牟曉飛，王 垠，李 敏，于 濤，楊玉煥

（東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，東北油田鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040）

人類排放含氟氯烴和其他臭氧對抗物等行為會(huì)導(dǎo)致大氣平流層的臭氧衰減，從而使到達(dá)生物圈的UV-B輻射增加，并對陸地生物的生命活動(dòng)產(chǎn)生影響，而合成紫外吸收物質(zhì)被認(rèn)為是植物在生理生化層面抵御UV-B輻射傷害的有效防御機(jī)制[1-3]。黃酮類化合物（Flavonoids）作為一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物，在植物防御UV-B輻射方面扮演著重要角色[4]。根據(jù)中央三碳鏈的氧化程度、成環(huán)與否等，將黃酮類化合物詳細(xì)分為13個(gè)大類即黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇、花色素、黃烷醇、異黃酮、二氫異黃酮、查耳酮、橙酮、苯并色原酮、雙黃酮和高異黃酮等[5]。天然黃酮類化合物多為上述基本結(jié)構(gòu)的衍生物，在植物體內(nèi)大部分與糖結(jié)合成糖苷，少部分以游離形式存在[4]。

山奈酚和槲皮素是最常見的黃酮苷元，二者的衍生物在雙子葉植物中主要是以糖苷形式定位于表皮細(xì)胞的液泡中，發(fā)揮吸收紫外輻射的作用[6-7]。很多研究表明山奈酚糖苷在響應(yīng)UV-B輻射方面有積極作用。Fischbach等發(fā)現(xiàn)歐洲云杉（Picea abies）針葉液泡中的山奈酚-3-葡萄糖苷在針葉發(fā)育過程中逐漸被雙?；咸烟擒杖〈诒砥ぜ?xì)胞壁處形成紫外屏蔽物質(zhì)，這種?；饔每墒蛊湮辗逡浦罸V-B波段，有利于防御UV-B輻射[8]。Kolb等在葡萄的一個(gè)種植品種（Vitis vinifera cv Silvaner）葉片中檢測到兩種山奈酚糖苷的總量受UV-B影響而增加[7]。Morales等發(fā)現(xiàn)垂直樺（Betula pendula）受UV-B輻射影響后葉片中山奈酚-3-鼠李糖苷的積累有升高趨勢[9]。研究發(fā)現(xiàn)伴隨UV-B輻射增強(qiáng)植物體內(nèi)槲皮素糖苷/山奈酚糖苷的比率升高，由此推斷在防御UV-B輻射方面槲皮素糖苷比山奈酚糖苷更為有效，但在UV-B輻射下山奈酚糖苷含量也增加的[10-12]。

研究表明，山奈酚糖苷對植物防御UV-B輻射有重要作用。Li等發(fā)現(xiàn)擬南芥突變體tt4（黃酮合成途徑中關(guān)鍵酶查耳酮合成酶功能缺失）與野生型相比缺少山奈酚衍生物，認(rèn)為山奈酚衍生物的缺失可能是導(dǎo)致其UV-B輻射敏感性的原因[13]。Lois和Buchanan所使用的擬南芥突變體uvs（對UV-B輻射高度敏感，而對其他脅迫的響應(yīng)與野生型相同）僅缺乏一種山奈酚鼠李糖苷而其他酚類代謝產(chǎn)物正常[14]。其后研究較多地關(guān)注槲皮素糖苷/山奈酚糖苷的比率對UV-B輻射的響應(yīng)[15-16]，而未見報(bào)道分析山奈酚糖苷各組分對UV-B輻射的響應(yīng)差異及意義。

