朱紅霞，胡利宗，鄧小莉*，藺 芳

（1.新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)系，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.中國(guó)科學(xué)院遺傳發(fā)育所，北京 100101；3.中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京 100039）

轉(zhuǎn)錄因子是參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的一類(lèi)蛋白因子，通過(guò)與啟動(dòng)子區(qū)域的順式元件相互作用，能夠激活或者抑制多個(gè)下游基因表達(dá)[1]。SBP基因家族是植物所特有的重要轉(zhuǎn)錄因子，屬于一類(lèi)鋅指蛋白，由多個(gè)成員組成，主要參與植物生長(zhǎng)、發(fā)育以及多種生理生化過(guò)程[2]。自首次在金魚(yú)草（Antirrhinum majus）中發(fā)現(xiàn)SBP基因[3]以來(lái)，在擬南芥[4]、水稻[5]、葡萄[6]和白樺樹(shù)[7]等植物物種中均發(fā)現(xiàn)該基因家族成員。就模式植物而言，擬南芥SPL3基因在花和葉片中高度表達(dá)[8]；擬南芥SPL8很可能參與花粉發(fā)育的調(diào)控[9]；擬南芥SPL3、SPL4和SPL5中具有microRNA156的調(diào)控位點(diǎn)[10-11]。此外，玉米SBP轉(zhuǎn)錄因子Liguleless1（LG1）能夠影響舌葉和葉耳的發(fā)育，具體表現(xiàn)為其缺失突變體不能形成舌葉和葉耳[12]。白樺BpSPL1基因通過(guò)特異結(jié)合BpMADS5啟動(dòng)子參與花發(fā)育過(guò)程[7]。

隨著模式植物和一些重要農(nóng)作物基因組數(shù)據(jù)的快速積累，生物信息學(xué)方法已經(jīng)成為剖析基因家族序列特征和進(jìn)化關(guān)系的有效手段，例如大白菜乙烯受體和大豆SBP蛋白家族的研究[13-14]。盡管朱命喜等已對(duì)大豆SBP基因家族的成員數(shù)目、啟動(dòng)子及保守結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，但大豆SBP基因家族的保守基序、功能結(jié)構(gòu)域以及表達(dá)情況仍未見(jiàn)報(bào)道。本文挖掘到大豆SBP基因家族的49個(gè)成員，并分析各成員基因結(jié)構(gòu)、染色體定位、蛋白保守序列、亞細(xì)胞定位、表達(dá)情況及親緣進(jìn)化關(guān)系。為大豆SBP基因結(jié)構(gòu)和功能分析提供參考信息，并為闡明SBP基因家族在大豆生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)控作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 SBP基因序列檢索及分析

為收集擬南芥、水稻和大豆3個(gè)物種基因組中所有的SBP基因，利用SBP結(jié)構(gòu)域的一致性序列，通過(guò)BLAST對(duì)擬南芥基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR（http://www.arabidopsis.org/），水稻基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)TIGR（http://rice.plantbiology.msu.edu/）和JGI大豆基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.phytozome.net/search.php?show=blast&method=Org_Gmax）進(jìn)行搜索。利用Pfam工具對(duì)候選蛋白質(zhì)序列進(jìn)行檢索[15]，若存在SBP結(jié)構(gòu)域，則將其作為該蛋白質(zhì)家族成員。針對(duì)鑒定得到的SBP基因，按照下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類(lèi)：如果SBP基因位于不同基因座位時(shí)，該基因被認(rèn)為是1個(gè)成員；同一基因座位的多個(gè)剪接體被認(rèn)為是1個(gè)成員，選擇最長(zhǎng)剪接體為代表。基于已知大豆SBP基因的DNA序列，利用BLAST在線工具和Phytozome提供的基因相關(guān)信息確定其染色體定位（http://www.phytozome.net/cgi-bin/gbrowse/soybean/）。此外，為闡明SBP基因家族擴(kuò)增模式，本研究檢索PGDD數(shù)據(jù)庫(kù)（http://chibba.agtec.uga.edu/duplication/）中所有SBP同源基因?qū)Α?/p>

1.2 蛋白保守基序與亞細(xì)胞定位

利用MEME工具對(duì)大豆SBP蛋白的保守基序進(jìn)行分析[16]。參數(shù)設(shè)置如下：同一基序在一條序列中出現(xiàn)的次數(shù)為0或者1，基序長(zhǎng)度范圍10～300個(gè)氨基酸殘基，基序最大發(fā)現(xiàn)數(shù)目5個(gè)，其他參數(shù)為默認(rèn)值。利用PROlocalizer在線服務(wù)器對(duì)大豆SBP蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位進(jìn)行預(yù)測(cè)[17]。

