代新珍， 黃學(xué)平， 鐘 琳， 陳少紅， 韓西群， 張 玉， 朱梅剛， 趙 彤，△

(南方醫(yī)科大學(xué)1附屬南方醫(yī)院病理科，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，廣東廣州510515)

Septins是一類具有GTP酶活性的基因家族，最早在酵母中發(fā)現(xiàn)。該基因家族分布廣泛，存在于除植物外幾乎所有的真核生物中［1］。Septins家族除了與細(xì)胞胞質(zhì)分裂、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、凋亡等細(xì)胞生理過程有關(guān)外，還發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育過程中控制細(xì)胞的遷移［2］。Septin 2作為septins家族成員，它與纖維狀肌動(dòng)蛋白(F－actin)共同參與細(xì)胞骨架的組裝，在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)即應(yīng)力纖維和片狀偽足中表現(xiàn)為共定位表達(dá)，septin 2表達(dá)被干擾后，纖維狀肌動(dòng)蛋白表達(dá)也明顯減弱［3］。而骨架蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移方面的作用，目前研究較多的是細(xì)胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42)，它可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白聚合，對(duì)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的作用，septin 2在調(diào)控細(xì)胞遷移方面的研究未見報(bào)道，septin 2作為一新型骨架蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平及調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的作用仍不清楚。為此，本研究首先檢測(cè)septin 2在4株不同轉(zhuǎn)移能力的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)，篩選出高表達(dá)細(xì)胞株后，采用siRNA干擾方法沉默該株細(xì)胞septin 2基因，比較沉默前后該基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移中的作用，為結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制的研究提供新的理論依據(jù)。

材料和方法

1 主要試劑和儀器

RPMI－1640培養(yǎng)液購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品;RNAisoTMPlus Total RNA提取試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR試劑盒均購自TaKaRa;蛋白提取試劑盒和蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒購自上海申能博彩生物科技有限公司;SDS－PAGE凝膠配制試劑盒、蛋白上樣緩沖液(5×)和BeyoECL Plus發(fā)光試劑盒購自碧云天公司;兔抗人septin 2多克隆抗體購自Novus Biologicals;α－tubulin鼠抗人單克隆抗體、FITC－羊抗兔IgGⅡ抗、羊抗鼠Ⅱ抗和羊抗兔Ⅱ抗購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑和 Opti－MEM培養(yǎng)基購自Invitrogen;FRTC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽購自Sigma。

二氧化碳培養(yǎng)箱為Thermo產(chǎn)品;倒置相差顯微鏡和FV－1000型共聚焦顯微鏡為Olympus產(chǎn)品; 680型酶標(biāo)分析儀和垂直凝膠電泳槽為Bio－Rad產(chǎn)品;高速冷凍離心機(jī)為Heraeus Beckman產(chǎn)品;紫外分光光度計(jì)為Beckman產(chǎn)品;7500 Fast Real－Time PCR System為ABI產(chǎn)品。

2 細(xì)胞系來源和培養(yǎng)

人高轉(zhuǎn)移潛能結(jié)直腸癌細(xì)胞株LoVo和低轉(zhuǎn)移潛能結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT－29、SW480及HCT－116均由南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理系提供，細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，不加任何抗生素。

3 方法

3.1 實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR檢測(cè)4株不同轉(zhuǎn)移能力的結(jié)直腸癌細(xì)胞株中septin 2 mRN的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4株人結(jié)直腸癌細(xì)胞株LoVo、HT－29、HCT－116和SW480，嚴(yán)格按照 RNAisoTMPlus Total RNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行RNA提取。提取的總RNA按照說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。根據(jù)GenBank中相應(yīng)的序列，以Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。septin 2基因引物序列:上游引物5’－CACCGAAAATCACTGAAAAAAGG－3’，下游引物5’－GCTGTTTATGAGAGTCGATTTTCCT－3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為876 bp;內(nèi)參照GAPDH引物序列:上游引物5’－GCTGAGTA－TGTCGTGGAGTCT－3’，下游引物5’－GTTCACACCCATCACAAACAT－3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為146 bp。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)總體系20 μL。PCR反應(yīng)條件:95℃30 s，95℃5 s，53.5℃ 34 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。然后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析:各目的基因表達(dá)水平的變異用變化倍率(2－ΔΔCt)來表示。