擬南芥中主要積累三種山奈酚糖苷，即山奈酚-3-O-鼠李葡萄糖基-7-O-鼠李糖苷（Kaempferol-3-O-rhamnosyl glucoside-7-O-rhamnoside）、山奈酚-3-O-葡萄糖基-7-O-鼠李糖苷（Kaempferol-3-O-glucoside-7-O-rhamnoside）和山奈酚-3-O-鼠李糖基-7-O-鼠李糖苷（Kaempferol-3-O-rhamnoside-7-O-rhamnoside）[17]。本文研究擬南芥山奈酚糖苷的組分及含量（組合模式）對UV-B輻射的響應(yīng)，并同時(shí)檢測山奈酚糖苷合成途徑關(guān)鍵酶編碼基因表達(dá)的變化，為進(jìn)一步認(rèn)識山奈酚糖苷在植物應(yīng)對UV-B輻射過程中的作用積累材料。

1 材料與方法

1.1 材料及培養(yǎng)

哥倫比亞野生型（Columbia-0 ecotype）擬南芥種子購自擬南芥生物資源中心（Arabidopsis Biological Resource Center，US）。種子消毒沖洗后播種于1/2 MS培養(yǎng)基中，置于4℃黑暗環(huán)境中3 d打破休眠后移入自動(dòng)控制溫室中培養(yǎng)，溫度20～25 ℃，光照 150 μmol·m-2·s-1，每天光照 16 h（6:00～22:00），空氣相對濕度50%～70%。選取長出2片子葉的幼苗和長至4片真葉的成苗用于試驗(yàn)。

1.2 UV-B輻射處理與樣品采集

參照Hectors等的UV-B輻射處理方法[18]，在植物培養(yǎng)室內(nèi)使用日光燈管提供正常光照，使用Philips公司的UV-B燈管（TL20W/01RS，最大波長311 nm，波寬20 nm）進(jìn)行UV-B輻射處理，UV-B燈管用0.13 mm厚度的醋酸纖維素膜濾除少量UV-C，每隔2 d更換1次，以保證輻照強(qiáng)度一致。

UV-B輻射處理的擬南芥幼苗（生長1周，2片子葉）和成苗（生長2周，4片真葉），每天在光周期（6:00～22:00）的11:00～17:00施以UV-B輻射，輻射強(qiáng)度40 μw·cm-2。連續(xù)處理7 d后，于第8天的11:00（UV-B處理前）、17:00（UV-B處理后）、22:00（光周期結(jié)束）、第9天的6:00（暗周期結(jié)束）計(jì)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集葉片用于山奈酚糖苷和葉綠素含量測定，每個(gè)樣品至少3個(gè)重復(fù)。于17:00（UV-B處理后）采集葉片用于關(guān)鍵酶基因表達(dá)檢測。

1.3 葉綠素含量測定

采用Arnon方法測定葉綠素含量[19]，計(jì)算葉綠素a/b。

1.4 山奈酚糖苷含量測定

參照Li等方法提取擬南芥樣品中的山奈酚糖苷[13]。通過對比保留時(shí)間、紫外吸收光譜（200～400 nm）和相對峰面積初步判定擬南芥中含有三種山奈酚糖苷即山奈酚-3-O-鼠李葡萄糖基-7-O-鼠李糖苷（K1）、山奈酚-3-O-葡萄糖基-7-O-鼠李糖苷（K2）、山奈酚-3-O-鼠李糖基-7-O-鼠李糖苷（K3）。使用Agilent 1100 LC/MSD液相和離子阱質(zhì)譜聯(lián)用的增強(qiáng)分辨掃描和中性粒子丟失掃描模式，通過分析母離子質(zhì)量和相應(yīng)片段峰譜完成三種山奈酚衍生物的準(zhǔn)確鑒定。利用Waters高效液相色譜（1525梯度洗脫泵、717自動(dòng)進(jìn)樣器、2487紫外檢測器）以山奈酚（Kaempferol，KA）為內(nèi)標(biāo)測定山奈酚糖苷含量。使用Discovery C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm；Supelco公司）以及流動(dòng)相A（含0.01%冰乙酸的超純水）和流動(dòng)相B（乙腈，色譜純）梯度洗脫，（0→5 min，0%B→7%B；6 min→20 min，7%B；21 min→45 min，7%B→22%B；46 min→55 min，22%B→100%B），流速 1.5 mL·min-1，檢測波長330 nm，進(jìn)樣量20 μL。擬南芥幼苗和成苗的山奈酚糖苷樣品在330 nm檢測波長下的高效液相色譜圖如圖1所示。