1.3 基因組織表達(dá)譜分析

表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequence tag，EST）為在mRNA水平上研究目的基因表達(dá)提供有效工具。通過(guò)對(duì)不同數(shù)據(jù)庫(kù)中目的基因?qū)?yīng)的EST或cDNA出現(xiàn)頻率可了解其組織特異性表達(dá)情況[18]。針對(duì)有對(duì)應(yīng)UniGene的SBP基因，對(duì)其不同組織來(lái)源的EST數(shù)目進(jìn)行數(shù)字化表示，具體情況如下：EST數(shù)目小于25條的記為1；EST數(shù)目在25～50 范圍內(nèi)的記為 2；同理，50～100、100～200、200～500、500～1 000、大于1 000分別記為3、4、5、6、7、8。最后，對(duì)SBP基因EST數(shù)字化處理后的矩陣進(jìn)行聚類(lèi)分析，以此來(lái)表示其基因組織表達(dá)譜。

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

由于擬南芥、水稻和大豆等物種SBP蛋白的氨基酸序列具有高度保守的功能結(jié)構(gòu)域，因此，可以進(jìn)行多序列的比對(duì)和構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，用于研究它們的差異以及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。SBP蛋白序列多重比對(duì)由Clustal X軟件完成，參數(shù)為默認(rèn)值[19]。采用鄰接法（Neighbor-Joining Method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)[20]，其輸出借助于MEGA軟件完成[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆SBP基因的鑒定與分析

結(jié)合BLAST和HMMER搜索方法，加上Pfam工具鑒定，最終在大豆基因組中鑒定出49個(gè)SBP基因，分別命名為GmSBP1～49（見(jiàn)表1）。從表1可以看出，大豆SBP基因家族可分為兩類(lèi)：一類(lèi)為有內(nèi)含子的SBP基因，例如GmSBP1～3、GmSBP5～21、GmSBP23、GmSBP26～38、GmSBP40～42和GmSBP44～49等，另外一類(lèi)為沒(méi)有內(nèi)含子，包括GmSBP21和GmSBP42。外顯子數(shù)目分析顯示：該基因家族外顯子數(shù)目具有較大變化，即由1～14個(gè)外顯子組成。其中外顯子最少的基因?yàn)镚mSBP21和GmSBP42，僅有1個(gè)外顯子；最多的是GmSBP43，為14個(gè)外顯子；大多數(shù)基因含有2～4個(gè)外顯子。

表1 大豆SBP基因家族信息Table1 Information of SBP-domain gene family in soybean(Glycine max)

續(xù)表

表1顯示大豆SBP基因家族成員在染色體上的位置和分布情況。從表1可以看出，除第14條染色體以外，SBP基因錨定于所有染色體上，幾乎呈均勻分布情況。就基因數(shù)目而言，第7和13號(hào)染色體上SBP數(shù)目最多，為5個(gè)成員；第8、9、10和20號(hào)染色體上SBP基因數(shù)目最少，為1個(gè)成員；其余染色體上有SBP基因2～4個(gè)成員。此外，第13號(hào)染色體上的5個(gè)SBP基因分布極不均勻，主要集中分布在27.9～38.3 Mb之間。共線性分析顯示，在SBP基因家族中，有16對(duì)基因具有較高的微共線性（見(jiàn)表2）。這充分說(shuō)明大豆在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷多次多倍化過(guò)程，此外，多倍化產(chǎn)生的SBP基因已經(jīng)被保留下來(lái)，并以同源基因?qū)π问酱嬖凇?/p>