3.2 Western blotting法檢測(cè)4株細(xì)胞株中septin 2蛋白的表達(dá) 采用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，每孔蛋白上樣50 μg，進(jìn)行12%SDS－PAGE電泳，100 mA電轉(zhuǎn)PVDF膜2 h，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。兔抗人septin 2多克隆抗體(1∶2 000)及小鼠抗人α－tubulin單克隆抗體(1∶500)Ⅰ抗4℃過夜，Ⅱ抗為辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶5 000)，山羊抗鼠IgG(1∶5 000)37℃與膜共孵育1 h，BeyoECL Plus發(fā)光。以Image－Pro Plus 6.0軟件分析各組灰度值，α－tubulin為內(nèi)參照進(jìn)行校正，以對(duì)照組面積灰度值為100%與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較。

3.3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞并定性定量檢測(cè)干擾效率細(xì)胞

將LoVo細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)組為4組:siRNA/832、siRNA/663、control siRNA (CON)和LoVo細(xì)胞(NC)。取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用于免疫熒光及劃痕實(shí)驗(yàn)。12 h后熒光顯微鏡下定性觀察轉(zhuǎn)染效果，24 h后實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR檢測(cè)干擾效率。各干擾序列均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。Scrambled siRNA引物，正義鏈5’－UUCUCCGAACGUGUC－3’，反義鏈5’－ACGUGACACGUUCGGAGAATT－3’。siRNA/832序列:正義鏈 5’－GGCGGCACAUCAUUGAUAATT－3’，反義鏈5’－UUAUCAAUGAUGUGCCGCCTT－3’。siRNA/663序列:正義鏈5’－GAGGCUUCAACUGUUGAAATT－3’，反義鏈5’－UUUCAACAGUUGAAGCCUCTT－3’。

3.4 免疫熒光激光共聚焦實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染24 h后的4組細(xì)胞:siRNA/832、siRNA/663、CON和NC。接種于6孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)板中預(yù)先置入高壓消毒的蓋玻片，常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出蓋玻片，PBS沖洗3次。4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS沖洗3次。0.1%Triton X－100通透15 min，PBS沖洗3次。用3%BSA于室溫下封閉1 h;傾去封閉液，加septin 2抗體(1∶75)4℃孵育過夜，滴加Ⅱ抗(1∶100，含F(xiàn)ITC－羊抗兔IgG)，室溫避光孵育30 min;PBS洗3次，滴加2.5 mg/L FRTC－鬼筆環(huán)肽［由鬼筆鵝膏真菌產(chǎn)生的一種環(huán)肽，可與纖維狀肌動(dòng)蛋白(F－actin)結(jié)合，使纖維狀肌動(dòng)蛋白保持穩(wěn)定，其熒光標(biāo)記物是鑒定F－actin的重要試劑］，37℃潮濕暗盒中靜置60 min。PBS清洗后再加DAPI室溫避光染色5 min，PBS沖洗，瀝干，置于潔凈無熒光載玻片上，于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

3.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染24 h后的3組細(xì)胞: siRNA/832、siRNA/663和 CON，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。0.25%胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于常規(guī)培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L。按5×105cells/well接種細(xì)胞到12孔板中，用10 μL的槍頭給12孔板中的細(xì)胞劃痕，常規(guī)培養(yǎng)24 h，分別于劃痕后0 h、12 h、24 h每個(gè)孔取4個(gè)視野拍照，觀察劃痕愈合能力。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析(One－way ANOVA)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 4株人結(jié)直腸癌細(xì)胞septin 2 mRNA的表達(dá)

LoVo細(xì)胞株中septin 2 mRNA的表達(dá)明顯高于HT－29、SW480和HCT－116細(xì)胞株，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);septin 2 mRNA在 HT－29、SW480和HCT－116細(xì)胞中均低表達(dá)，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖1。