圖1 擬南芥葉片中山奈酚糖苷的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of kaempferol glycosides in Arabidopsis

1.5 基因表達(dá)的檢測

采用Real-time PCR技術(shù)檢測山奈酚糖苷合成途徑中關(guān)鍵酶編碼基因fls1和chs表達(dá)水平（以actin2基因?yàn)閮?nèi)參）。用Trizol試劑（Invitrogen公司）提取樣品總RNA。按照TAIR數(shù)據(jù)庫提供的基因序列設(shè)計(jì)特異引物（見表1），引物均由上海生工有限公司合成。按照寶生物（大連）有限公司生產(chǎn)的Transcriptor First Strand cDNA synthesis kit試劑盒說明書合成全長cDNA第一鏈，加去離子水稀釋10倍作為模板，在DNA Engine Opticon2TM實(shí)時(shí)定量PCR儀上擴(kuò)增。25 μL的PCR反應(yīng)體系中含有2 μL的cDNA模版，12.5 μL的SYBR Premix Ex TaqTM（2×），正向、反向引物各0.5 μL，超純水9.5 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃60 s、94℃20 s、55℃20 s、72℃20 s，45個(gè)循環(huán)，讀板溫度79℃。反應(yīng)結(jié)束后，采用Dissociation Curves Software（MJ Research Inc.）軟 件分析溶解曲線，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物長度以確定產(chǎn)物特異性。以actin2（At3g18780）為內(nèi)參，使用軟件Q-Gene計(jì)算fls1和chs基因相對表達(dá)量，軟件算法基于Muller等公式[20]。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Forward and reverse primers used in Real-time PCR

1.6 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel和SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）檢驗(yàn)對照與處理之間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素a/b對UV-B輻射的響應(yīng)

葉綠體是植物光合作用的場所，也是自然界中光能吸收、傳遞和轉(zhuǎn)換中重要的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。UV-B輻射能夠破壞植物葉綠體結(jié)構(gòu)及其前體，或使葉綠素合成受阻從而降低葉綠素含量[21]。許多研究發(fā)現(xiàn)，葉綠素a/b變化與UV-B輻射關(guān)系密切，并以葉綠素a/b作為衡量植物受損害情況的指標(biāo)[21-24]。經(jīng)過7 d的UV-B處理后，無論是擬南芥幼苗還是成苗，葉綠素a/b與對照植株相比均無明顯差異，只有幼苗葉綠素a/b在UV-B處理結(jié)束時(shí)顯著低于對照植株，但經(jīng)光恢復(fù)、暗恢復(fù)階段后也回復(fù)至對照水平（見圖2）。這表明試驗(yàn)采用的UV-B輻射強(qiáng)度對擬南芥植株的傷害程度未超出植株的自我修復(fù)能力，符合試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，即在相對長期（7 d）、低強(qiáng)度的UV-B輻射下觀察山奈酚糖苷響應(yīng)。

圖2 擬南芥葉綠素a/b對UV-B輻射的響應(yīng)（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Fig.2 Influence of UV-B radiation on the chlorophyll a/b change of Arabidopsis(mean±SD)

2.2 山奈酚糖苷含量對UV-B輻射的響應(yīng)

擬南芥幼苗和成苗山奈酚糖苷含量差異很大，幼苗山奈酚-3-O-鼠李葡萄糖基-7-O-鼠李糖苷（K1）、山奈酚-3-O-葡萄糖基-7-O-鼠李糖苷（K2）和山奈酚-3-O-鼠李糖基-7-O-鼠李糖苷（K3）的含量均為成苗10倍（見圖3、4）。