2.2 蛋白序列特征與亞細(xì)胞定位

保守基序分析顯示：大豆SBP蛋白具有5個(gè)保守基序，這5個(gè)保守基序通過(guò)不同組合方式最終形成6種組織模式，不同組織模式所占比例不同（見(jiàn)圖1A和表3）。從圖1B可以看出，基序組織模式4占比例最大，約為55%，該模式包含基序1、2和5，線性排列順序?yàn)镸otif5-Motif1-Motif2；此外，其他5種基序組織模式，有3種是在模式4基礎(chǔ)上丟失特定的保守基序形成，而有兩種是在模式4基礎(chǔ)上獲得特定的保守基序形成。結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明：絕大多數(shù)SBP蛋白包括完整的功能結(jié)構(gòu)域，但也有的成員具有不完整的SBP結(jié)構(gòu)域，例如GmSBP3、GmSBP27和GmSBP42等（見(jiàn)圖2和表3）。蛋白保守基序與功能結(jié)構(gòu)域的比較分析顯示，保守基序1、2、5和功能結(jié)構(gòu)域相互重疊?；蚰Ｊ?、2和3不具有完整的SBP保守結(jié)構(gòu)域，這意味著它們很可能喪失功能結(jié)構(gòu)域活性，最終功能發(fā)生變化。同理可知，獲得新基序的組織模式5和6很可能增加該家族所不具有的新功能。此外，利用 PROlocalizer（http://bioinf.uta.fi/PROlocalizer/）在線工具對(duì)大豆SBP蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示：GmSBP38和GmSBP43都定位于質(zhì)膜；GmSBP23、GmSBP43和GmSBP6分別被定位于核、葉綠體與基質(zhì)中；GmSBP2和GmSBP3定位于線粒體中；GmSBP4、GmSBP8、GmSBP10和GmSBP20等9個(gè)蛋白定位于高爾基體（見(jiàn)表1）。盡管大約67.3%的SBP蛋白不能確定其亞細(xì)胞的定位情況，但不難看出，SBP蛋白定位于多個(gè)細(xì)胞器，這就意味著其功能具有多樣性。

表2 大豆SBP同源基因?qū)able2 Homologous pairs found in the SBP gene family of soybean

圖1 大豆SBP蛋白保守基序的組織結(jié)構(gòu)模式(A)和比例(B)Fig.1 Organization pattern(A)and ratio(B)for conserved motifs and phylogenic tree of SBP-domain gene family in soybean

2.3 大豆SBP基因組織表達(dá)譜

基于EST數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)數(shù)目，可以推測(cè)基因組織特異性表達(dá)。在EST數(shù)據(jù)庫(kù)中GmSBP2、GmSBP-11、GmSBP16、GmSBP26、GmSBP27 和 GmSBP28沒(méi)有相應(yīng)的EST序列發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明這些基因很可能沒(méi)有轉(zhuǎn)錄活性，以假基因形式存在于大豆基因組中；GmSBP24、GmSBP39，GmSBP32、GmSBP34和GmSBP37雖然能夠找到相應(yīng)的EST序列，但是并不能確定這些EST序列來(lái)源于哪種類(lèi)型的組織，故這些EST數(shù)據(jù)只能說(shuō)明它們有轉(zhuǎn)錄活性。此外，對(duì)剩余的大豆SBP基因組織電子表達(dá)譜進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可看出，GmSBP46是一種組成型表達(dá)基因，在子葉、上胚軸、花、下胚軸、葉子、分生組織、豆莢、根、種皮、體細(xì)胞胚、莖和芽中均表達(dá)，并且表達(dá)量較高；GmSBP41在葉片中特異表達(dá)；GmSBP1、GmSBP3、GmSBP5和GmSBP15等在分生組織中特異性表達(dá)；GmSBP-13、GmSBP21和GmSBP44在根中特異表達(dá)；GmSBP17、GmSBP30和GmSBP31等基因在果莢中特異表達(dá)；此外，多數(shù)SBP基因都可以在多個(gè)組織中表達(dá)，表現(xiàn)出多樣化的組織表達(dá)譜（見(jiàn)圖3）。

表3 大豆SBP蛋白的保守基序Table3 Conserved motif found in the SBP protein of soybean

圖2 大豆SBP蛋白的功能結(jié)構(gòu)域Fig.2 Functional domain of the SBP proteins in soybean(Glycine max)

圖3 大豆SBP基因家族成員的表達(dá)譜Fig.3 Expression pattern of members of SBP-domain gene family in soybean

