游永寧，尹渝來，刁英，孫芳芳，鄭興飛，周明全，鮑忠洲，胡中立

（1.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，430072；2.蘇州市蔬菜研究所；3.湖北省蓮藕工程技術(shù)研究中心）

芡種質(zhì)資源及其雜種后代的初步遺傳分析與評(píng)價(jià)

游永寧1，尹渝來2，刁英1，孫芳芳2，鄭興飛1，周明全3，鮑忠洲2，胡中立1

（1.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，430072；2.蘇州市蔬菜研究所；3.湖北省蓮藕工程技術(shù)研究中心）

利用DNA標(biāo)記（AFLP標(biāo)記和SRAP標(biāo)記）研究了11份芡、4份雞王蓮和1份克魯茲王蓮之間的親緣關(guān)系，13對(duì)AFLP引物共產(chǎn)生490條條帶，多態(tài)性條帶447條（91.22%）；9對(duì)SRAP引物共產(chǎn)生162條條帶，多態(tài)性條帶151條（93.21%）；用UPGMA法建立的分子標(biāo)記聚類樹顯示，克魯茲王蓮與其他材料（包括雞王蓮）差異很大，而雞王蓮與芡也有一定的差異。此外，對(duì)5份芡雜交材料的品質(zhì)性狀進(jìn)行了檢測(cè)，利用品質(zhì)性狀的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析的結(jié)果表明，材料間的遺傳距離很近，難以分辨相同種屬不同材料的遺傳關(guān)系和分類地位。

種質(zhì)資源；芡；克魯茲王蓮；分子標(biāo)記；品質(zhì)性狀

克魯茲王蓮（Victoria cruziana）是原產(chǎn)于南美洲熱帶的大型多年生浮葉植物，屬睡蓮科王蓮屬[1，2]。因其花和葉外形優(yōu)美，在我國(guó)的南方地區(qū)植物園得到廣泛種植。芡（Euryale ferox）是大型一年生浮葉植物，多刺，屬睡蓮科芡屬[3]。芡根據(jù)其植株形態(tài)又分為刺芡和蘇芡兩種，前者葉片、葉柄、花梗密布剛刺，廣布于東南亞及我國(guó)南北各省區(qū)的池塘和沼澤中，均為野生或半野生種，在江蘇、安徽、湖北沿長(zhǎng)江一帶栽培較多[4，5]；后者原產(chǎn)江蘇省蘇州市，其植株僅葉片背面葉脈上及葉緣有少量刺，因其產(chǎn)量高、品質(zhì)糯，現(xiàn)正在全國(guó)各地推廣種植。芡也為觀葉植物，且與克魯茲王蓮?fù)瑢偎徔疲锌赡茈s交形成獲得集食用和觀賞為一體的新品種。

芡是被子植物中的一個(gè)古老物種，種子被稱為芡實(shí)或雞頭米，可供食用，也可入藥。芡實(shí)含有可溶性糖、脂肪、蛋白質(zhì)、鈣、鐵、磷、抗壞血酸、核黃素和樹脂等多種有效成分，對(duì)多種疾病均具有良好的療效[6，7]。然而，隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)的發(fā)展，野生種群隔離和棲息地等被破壞，導(dǎo)致野生芡品種的種群減少，甚至滅絕。而且，目前對(duì)于芡的種群生態(tài)學(xué)和種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究還很有限，因此對(duì)芡的保護(hù)和利用就受到一定限制[8]。

本研究首次利用 DNA標(biāo)記 （AFLP標(biāo)記和SRAP標(biāo)記）對(duì)芡、克魯茲王蓮及其雜交材料的種質(zhì)資源進(jìn)行研究。同時(shí)，還對(duì)芡雜交材料的品質(zhì)性狀進(jìn)行了檢測(cè)和分析，為芡的育種提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料包括1份克魯茲王蓮葉片樣品，11份芡葉片樣品，4份雞王蓮葉片樣品（克魯茲王蓮與芡的雜交材料，暫定名為雞王蓮）。芡樣品包括1份刺芡、3份蘇芡、7份芡的雜交材料，具體見表1。為了對(duì)芡雜交材料的品質(zhì)性狀進(jìn)行研究，取其中5個(gè)雜交材料（編號(hào)分別為10、11、12、14和15）進(jìn)行品質(zhì)性狀分析。

1.2 基因組DNA提取

采用植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取植物基因組總DNA。

1.3 AFLP分析

①采用EcoRⅠ，MseⅠ對(duì)植物基因組總DNA進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系：4 μL 10×Buffer（Tango），4 μL DNA（50 ng/μL），0.3 μL EcoRⅠ（10 U/μL），11.4 μL ddH2O。37℃酶切消化3 h，65℃酶切消化3 h。

②采用T4 DNA連接酶對(duì)雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系：12.5 μL Double digested DNA，2.5 μL 10×Buffer,1.5 μL MseⅠadapters（10 μmol/L），1.5 μL EcoRⅠadapters（10 μmol/L），0.4 μL T4 DNA ligase（5 U/μL），6.6 μL ddH2O。在冰箱中4℃連接反應(yīng)16 h。此連接產(chǎn)物稀釋10倍。所用接頭序列為mad5 5'-GAC GAT GAG TCC TGA G-3'，mad3 5'-TAC TCA GGA CTC AT-3'，ead5 5'-CTC GTA GAC TGC GTA CC-3'，ead3 5'-AAT TGG TAC GCA GTC TAC-3'。

