劉 歡 馬中蘇

（1.通化師范學(xué)院，吉林 通化 134002；2.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林 長春 130025）

以果蔬渣為原料提取膳食纖維，再將這些膳食纖維進(jìn)行的處理，改變纖維素固有的特性，形成具有其它功能性質(zhì)的產(chǎn)物或衍生物，在造紙、醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用［1，2］。目前，對纖維素的研究主要集中在木材和麥稈等纖維材料［3，4］，但隨著研究的深入，果蔬中纖維素食用性和功能性也將逐漸被大家所認(rèn)知［5］。

生物技術(shù)因其具有環(huán)保、節(jié)能和高效等優(yōu)點(diǎn)被廣泛的應(yīng)用在各個領(lǐng)域中，尤其在農(nóng)業(yè)廢棄物再利用和纖維綜合應(yīng)用中發(fā)揮突出的貢獻(xiàn)［6］。復(fù)合纖維素酶和纖維素作用時，其所含組分具有不同的活性和選擇性，而顯示出多種類型的協(xié)同作用［7，8］。Jackson等［8］用干燥過的漂白針葉木纖維和復(fù)合纖維素酶反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)屑和細(xì)小纖維具有較大的比表面和可及度。楊博等［9］研究了纖維素酶、木聚糖酶處理對楊木紙漿物理性能的影響，并采用纖維質(zhì)量分析儀和X－射線衍射分析生物酶處理后纖維形態(tài)及結(jié)晶指數(shù)的變化。結(jié)果表明，紙漿經(jīng)酶處理后，細(xì)小纖維含量和纖維扭結(jié)指數(shù)降低，結(jié)晶指數(shù)提高。

在胡蘿卜加工過程中，得到的胡蘿卜渣約占原料的30%～50%，而其含有的胡蘿卜纖維素占56%［10］。本試驗采用生物酶對胡蘿卜渣纖維（CPC）進(jìn)行改性，觀測改性前后纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，并采用示差掃描量熱分析（differential scanning calorimetry，DSC）、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）和X－射線衍射（X－ray diffractometer，X－ray）技術(shù)，進(jìn)一步分析生物酶改性胡蘿卜渣纖維（EMCPC）的微觀結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。旨為生物酶改性纖維素的研究提供數(shù)據(jù)參考，為擴(kuò)大纖維素在造紙、醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

胡蘿卜渣：本實驗室自制；

纖維素酶：15 000IU／g，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

木聚糖酶：60 000IU／mg，北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

檸檬酸、檸檬酸鈉、酒石酸鉀鈉：分析純，北京化工廠；

3，5－二硝基水楊酸：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

苯酚：分析純，西隴化工股份有限公司；

亞硫酸氫鈉：分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

造紙纖維測量儀：JZ－K型，南通三思機(jī)電科技有限公司；

掃描電子顯微鏡：XL30－ESEM 型，荷蘭FEI公司；

X－射線衍射儀：D8－ADVANCE型，德國Bruker公司；

傅立葉變換紅外光譜儀（FTIR）：Nexus 670 型，美國熱電集團(tuán)尼高力儀器公司；

示差掃描量熱儀：DZ－3335 型，南京大展機(jī)電技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 胡蘿卜渣纖維素的制備 新鮮的胡蘿卜洗凈，切成3～5mm的小段，于榨汁機(jī)中榨汁，用240號尼龍濾布過濾（50目），濾渣干燥（50℃），粉碎過篩（100目）；胡蘿卜渣和蒸餾水按質(zhì)量比1∶2混合，用10%鹽酸調(diào)節(jié)料液的pH 值為1.5，在85 ℃下浸提2.0h，過濾，熱水洗滌濾渣，濾渣水洗至中性；按提取液用量為15 mL／g 加入10% NaOH 溶液，40 ℃浸提20h，濾渣用水洗至中性；用水洗除堿液，加等量次氯酸鈉，用50%醋酸調(diào)pH 為4～5，加熱至75 ℃，保持1h，冷卻至室溫，過濾，用95%乙醇洗滌除去次氯酸鈉，過濾；濾渣在60 ℃烘干，得胡蘿卜渣纖維素（CPC）。

