學(xué)者致力于生防微生物篩選[6-8]及其產(chǎn)物研究[9-11]。然而，不當(dāng)?shù)姆蛛x篩選方法會(huì)帶來巨大的工作量[12]，且篩選菌株應(yīng)用到田間防病效果差甚至無效[13-15]。

本文采用平板對(duì)峙試驗(yàn)-胚根試驗(yàn)-盆栽試驗(yàn)系統(tǒng)篩選方法，以F.solani為指示菌，從辣椒根際土壤中篩選拮抗細(xì)菌，選取其中一株拮抗細(xì)菌研究其對(duì)多種病原真菌的抑菌效果及其對(duì)辣椒的促生作用，并研究其生物學(xué)特性及分類學(xué)地位。以期為快速、有效從土壤中篩選拮抗細(xì)菌提供研究方法，并為該菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

辣椒根腐病菌（F.solani），由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室提供；大豆疫病菌（Phytophthora sojae）、大豆菌核病菌（Sclerotinia sclerotinorum），由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所提供；黃瓜枯萎病菌（F.oxysporum）、黃瓜立枯病菌（Rhizoctonia solani）、小麥根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）、棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae），由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供；水稻惡苗病菌（F.moniliforme），由黑龍江省八一農(nóng)墾大學(xué)提供。

1.1.2 供試土壤

辣椒根際土壤，采自黑龍江省哈爾濱、牡丹江、肇東辣椒主要種植區(qū)。

1.1.3 供試培養(yǎng)基及試劑

①PDA培養(yǎng)基：用于病原真菌培養(yǎng)、細(xì)菌分離。馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000mL，pH自然；

②NA培養(yǎng)基：用于細(xì)菌純化、培養(yǎng)。牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000mL，pH 7.0～7.2；

③NB培養(yǎng)基：用于細(xì)菌培養(yǎng)。牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl5 g，蒸餾水1000mL，pH 7.0～7.2；

④LB培養(yǎng)基：用于細(xì)菌培養(yǎng)。胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g。NaCl 10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.2。

⑤谷子：在胚根試驗(yàn)、盆栽試驗(yàn)中用于培養(yǎng)病原真菌。

⑥Ringer's溶液：用于配置拮抗細(xì)菌懸浮液。NaCl 6.5 g，NaHCO30.2 g，KCl 0.14 g，NaH2PO40.01 g，CaCl20.12 g，蒸餾水1000mL。

1.2 方法

采用直接分離法從辣椒根際土壤中分離細(xì)菌；平板對(duì)峙-胚根試驗(yàn)-盆栽試驗(yàn)系統(tǒng)篩選方法篩選拮抗細(xì)菌。

1.2.1 土壤中拮抗細(xì)菌的分離

采用直接分離法，將病原菌（F.solani）孢子懸浮液與土壤懸浮液各0.1mL涂布在PDA平板上，適溫培養(yǎng)。待細(xì)菌菌落與病原菌長(zhǎng)出，觀察細(xì)菌菌落周圍是否產(chǎn)生抑菌圈，挑選產(chǎn)生抑菌圈的細(xì)菌分離、純化，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗細(xì)菌的篩選

采用平板對(duì)峙試驗(yàn)初步篩選拮抗細(xì)菌[16]。

經(jīng)煮熟滅菌的谷子作為病原菌（F.solani）的培養(yǎng)基，接種培養(yǎng)后備用。

采用盆栽試驗(yàn)篩選拮抗細(xì)菌，辣椒育苗至4對(duì)真葉，移栽。處理組：在蛭石中混拌接種病原菌（F.solani）的谷子，每盆加入20mL拮抗菌菌懸液（108cfu·mL-1）。對(duì)照組：（a）盆栽混入接種病原菌（F.solani）的谷子，（b）盆栽混入無菌谷子；對(duì)照每缽加入20mL釋釋4倍的無菌Ringer's溶液。每處理5次重復(fù)。4周后，調(diào)查辣椒發(fā)病情況。