2 Western blotting檢測(cè)septin 2蛋白在不同大腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)

Septin 2蛋白在 LoVo細(xì)胞中表達(dá)明顯強(qiáng)于SW480、HCT－116和HT－29細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);septin 2蛋白在HT－29、SW480和HCT－116中表達(dá)均較低，但各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖2。

3 定性定量檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率

LoVo細(xì)胞轉(zhuǎn)染12 h后，普通熒光顯微鏡下約有70%的細(xì)胞轉(zhuǎn)入了干擾片段，見圖3。轉(zhuǎn)染24 h后，實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR結(jié)果顯示，與CON組相比，septin 2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別下調(diào)了32.045%(siRNA/663)和67.955%(siRNA/832);與CON組相比，siRNA/663和siRNA/832組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而與NC組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4。

4 LoVo細(xì)胞septin 2干擾前后骨架蛋白的變化

激光共聚焦顯微鏡下觀察septin 2干擾前后細(xì)胞骨架的變化，綠色FITC和紅色FRTC分別標(biāo)記septin 2及鬼筆環(huán)肽F－actin，而藍(lán)色DAPI染料復(fù)染細(xì)胞核。NC組細(xì)胞中septin 2與F－actin主要環(huán)繞細(xì)胞周邊，形成周邊肌動(dòng)蛋白絲帶，septin 2表達(dá)的部位，F(xiàn)－actin為陽性表達(dá)，二者部位基本重合，構(gòu)成微絲骨架應(yīng)力纖維及片狀偽足主要成分;siRNA/832組septin 2表達(dá)減弱，相應(yīng)部位的纖維狀肌動(dòng)蛋白表達(dá)也減弱，見圖5。相對(duì)于CON組和siRNA/663和 siRNA/832組LoVo細(xì)胞應(yīng)力纖維減少，熒光減弱，片狀偽足少而短，明顯變細(xì)，見圖6。

Figure 1.Expression of septin 2 mRNA in the indicated colorectal cell lines determined by real－time fluorescence quantitative RT－PCR.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs LoVo.圖1 實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR檢測(cè)septin 2 mRNA在不同大腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)

Figure 2.Expression of septin 2 protein in the indicated colorectal cell lines determined by Western blotting.The corresponding α－tubulin was shown as loading control.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs LoVo.圖2 Western blotting檢測(cè)septin 2蛋白在不同大腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)

Figure 3.The effecacy of transfection was confirmed by fluorescence microscopy 12 h after transfection(×400).圖3 轉(zhuǎn)染12 h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果

Figure 4.Expression of septin 2 mRNA in the four groups determined by real－time fluorescence quantitative RT－PCR 24 h after transfection.±s.n=3.*P＜0.05 vs CON.圖4 轉(zhuǎn)染24 h后各組細(xì)胞septin 2 mRNA的變化

5 Septin 2蛋白下調(diào)后LoVo細(xì)胞的遷移能力

定向干擾septin 2基因后，與CON組相比，siRNA/663和siRNA/832組從劃痕后12 h時(shí)遷移能力變化不明顯(P＞0.05)，而到24 h時(shí)CON組細(xì)胞大部分“傷口”已接近愈合，而siRNA/663和siRNA/ 832組則傷口愈合不明顯，愈合能力差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見圖7。

Figure 5.Co－localization of septin 2 and F－actin in LoVo cells observed by immunofluorescence and laser scanning confocal microscopy.Scale bars:2 μm.圖5 septin 2與F－actin共定位的免疫熒光共聚焦結(jié)果

Figure 6.Silencing of septin 2 expression disturbed F－actin assembly 48 h after transfection，which was observed by immunofluorescence and laser scanning confocal microscopy.Scale bars:2 μm.圖6 siRNA靶向沉默septin 2表達(dá)后擾亂F－actin組裝的免疫熒光共聚焦結(jié)果

Figure 7.Effect of septin 2 silencing on wound closure of LoVo cells(×100).±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs CON.圖7 Septin 2蛋白表達(dá)降低對(duì)細(xì)胞劃痕愈合能力的影響