2.4 SBP基因的進(jìn)化分析

根據(jù)方法中提供的步驟，分別從擬南芥和水稻基因組中分離到18和25個(gè)SBP基因，與以往報(bào)道的相一致[22-23]。為揭示SBP基因家族成員間的親緣關(guān)系，18個(gè)擬南芥SBP蛋白、25個(gè)水稻SBP蛋白與49個(gè)大豆SBP蛋白用于該蛋白的系統(tǒng)發(fā)生分析。以支持率15%為閥值，3個(gè)物種的SBP蛋白被劃分為8個(gè)類(lèi)群即A、B、C、D、E、F、G和H類(lèi)群。從進(jìn)化樹(shù)可以看出：水稻的一個(gè)SBP蛋白屬于孤兒基因，單獨(dú)形成一個(gè)分支；大豆的4個(gè)SBP基因落入類(lèi)群外，以基因?qū)π问絾为?dú)形成進(jìn)化支；F類(lèi)群成員數(shù)目少，僅包括1個(gè)水稻SBP蛋白和2個(gè)大豆SBP蛋白；其他類(lèi)群由擬南芥、水稻和大豆SBP蛋白共同組成（見(jiàn)圖4）。進(jìn)化樹(shù)末端同一分支的兩個(gè)外部結(jié)點(diǎn)，很可能就是親緣關(guān)系比較近的同源基因?qū)?。進(jìn)化樹(shù)末端分析顯示：5對(duì)擬南芥/大豆SBP蛋白位于系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的同一分支，4對(duì)水稻/大豆SBP蛋白位于系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的同一分支，3對(duì)擬南芥/水稻SBP蛋白處于進(jìn)化樹(shù)的同一分支，這說(shuō)明該基因家族的祖先基因起源于3個(gè)物種分化之前。此外，大豆中有15對(duì)SBP基因位于系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的同一分支，而擬南芥和水稻分別有3和4對(duì)SBP基因處于同一進(jìn)化分支中，這充分說(shuō)明，大豆物種形成后SBP基因發(fā)生了多次重復(fù)事件。

3 討論

利用BLAST和HMMER工具，在全基因組水平對(duì)SBP基因進(jìn)行挖掘。利用Pfam和MEME工具進(jìn)行過(guò)濾，最終在擬南芥、水稻和大豆中分別得到18、25和49個(gè)SBP基因。前人研究揭示擬南芥、水稻和大豆中分別有16、20、44個(gè)SBP基因[13,22-23]。兩者比較顯示，本文鑒定的SBP基因較多。與擬南芥和水稻相比，大豆基因組中有更多SBP基因，說(shuō)明大豆SBP基因家族經(jīng)歷更為復(fù)雜的擴(kuò)增、丟失以及進(jìn)化過(guò)程。朱命喜等從PlnTFDB，PlantTFDB，RiceTFDB直接下載并篩選44個(gè)大豆SBP基因，詳細(xì)分析該家族成員啟動(dòng)子序列特征，并認(rèn)為該轉(zhuǎn)錄因子家族參與生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫響應(yīng)、激素應(yīng)答、抗霉菌應(yīng)答、光合作用等調(diào)控過(guò)程。此外，對(duì)個(gè)別SBP蛋白還進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模建[13]。但大豆SBP基因的保守基序模式、共線性、表達(dá)譜和亞細(xì)胞定位等問(wèn)題仍然沒(méi)有被闡明，本研究填補(bǔ)大豆SBP基因這些方面的空白。大豆是典型的古四倍體植物，其基因組在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)過(guò)加倍的過(guò)程，所以很多基因在大豆基因組中都是以多拷貝形式存在。Schmutz等研究結(jié)果顯示，在59和13MYA前，大豆分別發(fā)生2次全基因組重復(fù)事件，這也支持基因是以多拷貝形式存在的觀點(diǎn)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)多拷貝的SBP基因散落分布于不同染色體上。微共線性角度分析表明，在大豆基因組中存在16對(duì)SBP旁系同源基因，這為大豆全基因組加倍事件提供有利證據(jù)（見(jiàn)表2）。

從系統(tǒng)進(jìn)化角度看，SBP基因在大多數(shù)植物中都是由多成員組成。例如在擬南芥、水稻和大豆基因組中分別鑒定出3、4和15對(duì)SBP同源基因?qū)?，它們屬于橫向同源基因，處于同一進(jìn)化分支中，形成于物種發(fā)生后。與擬南芥和水稻相比，大豆具有更多SBP同源基因?qū)?，這充分說(shuō)明，大豆物種形成后SBP基因發(fā)生更多重復(fù)事件。一般而言，具有完整SBP功能結(jié)構(gòu)域的SBP基因往往能夠找到EST序列，也就是說(shuō)這些SBP基因具有轉(zhuǎn)錄活性。相反，GmSBP26和GmSBP27不包括典型SBP功能結(jié)構(gòu)域，同時(shí)也沒(méi)有EST數(shù)據(jù)支持其轉(zhuǎn)錄活性，因此，推測(cè)其為假基因。總之，大豆SBP基因家族的進(jìn)化過(guò)程很可能受不等價(jià)交換、局部片段重復(fù)多倍化的全基因組重復(fù)以及轉(zhuǎn)座子等多種因素影響，導(dǎo)致其進(jìn)化錯(cuò)綜復(fù)雜。因此，在生物信息預(yù)測(cè)分析基礎(chǔ)上，有必要進(jìn)行大量驗(yàn)證，最終弄清其起源和進(jìn)化關(guān)系。本研究可為下一步研究大豆SBP轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能提供參考。

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