根據(jù)0～9級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算辣椒根腐病病情指數(shù)[17]，評(píng)價(jià)病害嚴(yán)重度。0級(jí)-無??；1級(jí)-根系稍有變色；3級(jí)-根系明顯變褐；5級(jí)-變色根系占全部根系的30.1%～50%，植株萎蔫；7級(jí)-變色根系占全部根系的50.1%～80%，植株明顯萎蔫；9級(jí)-全株死亡。

1.2.3 拮抗細(xì)菌對(duì)病原真菌生長(zhǎng)的影響

采用平板對(duì)峙法，以土傳病害病原真菌大豆疫病菌（Phytophthora sojae）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、黃瓜立枯病菌（Rhizoctonia solani）、小麥根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）、大豆菌核病菌（Sclerotinia sclerotinorum）、棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae）、水稻惡苗病菌（Fusarium moniliforme）、辣椒根腐病菌（Fusarium.solani）作為指示菌，接種至PDA平板中央，在病原菌周圍等距離三點(diǎn)接種拮抗細(xì)菌。測(cè)定拮抗細(xì)菌D221對(duì)以上病原真菌的抑菌作用。計(jì)算抑制率。

式中，r-病原菌菌落中心至拮抗細(xì)菌菌落方向的病原菌菌帶寬度（cm），R-反方向的病原菌菌帶最大寬度（cm）。

1.2.4 拮抗細(xì)菌對(duì)辣椒促生作用的研究

辣椒種子消毒、浸種，催芽至露白，擺放培養(yǎng)皿中，加入拮抗細(xì)菌懸浮液（108cfu·mL-1）。對(duì)照每皿加入等量稀釋4倍的無菌Ringer's溶液。每個(gè)處理5次重復(fù)。28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d，測(cè)量辣椒胚根長(zhǎng)度，計(jì)算增長(zhǎng)率。

我記得在那天的開學(xué)典禮上，時(shí)任北大副校長(zhǎng)的岳素蘭教授發(fā)表了致辭，囑咐我們珍惜在北大的學(xué)習(xí)機(jī)會(huì)，努力提高自己，在工作中學(xué)以致用，更好地為北大、為社會(huì)服務(wù)。

1.2.5 拮抗細(xì)菌的鑒定

拮抗細(xì)菌菌株參照錢存柔等[18]，車秀珠等[19]方法進(jìn)行革蘭氏染色、芽胞染色，在顯微鏡下作菌體形態(tài)觀察和描述；進(jìn)行硝酸鹽還原試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵、淀粉水解、明膠液化及甲基紅試驗(yàn)等生理生化鑒定。

以拮抗細(xì)菌的LB培養(yǎng)液，采用天根公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱式DP302-02）提取基因組DNA。以引物（KO15'AGAGTTTGATCM TGGCTCAG 3'，KO25'TACGGYTACCTTGTTACG ACTT 3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。16S rDNA測(cè)序工作由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司完成，通過NCBI的BLAST程序進(jìn)行比對(duì)（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。采用Mega 4.1軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)處理采用DPS 10.15企業(yè)版軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌的篩選結(jié)果

從辣椒根際土壤直接分離得到105株能夠產(chǎn)生抑菌圈的細(xì)菌，純化后由平板對(duì)峙試驗(yàn)篩選得到明顯抑制病原菌（F.solani）生長(zhǎng)的23株細(xì)菌。進(jìn)一步采用胚根試驗(yàn)篩選得到11株細(xì)菌，經(jīng)處理的辣椒胚根發(fā)病程度均較低，最低發(fā)病率為25%，明顯低于病原菌處理的發(fā)病率（100%）。

11株拮抗細(xì)菌進(jìn)一步進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。結(jié)果表明，只接種病原菌（F.solani）的辣椒植株生長(zhǎng)明顯受到抑制，且須根全部腐爛，莖基部及主根上也有明顯褐色病斑，發(fā)病嚴(yán)重的植株死亡。與只接種病原菌（F.solani）的對(duì)照比較，分別經(jīng)拮抗細(xì)菌D221、II621、15-1-1、19-2-3處理的辣椒植株在試驗(yàn)中發(fā)病程度較低，植株根部未發(fā)病或發(fā)病較輕，生長(zhǎng)并未受到明顯的抑制作用（見表1）。