圖3 擬南芥幼苗山奈酚糖苷含量對UV-B輻射的響應(yīng)（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Fig.3 Influence of UV-B radiation on the kaempferol glycosides content of young Arabidopsis seedlings(mean±SD)

經(jīng)過7 d的UV-B處理，擬南芥幼苗中三種山奈酚糖苷含量均高于未經(jīng)UV-B處理的對照植株，山奈酚糖苷表現(xiàn)為響應(yīng)UV-B輻射而積累（見圖3）。擬南芥成苗情況有所不同，UV-B處理植株在非UV-B處理時(shí)間特別是經(jīng)過暗周期恢復(fù)后，三種山奈酚糖苷含量與對照植株均無顯著差異，只是在UV-B處理及其后的光恢復(fù)階段才顯著高于對照植株，山奈酚糖苷含量未因連續(xù)7 d的UV-B處理而維持在一個(gè)顯著高于對照植株的水平（見圖4）。

圖4 擬南芥成苗山奈酚糖苷含量對UV-B輻射的響應(yīng)（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Fig.4 Influence of UV-B radiation on the kaempferol glycosides content of mature Arabidopsis seedlings(mean±SD)

對應(yīng)于UV-B輻射處理以及光、暗周期的轉(zhuǎn)變，三種山奈酚糖苷含量都呈現(xiàn)出一定的變化規(guī)律。在擬南芥幼苗中，一日內(nèi)K1含量的變化最為明顯，UV-B處理導(dǎo)致K1含量急劇增加，而后在UV-B處理結(jié)束后的光恢復(fù)階段迅速下降到UV-B處理前水平，并在其后的暗周期中也維持在一個(gè)穩(wěn)定水平。K2、K3含量也有類似于K1的變化趨勢，但變化幅度很小。K2含量在一日中只有暗周期前、后的兩個(gè)采樣點(diǎn)之間差異顯著，而K3含量是暗周期結(jié)束時(shí)分別與暗周期開始時(shí)、UV-B處理結(jié)束時(shí)差異顯著。受UV-B輻射誘導(dǎo)，擬南芥幼苗K1含量提高163.35%，而K2和K3含量僅提高11.58%和17.35%（見圖3）。

擬南芥成苗中，三種山奈酚糖苷含量隨UV-B處理及光、暗周期變化的趨勢與幼苗相似，而且K2、K3含量變化也同K1一樣明顯，盡管它們的變化幅度（絕對數(shù)值）小于幼苗。一日內(nèi)三種山奈酚糖苷含量因UV-B處理都有較大幅度增加，K1、K2、K3含量分別提高91.61%、67.67%、94.22%，并在UV-B處理結(jié)束時(shí)達(dá)到峰值，隨后在光恢復(fù)階段迅速回落，至光周期結(jié)束時(shí)達(dá)到UV-B處理前水平（K3含量稍高），并維持到暗周期結(jié)束、新的光周期開始（見圖4）。

2.3 山奈酚糖苷合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)對UV-B輻射的響應(yīng)

山奈酚糖苷的生物合成源于苯丙醇代謝途徑，在擬南芥中已較清楚[17]。在該途徑中，chs基因編碼的查耳酮合酶是山奈酚衍生物前期合成步驟中的關(guān)鍵控制酶，存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核以及植物液泡膜中，能夠催化柚皮苷查耳酮的合成，也涉及到植物生長激素的極性運(yùn)輸和根的向重力性的調(diào)節(jié)，chs功能缺失的tt4突變體不能合成山奈酚衍生物[13]；fls1基因編碼催化二氫黃酮生成黃酮醇的黃酮醇合酶，該酶能夠催化二氫山奈酚合成山奈酚，從而進(jìn)一步形成山奈酚糖苷。根據(jù)TAIR擬南芥數(shù)據(jù)庫信息，本文采用Real-time PCR技術(shù)檢測UV-B處理結(jié)束時(shí)擬南芥中這兩個(gè)山奈酚代謝關(guān)鍵酶基因（chs和fls1）的表達(dá)水平，并與對照擬南芥進(jìn)行比較，該時(shí)間點(diǎn)上的基因表達(dá)水平代表著基因?qū)V-B處理的響應(yīng)。對應(yīng)于UV-B處理，擬南芥幼苗、成苗chs和fls1基因的表達(dá)水平均表現(xiàn)為上調(diào)趨勢，除成苗fls1外均顯著高于對照植株。chs編碼的查耳酮合酶是山奈酚糖苷合成途徑中位于上游的關(guān)鍵酶，UV-B處理下chs表達(dá)水平的上調(diào)與三種山奈酚糖苷含量的增加是對應(yīng)的。位于山奈酚糖苷合成途徑下游的黃酮醇合酶，其編碼基因fls1表達(dá)水平對應(yīng)于UV-B處理的上調(diào)幅度相對小些，與山奈酚糖苷含量的增加不是很對應(yīng)，尤其是成苗中的情況（見圖5）。