1.2.2 酶活力的測定 采用DNS法［11］。

1.2.3 酶改性胡蘿卜渣纖維素的工藝

CPC→預(yù)處理→酶處理→終止反應(yīng)→EMCPC

CPC 與混合酶液按固液比20 g／L 進(jìn)行酶改性，用0.05mol／L檸檬酸緩沖液（pH 4.8）配置酶混合溶液。酶改性條件：纖維素酶用量為90IU／g，木聚糖酶用量為36IU／g，酶解時間為1.5h，酶解溫度為50 ℃。

1.2.4 形態(tài)的測定 用玻璃棒取少量纖維素，放入裝有去離子水的離心管內(nèi)。搖勻，將纖維素分散在離子水里。用膠頭滴管取兩滴，放入載玻璃片上。在顯微鏡下觀察纖維素形態(tài)，高分辨率彩色攝像頭采集圖像，重復(fù)取樣采集圖像。

1.2.5 掃描電子顯微鏡 樣品在40 ℃溫度下干燥6h后，將樣品用雙面膠固定于不銹鋼載物片上，真空鍍金。取出樣品置于電子顯微鏡的載物臺上，觀察樣品表觀形態(tài)結(jié)構(gòu)，重復(fù)取樣觀測。

1.2.6 示差掃描量熱分析 示差掃描量熱法指在相同的程控溫度變化下，用補(bǔ)償器測量樣品與參比物之間的溫差保持為零所需熱量對溫度的依賴關(guān)系，它能定量分析可食膜的熱行為。樣品在40℃溫度下干燥6h后，取10mg干燥樣品于鋁盒中，以空鋁盒為空白對照，氮?dú)饬魉?0mL／min，升溫速率為10 ℃／min，掃描起始溫度為10 ℃，升溫至500 ℃，得DSC曲線，重復(fù)取樣測定。

1.2.7 X－射線衍射 樣品在40 ℃溫度下干燥6h后，采用X 光廣角衍射儀記錄X－射線衍射圖譜。測試條件：CuK 輻射，電壓40kV，電流40mA；狹縫參數(shù)分別為DS狹縫2°、SS狹縫2°、RS狹縫0.3 mm；Ni濾波器；連續(xù)掃描，掃描速度2°／min，步長0.1°。依據(jù)X－射線衍射圖譜，按照Sherrer法和Turley法，計算微晶尺寸和結(jié)晶度，重復(fù)取樣測定。

2 試驗結(jié)果

2.1 形態(tài)結(jié)構(gòu)

CPC和EMCPC的形態(tài)圖見圖1和2，EMCPC 的SEM表征見圖3和4。

圖1 CPC形態(tài)結(jié)構(gòu)圖（×200）Figure 1 Morphology structure image of CPC（×200）

圖2 EMCPC形態(tài)結(jié)構(gòu)圖（×200）Figure 2 Morphology structure image of EMCPC（×200）

圖3 EMCPC的SEM 圖（×500）Figure 3 SEM image of EMCPC（×500）

圖4 EMCPC的SEM 圖（×5 000）Figure 4 SEM image of EMCPC（×5 000）

由圖1和2可知，酶解后，纖維素的長度減小。酶作用使長纖維素被分裂成尺寸較小的纖維素，纖維素表面的P層、S1層脫除，短纖維素數(shù)目增加［12］。

由圖3和4可知，酶改性纖維素干燥后發(fā)生團(tuán)聚，邊緣含有細(xì)小組分及碎片，纖維素的次生壁微纖維素暴露，細(xì)胞壁層的脫除，并發(fā)生分絲“帚化”和“剝皮”現(xiàn)象，纖維素表面出現(xiàn)孔洞和溝槽，纖維素的斷裂主要發(fā)生于孔洞處［13］。纖維素的外表面積與其形狀和大小直接相關(guān)，并且隨著纖維素表面積的增加，纖維素酶的吸附性和纖維素的反應(yīng)活性不斷升高。酶解纖維素作用除了會使外表面積增加，其更大作用可能是減少傳質(zhì)阻力。