討論

細(xì)胞骨架(cytoskeleton)是細(xì)胞漿中一組由細(xì)纖維網(wǎng)狀物質(zhì)組成的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，不僅具有維持細(xì)胞形狀、運(yùn)動(dòng)的功能，而且在蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)、大分子和細(xì)胞器的運(yùn)輸以及細(xì)胞代謝的協(xié)調(diào)中均發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞骨架的異常直接影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。新近研究發(fā)現(xiàn)septins與細(xì)胞骨架蛋白如肌動(dòng)蛋白(actin)和α－微管蛋白(α－tubulin)等成份相互作用，被認(rèn)為是一種新的細(xì)胞骨架成份［4－5］。

Septins參與細(xì)胞多種重要生理過程，包括細(xì)胞胞質(zhì)分裂，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，凋亡和腫瘤的發(fā)生，在腫瘤發(fā)生過程中可能起著癌基因或抑癌基因的作用［6］。而且越來越多的證據(jù)表明，septins異常表達(dá)于某些腫瘤中，這種異常表達(dá)可能與腫瘤發(fā)生學(xué)有關(guān)［7］。截止到目前，在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)了14種septins［8］。Liu等［9］分析了14種septins在35種人類腫瘤中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)腫瘤中，septin 2，septin 8和septin 9，septin 11的表達(dá)顯著升高，septin 4和septin 10的表達(dá)明顯下降。

Septin 2作為一種新型骨架蛋白廣泛表達(dá)于腦腫瘤組織中［10］。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量 RTPCR和Western blotting檢測(cè)septin 2在4株不同轉(zhuǎn)移能力的結(jié)直腸癌細(xì)胞株LoVo、HT－29、SW480和HCT－116中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)septin 2在4株癌細(xì)胞中均有表達(dá)，但在高轉(zhuǎn)移株LoVo細(xì)胞的表達(dá)較低轉(zhuǎn)移株HT－29、SW480和HCT－116細(xì)胞的表達(dá)明顯增高;免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)septin 2在LoVo細(xì)胞中的表達(dá)形態(tài)特點(diǎn)及其與骨架蛋白F－actin的關(guān)系，結(jié)果顯示septin 2與F－actin主要環(huán)繞在癌細(xì)胞周邊，形成周邊肌動(dòng)蛋白絲帶，septin 2表達(dá)部位與F－actin表達(dá)部位基本重合，構(gòu)成了微絲骨架應(yīng)力纖維及片狀偽足的主要成分，在干擾了setpin 2在LoVo中的表達(dá)后，F(xiàn)－actin的表達(dá)也明顯減弱，兩者共同參與結(jié)直腸癌細(xì)胞的骨架組裝，兩者間存在著相互作用，這與Kremer等［3］的研究結(jié)果一致。在細(xì)胞遷移過程中，首先是細(xì)胞骨架前端伸出片狀或絲狀偽足，通過與細(xì)胞外基質(zhì)建立新的黏附來維持伸展?fàn)顟B(tài);接著，細(xì)胞借助肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞體收縮使細(xì)胞向前運(yùn)動(dòng);最后，細(xì)胞尾部與基質(zhì)分離并縮回，影響瘤細(xì)胞的黏附、侵襲及轉(zhuǎn)移能力［4－5，11］，可見細(xì)胞骨架在細(xì)胞遷移中充當(dāng)非常重要的角色。而septin 2僅在高轉(zhuǎn)移能力的結(jié)直腸癌細(xì)胞株LoVo中有高表達(dá)，并且參與細(xì)胞骨架的組裝，可能與LoVo的高轉(zhuǎn)移功能有關(guān)。本研究通過劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默LoVo細(xì)胞株septin 2表達(dá)前后細(xì)胞遷移能力的改變，發(fā)現(xiàn)定向沉默septin 2基因后，與CON組相比，siRNA/663和siRNA/832組從劃痕后12 h遷移能力變化不明顯，而到24 h時(shí)siRNA/663和siRNA/832組傷口愈合不明顯，而CON組細(xì)胞大部分“傷口”已接近愈合，結(jié)果顯示septin 2具有促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用，沉默septin 2的表達(dá)后細(xì)胞的遷移能力明顯下降。

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