③預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系：2 μL MgCl2（20 mmol/L），2.5 μL 10×Buffer，2 μL MC00（10 μmol/L），2 μL EA00（10 μmol/L），2 μL dNTPs（10 mmol/L），1 μL Taq DNAPolymerase（2U/μL），5μLDilutedDNATemplate，8.5 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?4℃2 min；進(jìn)入20個(gè)循環(huán)，94℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min；最后于72℃延伸5 min。

④選擇性擴(kuò)增：取預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，加入ddH2O稀釋至50 μL，反應(yīng)體系：2.5 μL 10×Buffer，2 μL MgCl2（20mmol/L），1.2μLdNTPs（10mmol/L），0.5 μL Taq DNA Polymerase（2 U/μL），1 μL MCNN/CMCNN（10 μmol/L），1 μL EANN/ENN （10 μmol/L），1.5 μL Diluted DNA Template，16.3 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?4℃5 min；進(jìn)入10個(gè)循環(huán)，94℃30 s，65℃1 min（每循環(huán)降低0.7℃），72℃ 1 min；再進(jìn)入30個(gè)循環(huán)，94℃30 s，56℃1 min，72℃1min；最后于72℃延伸5min。

⑤加入10 μL的變性劑（98%甲酚胺，0.03%溴酚藍(lán)和二甲苯氰），于94℃變性3 min，采用6%的變性聚丙烯凝膠，1×TBE緩沖液，70 W恒功率電泳3 h，銀染檢測(cè)電泳結(jié)果。

⑥從30對(duì)引物中篩選出13對(duì)條帶清晰引物，用此13對(duì)引物對(duì)16個(gè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增。

1.4 SRAP分析

①取提取的基因組總DNA 5 μL，加ddH2O稀釋至100 μL，反應(yīng)體系：1.25 μL 10×Buffer（Containing Mg2+），0.6 μL dNTPs（10 mmol/L），0.5 μL Taq DNA Polymerase（2U/μL），0.5μLForwardprimers（10μmol/L），0.5 μL Reverse primers（10 μmol/L），1 μL DNA Template，10.65 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?5℃5min；進(jìn)入5個(gè)循環(huán)，95℃1min，35℃1 min，72℃1 min；再進(jìn)入35個(gè)循環(huán)，95℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min；最后于72℃延伸10 min。

②加入10 μL的變性劑，于94℃變性3 min，采用6%的變性聚丙烯凝膠，1× TBE緩沖液，70 W恒功率電泳3 h，銀染檢測(cè)電泳結(jié)果。

③從30對(duì)引物中篩選出9對(duì)條帶清晰引物，用此9對(duì)引物對(duì)16個(gè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增。

1.5 分子標(biāo)記數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果，有帶記為1，無帶記為0，缺失記為2。將0，1，2矩陣數(shù)據(jù)輸入電腦，應(yīng)用UPGMA對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行聚類分析并采用NTSYSpc（Version 2.02a）軟件處理，建立聚類圖。

1.6 品質(zhì)性狀測(cè)定與分析

對(duì)5份芡的雜交材料的品質(zhì)性狀進(jìn)行了測(cè)定，包括維生素C、可溶性糖、淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)、水分、鐵、鈣、鉀的含量。以上檢測(cè)委托重慶市永川區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心進(jìn)行。對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行聚類分析并采用NTSYSpc（Version 2.02a）軟件處理，建立聚類圖。

表1 本試驗(yàn)所用的16份材料

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP分析

13對(duì)引物共產(chǎn)生490條清晰條帶，447條為多態(tài)性條帶（91.22%）。

根據(jù)這13對(duì)多態(tài)性引物的擴(kuò)增結(jié)果，對(duì)16份材料進(jìn)行聚類分析（圖1），結(jié)果如下。

克魯茲王蓮與其他材料 （包括雞王蓮）Jaccard相似系數(shù)僅為0.20。芡（包括雞王蓮）材料間的相似系數(shù)為0.90~0.99。在相似系數(shù) 0.90處分為 2個(gè)類群，類群Ⅰ包括大部分材料，類群Ⅱ包括14號(hào)一個(gè)雜交材料樣品。在相似系數(shù)為 0.95處分為 3個(gè)類群，類群ⅠA包括 2號(hào)、3號(hào)和4號(hào)雞王蓮與9號(hào)蘇芡，類群ⅠB包括5號(hào)雞王蓮與12號(hào)、13號(hào)雜交材料，類群ⅠC包括6號(hào)刺芡，7號(hào)、8號(hào)蘇芡和 10號(hào)、11號(hào)、15號(hào)、16號(hào)雜交材料。