表1 盆栽試驗(yàn)篩選拮抗細(xì)菌Table1 Screening antagonistic bacteria with pot experiment

由表1可知，拮抗細(xì)菌D221、II621、15-1-1、19-2-3對(duì)辣椒根腐病的防治效果分別達(dá)到70.33%、69.19%、68.43%和76.01%，即該4株拮抗細(xì)菌均能明顯抑制辣椒根腐病菌對(duì)辣椒的侵染，并顯著降低病害發(fā)生程度。

2.2 拮抗細(xì)菌D221對(duì)病原真菌的抑制作用

從篩選結(jié)果中選取菌株D221進(jìn)行研究。采用平板對(duì)峙法，測(cè)定其對(duì)多種病原真菌的抑菌作用，結(jié)果如表2所示，拮抗細(xì)菌D221對(duì)供試的病原真菌抑制率均在50%以上，并產(chǎn)生明顯的抑菌帶，其中對(duì)大豆疫病病原菌的抑制率達(dá)67.26%。

表2 拮抗細(xì)菌D221對(duì)病原真菌的抑菌作用Table 2 Inhibition of strain D221 against different pathogens

2.3 拮抗細(xì)菌D221對(duì)辣椒胚根的促生作用

結(jié)果如表3所示，經(jīng)過拮抗細(xì)菌D221處理的辣椒胚根顯著伸長(zhǎng)，與對(duì)照比較，增長(zhǎng)34.33%，表明拮抗細(xì)菌D221對(duì)辣椒胚根具有明顯促進(jìn)伸長(zhǎng)的作用。

表3 拮抗細(xì)菌D221對(duì)辣椒胚根的促生作用Table 3 Promotion of strain D221 to pepper radicle

2.4 拮抗細(xì)菌D221的鑒定

結(jié)果見表4。

表4 菌株D221的生理生化特征Table 4 Physiological and biochemical characters of strain D221

細(xì)菌D221菌落形態(tài)乳白色，不透明，表面不光滑，菌落上有褶皺、突起，不產(chǎn)生色素。芽胞橢圓形。經(jīng)生化鑒定為革蘭氏陽性菌。具體生理生化指標(biāo)見表4。

根據(jù)文獻(xiàn)[19-20]綜合分析菌株D221形態(tài)特征及生理生化特征，初步鑒定菌株D221為芽胞桿菌屬的枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）。

將菌株D221的16S rDNA全序列在NCBI上通過BLAST程序進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明，與菌株D221核苷酸序列相似性較高的菌株主要是枯草芽胞桿菌（Bacillus stubtilis）、解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、Bacillus velezensis以及一些未確定的芽胞桿菌（Bacillus sp.）等。選取與菌株D221的16S rDNA序列相似性較大的菌株，通過Mega 4.1進(jìn)行多序比對(duì)，建立系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖1）。

圖1 菌株D22116S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖Fig.1 Phylogenetic tree of strain D221 by 16S rDNA sequence

進(jìn)一步確定其分類學(xué)地位為枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）。菌株D221的序列已在GenBank中注冊(cè)，序列號(hào)為JF495161。

3 討論與結(jié)論

通過直接分離方法從辣椒根際土壤中分離得到105株細(xì)菌，經(jīng)平板對(duì)峙試驗(yàn)-胚根試驗(yàn)-盆栽試驗(yàn)系統(tǒng)篩選方法，篩選得到4株對(duì)病原菌（F.solani）生長(zhǎng)有明顯抑制作用、能顯著降低辣椒根腐病發(fā)病程度的拮抗細(xì)菌，分別命名為菌株D221、II621、15-1-1、19-2-3。

菌株D221對(duì)供試病原真菌均有明顯的抑制作用；能夠顯著促進(jìn)辣椒胚根伸長(zhǎng)，胚根增長(zhǎng)34.33%。經(jīng)形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA同源性比較分析，將菌株D221鑒定為枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）。