圖5 擬南芥山奈酚糖苷合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)對UV-B輻射的響應(yīng)（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Fig.5 Expression profile of kaempferol glycosides metabolism related genes in response to UV-B radiation(mean±SD)

3 討論

植物應(yīng)對UV-B輻射最常見方式就是合成吸收紫外輻射的次生代謝產(chǎn)物如黃酮類化合物。植物中的黃酮類化合物多為其基本結(jié)構(gòu)的衍生物，并大部分是與糖結(jié)合成糖苷形式存在[4]。作為最常見黃酮類苷元之一的山奈酚，在雙子葉植物中以糖苷形式定位于表皮細(xì)胞的液泡中，起到吸收紫外輻射作用[6-7]，并有報(bào)道擬南芥、歐洲云杉、垂直樺等植物經(jīng)紫外輻射后山奈酚糖苷積累有增加趨勢[8-9,12]。本試驗(yàn)對擬南芥連續(xù)7 d的UV-B輻射處理試驗(yàn)表明，不僅山奈酚糖苷含量對應(yīng)UV-B處理有即時(shí)性增加，而且經(jīng)過7 d的處理后，擬南芥幼苗中山奈酚糖苷的積累水平也顯著高于對照植株。

本試驗(yàn)對三種山奈酚糖苷組分即山奈酚-3-O-鼠李葡萄糖基-7-O-鼠李糖苷（K1）、山奈酚-3-O-葡萄糖基-7-O-鼠李糖苷（K2）和山奈酚-3-O-鼠李糖基-7-O-鼠李糖苷（K3）的具體分析表明，它們應(yīng)對UV-B輻射的變化并不是一致的。在擬南芥幼苗中，K1含量應(yīng)對UV-B輻射的即時(shí)性變化幅度較大，而K2、K3含量變化幅度很小（見圖3）。在擬南芥成苗中，K1、K3含量變化幅度要大于K2含量變化幅度（見圖4）。Lois等研究表明，缺失一種山奈酚鼠李糖苷的擬南芥突變體uvs表現(xiàn)出對UV-B的高度敏感[14]?？梢?，不僅要分析山奈酚糖苷總量，還要深入分析山奈酚糖苷各組分及含量即組合模式的變化，對于認(rèn)識山奈酚糖苷在植物應(yīng)對UV-B輻射過程中的作用具有重要意義。

研究表明，擬南芥幼苗中三種山奈酚糖苷含量是成苗10倍，且經(jīng)過7 d的UV-B輻射處理后，幼苗中山奈酚糖苷積累水平顯著高于對照，而成苗中卻不同。在對擬南芥芥子酸酯的研究中也發(fā)現(xiàn)類似情況，并推斷擬南芥芥子酸酯對于UV-B輻射的防護(hù)作用，幼苗屬于組成型防御（Constitutive defense），而到成苗則轉(zhuǎn)變?yōu)檎T導(dǎo)型防御（Inducible defense）。山奈酚糖苷是否屬于這種情況，還有待于進(jìn)一步探討。

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