2.2 DSC表征

CPC和EMCPC的DSC表征曲線見圖5，曲線分析結(jié)果見表1。

圖5 CPC和EMCPC的DSC曲線Figure 5 DSC curves of CPC and EMCPC

表1 CPC和EMCPC的DSC參數(shù)Table 1 DSC parameters of CPC and EMCPC

由圖5和表1可知，兩物質(zhì)的DSC曲線在低溫和高溫處分別有一個放熱峰，在中溫處有一個吸熱峰。第一個放熱峰極值溫度（Tc）在86 ℃附近開始，而吸熱峰極值溫度（Tm）在122 ℃附近開始；并且酶解后的增加，Tc和Tm升高。這是因為酶解后，胡蘿卜渣纖維素的結(jié)晶態(tài)比例增加，使結(jié)晶溫度升高。第二個放熱峰極值溫度（To）在224 ℃附近開始；酶解后，To降低。這是因為EMCPC 的粒徑急劇減小，其比表面積顯著增加，因此表面上的末端碳和外露的反應(yīng)活性基團(tuán)顯著增加，其熱穩(wěn)定性能降低，氧化分解的熱量減小。

2.3 X－射線衍射表征

CPC和EMCPC的X－射線衍射表征見圖6，結(jié)晶度和微晶尺寸見表2。

圖6 CPC和EMCPC的X－ray圖譜Figure 6 X－ray spectra of CPC and EMCPC

表2 CPC和EMCPC的結(jié)晶度和微晶尺寸Table 2 Crystal degree and size of CPC and EMCPC

由圖6可知，在X－ray衍射曲線上既有尖銳峰又有比較平的彌散峰，說明EMCPC不是100%結(jié)晶，仍保持結(jié)晶區(qū)與無定形區(qū)同時共存的狀態(tài)。在X－ray 衍射角為14.76°、22.81°和35.1°均出現(xiàn)了特征衍射峰，與纖維素I型特征衍射峰所在的衍射角一致。這是因為CPC 在酶解后，EMCPC的晶型結(jié)構(gòu)并未改變，仍是典型的纖維素I型。

由表2 可知，纖維素的結(jié)晶度由40.49% 提高到41.06%，一方面可能因為酶解過程對原纖維素結(jié)構(gòu)中疏松的無定形區(qū)破壞不明顯，結(jié)晶區(qū)比例相應(yīng)略有增加；另一方面可能因為纖維素酶并非只作用于纖維素?zé)o定形區(qū)，而對結(jié)晶區(qū)的表面也有作用，維持結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)的比例不變，所以結(jié)晶度變化不明顯。同時CPC 微晶尺寸為4.1nm，酶解后EMCPC的微晶尺寸為4.3nm，微晶尺寸增大了，這與DSC測得結(jié)果一致。這是因為酶解在纖維素表面的纖維素?zé)o定形區(qū)域和半纖維素的存在區(qū)域進(jìn)行，所以酶解作用使纖維素以及細(xì)小組分的結(jié)晶度提高，半纖維素含量降低，從而使纖維素和細(xì)小組分的表面水化程度降低［14］。而酶改性纖維素微晶尺寸增加不明顯，進(jìn)一步說明酶解主要是在無定形區(qū)和結(jié)晶區(qū)表面上進(jìn)行的。