目前關(guān)于土壤中拮抗細(xì)菌的分離篩選多采用稀釋平板法[21]及平板對(duì)峙法。采用稀釋平板法分離細(xì)菌，由于土壤懸浮液涂布平板培養(yǎng)后挑取菌落時(shí)缺乏針對(duì)性，分離得到大量細(xì)菌菌株，為進(jìn)一步篩選帶來巨大的工作量。平板對(duì)峙法是一種實(shí)驗(yàn)室無菌操作的離體試驗(yàn)，僅通過該方法篩選拮抗細(xì)菌，選取平板上抑菌作用最好的菌株作為篩選結(jié)果，由此得到的菌株在田間實(shí)際應(yīng)用防病作用不明顯，甚至無效[14-15,22-23]，或漏篩某些防病效果穩(wěn)定、高效的菌株[24]。研究表明，環(huán)境條件（土壤類型、土壤質(zhì)地、土壤溫度、土壤濕度、pH等理化性質(zhì)，氣溫、光照及降雨量等）及土壤中微生物種群甚至作物種類等，均會(huì)影響拮抗細(xì)菌的定殖能力、生存繁殖能力、存活率、與病原菌競(jìng)爭(zhēng)的能力或抗菌物質(zhì)產(chǎn)生的能力而影響其防治效果。因此，分離篩選方法的選擇與建立應(yīng)全面考慮寄主、拮抗細(xì)菌、病原菌及環(huán)境之間的相互作用，針對(duì)性強(qiáng)、相對(duì)簡(jiǎn)化。本研究采用直接分離法從辣椒根際土壤中分離細(xì)菌，針對(duì)性強(qiáng)，減少了分離及進(jìn)一步篩選的工作量。應(yīng)用平板對(duì)峙試驗(yàn)-胚根試驗(yàn)-盆栽試驗(yàn)系統(tǒng)篩選方法，首先由平板對(duì)峙試驗(yàn)篩選對(duì)病原菌具有一定拮抗作用的23株細(xì)菌；將以上菌株進(jìn)行胚根試驗(yàn)，得到能夠顯著控制胚根發(fā)病的11株拮抗細(xì)菌，雖然辣椒胚根易感病，不易操作，但能夠初步指示待選菌株是否具有防病作用，為下階段的盆栽試驗(yàn)節(jié)省工作量；進(jìn)一步進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，篩選得到4株拮抗細(xì)菌能夠有效防治辣椒根腐病，盆栽篩選試驗(yàn)中防效最高的菌株19-2-3在平板對(duì)峙試驗(yàn)中的抑菌測(cè)定結(jié)果并不是最好，表明平板對(duì)峙試驗(yàn)僅能證明離體試驗(yàn)條件下的抑菌作用，并不代表實(shí)際應(yīng)用的防病效果；盆栽試驗(yàn)處理與實(shí)際應(yīng)用條件相近，篩選的菌株在田間應(yīng)用效果更穩(wěn)定。該系統(tǒng)的篩選方法充分考慮了寄主植物、拮抗細(xì)菌、病原菌及環(huán)境之間的相互作用，逐步進(jìn)行，能夠更加準(zhǔn)確的篩選拮抗細(xì)菌，并使菌株更具有田間實(shí)際應(yīng)用價(jià)值；菌株19-2-3在平板對(duì)峙試驗(yàn)及盆栽試驗(yàn)中表現(xiàn)不一致，其實(shí)際應(yīng)用的適應(yīng)性更強(qiáng)或產(chǎn)生更有效的抑菌物質(zhì)提高其防病效果，此問題有待進(jìn)一步研究。

為有效合理利用菌株D221控制病害，有必要深入研究其在田間實(shí)際應(yīng)用效果、抑菌防病機(jī)理，以及與其他生防因子的復(fù)配，進(jìn)一步提高抑菌效價(jià)，為其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用及對(duì)土傳病害的有效生物防治奠定研究基礎(chǔ)。

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