3 結(jié)論

生物酶處理胡蘿卜渣纖維素后，纖維素發(fā)生水解作用，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，主要表現(xiàn)為纖維素的長度減小，短纖維素數(shù)量增加，纖維素的次生壁微纖維素暴露，細(xì)胞壁層的脫除，并發(fā)生分絲“帚化”和“剝皮”現(xiàn)象，纖維素表面出現(xiàn)孔洞和溝槽，纖維素在孔洞處發(fā)生斷裂。通過對DSC和X－ray結(jié)果進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，酶改性胡蘿卜渣纖維素的結(jié)晶態(tài)比例和結(jié)晶度增加，但變化不明顯，說明改性胡蘿卜渣纖維素仍具有纖維素的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)和纖維素I型結(jié)構(gòu)。這一結(jié)論與Gusakov和Pommier等［15，16］研究結(jié)果一致，酶處理纖維素使原纖化程度得到提高，纖維間結(jié)合力增強(qiáng)，而不引起紙漿物理性能的改變。因此，生物酶處理可以提高胡蘿卜渣纖維素與其它化合物反應(yīng)活性，并保留著較強(qiáng)的機(jī)械性能。所以酶改性胡蘿卜渣纖維素可以作為一種環(huán)保、天然和可食的纖維素材料，而其應(yīng)用的研究將成為今后主要發(fā)展方向。

1 Villalobos R，Hernández－Muoz P，Chiralt A.Effect of surfactants on water sorption and barrier properties of hydroxypropyl methylcellulose films［J］.Food Hydrocolloids，2006，20（4）：502～509.

2 Idicula M，Malhotra S K，Joseph K，et al.Dynamic mechanical analysis of randomly oriented intimately mixed short banana／sisal hybrid fibre reinforced polyester composites［J］.Composites Science and Technology，2005，65（7）：1 077～1 087.

3 Chauvelon G，Gergaud N，Saulnier L，et al.Esterification of cellulose－enriched agricultural by－products and characterization of mechanical properties of cellulosic films［J］.Carbohydrate Polymers，2000，42（4）：385～392.

4 孫振鈞.中國生物質(zhì)產(chǎn)業(yè)及發(fā)展取向［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2004，20（5）：1～5.

5 McHugh T H，Olsen C W，Senesi E，et al.Fruit and vegetable edible wraps Application to partially dehydrated apple pieces：United States－Japan cooperative program in natural resources［J］.Quality of Fresh and Processed Foods，2004，54（2）：289～299.

6 Van Wyk J P H.Biotechnology and the utilization of biowaste as a resource for bioproduct development［J］.Trends in Biotechnology，2001，19（5）：172～177.

7 袁平，余惠生，付時雨，等.纖維素酶和半纖維素酶對纖維改性的研究進(jìn)展［J］.中國造紙，2001，20（5）：53～57.

8 Jackson J S，Heitmann J A，Joyce T W.Enzymatic modifications of secondary fiber［J］.Tappi Journal，1993，76（3）：147～154.

9 楊博，秦夢華，劉娜，等.纖維素酶和木聚糖酶改善楊木CTMP強(qiáng)度性能的研究［J］.造紙科學(xué)與技術(shù)，2010，29（2）：59～63.

10 林文庭，洪華榮.胡蘿卜渣膳食纖維提取工藝及其性能特性研究［J］.糧油食品科技，2008，16（6）：56～59.

11 呂家華.纖維素酶對纖維素纖維的作用［D］.上海：東華大學(xué)，2003.

12 管斌，孫艷玲，謝來蘇，等.紙漿酶改性對纖維素聚合度和纖維長度的影響［J］.中國造紙學(xué)報，2000，15（Z1）：14～17.

13 魯杰，石淑蘭，楊汝男，等.纖維素酶酶解葦漿纖維微觀結(jié)構(gòu)和結(jié)晶結(jié)構(gòu)的變化［J］.中國造紙學(xué)報，2005，20（2）：85～90.

14 管斌，孫艷玲，隆言泉，等.復(fù)合纖維素酶對楊木SGW 漿纖維素結(jié)晶度和微晶體尺寸的影響［J］.中國造紙學(xué)報，2000，15（1）：7～11.

15 Gusakov A V，Sinitryn A P，Klyosov A A.Factors affecting the enzymatic hydrolysis of cellulose in bath and continuous reactors［J］.Biotechnol Bioeng，1987（29）：906～910.

16 Pommier J C，F(xiàn)uentes J L，Goma G，et al.Using enzymes to improve the process and the product quality in the recycled paper industry.Part 2：industrial applications［J］.Tappi Journal，1990，73（12）：197～202.