從這3類材料的聚類樹系圖（圖2）中可以看出，雞王蓮材料與芡材料的關(guān)系更為密切。

2.2 SRAP分析

9對(duì)引物共產(chǎn)生 162條清晰條帶，151條為多態(tài)性條帶（93.21%）。

根據(jù)這9對(duì)多態(tài)性引物的擴(kuò)增結(jié)果，對(duì)16份材料進(jìn)行聚類分析（圖3），結(jié)果如下。

克魯茲王蓮與其他種（包括雞王蓮）的Jaccard相似系數(shù)僅為0.38，芡（包括雞王蓮）材料間的相似系數(shù)為0.80~0.93。在相似系數(shù)0.80處分為2個(gè)類群，類群Ⅰ包括大部分材料，類群Ⅱ包括14號(hào)一個(gè)雜交材料樣品。在相似系數(shù)為0.85處分為3個(gè)類群，類群ⅠA包括2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)和5號(hào)雞王蓮與8號(hào)蘇芡，類群ⅠB包括9號(hào)、10號(hào)、12號(hào)和13號(hào)雜交材料，類群ⅠC包括6號(hào)刺芡，7號(hào)蘇芡和11號(hào)、15號(hào)、16號(hào)雜交材料。從這3類材料的聚類樹系圖（圖4）中可以看出，雞王蓮材料與芡材料的關(guān)系更為密切。

2.3 品質(zhì)性狀分析

對(duì)5份芡雜交材料進(jìn)行品質(zhì)性狀檢測(cè)（表2）。

由圖5可以看出，各雜交材料間的遺傳距離為0.01～0.02，在遺傳距離0.012處將5個(gè)雜交材料分為三大類，即10號(hào)雜交材料單獨(dú)一類，11號(hào)和12號(hào)雜交材料聚為一類，14號(hào)和15號(hào)雜交材料聚為一類。這一結(jié)果與AFLP和SRAP的結(jié)果均不一致。由此可以看出，利用品質(zhì)性狀數(shù)據(jù)算出的聚類遺傳距離很近，難以分辨各雜交材料的遺傳和分類地位。

圖1 根據(jù)AFLP 13對(duì)多態(tài)性引物擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行16份材料的聚類樹系分析

圖2 根據(jù)AFLP 13對(duì)多態(tài)性引物擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行3類材料的聚類樹系分析

圖3 根據(jù)SRAP 9 對(duì)多態(tài)性引物擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行16 份材料的聚類樹系分析

圖4 根據(jù)SRAP 9對(duì)多態(tài)性引物擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行3類材料的聚類樹系分析

表2 參試材料品質(zhì)性狀檢測(cè)結(jié)果

圖5 5份雜交材料品質(zhì)性狀的聚類樹系分析

3 小結(jié)與討論

AFLP與SRAP的聚類結(jié)果均支持克魯茲王蓮與芡為不同的種，克魯茲王蓮與其他材料（包括雞王蓮）之間的遺傳Jaccard相似系數(shù)分別僅為0.20和0.38。雞王蓮是蘇州市蔬菜研究所創(chuàng)制的新種質(zhì)，2007年以克魯茲王蓮為父本、紫花蘇芡與刺芡雜交F4代為母本雜交后逐年選種，至2011年，雜交后代植株性狀除葉片邊緣上翹明顯如王蓮?fù)?，其他性狀與芡實(shí)差異較小。在SRAP的聚類結(jié)果中，雞王蓮全部聚在一起，除了8號(hào)蘇芡外，雞王蓮與其他芡材料均有一定的差別；在AFLP的聚類結(jié)果中，大部分雞王蓮（2號(hào)，3號(hào)，4號(hào)）材料與9號(hào)蘇芡聚為一類，5號(hào)雞王蓮與12號(hào)、13號(hào)芡雜交材料聚為一類。分子標(biāo)記分析結(jié)果說明，通過芡與克魯茲王蓮的雜交，其雜交后代——雞王蓮仍然是芡，但可能獲得了克魯茲王蓮的部分遺傳物質(zhì)，而且每個(gè)材料所獲得的遺傳物質(zhì)多少和類型存在差異，導(dǎo)致在聚類時(shí)雞王蓮整體上偏向芡，而又有部分差別。

AFLP和SRAP分析結(jié)果顯示，種間的遺傳相似系數(shù)較低，而芡種內(nèi)材料間的遺傳相似系數(shù)較高，但是AFLP分析中的種間遺傳相似系數(shù)比在SRAP分析中更低，而芡種內(nèi)材料間的系數(shù)更高，說明對(duì)于芡與克魯茲王蓮而言，AFLP更容易分辨種間的差異，而不容易發(fā)現(xiàn)芡種內(nèi)材料間的差異。SRAP則正好相反，可能是因?yàn)锳FLP與SRAP在基因組上擴(kuò)增位置的不同，導(dǎo)致AFLP和SRAP聚類結(jié)果略有不同。從品質(zhì)性狀的聚類結(jié)果可以看出，這5個(gè)芡雜交材料的遺傳背景較近，各個(gè)材料的營(yíng)養(yǎng)成分沒有很大的差別，聚類結(jié)果也與AFLP和SRAP的結(jié)果不一致。

目前，雞王蓮選育走兩個(gè)方向，一是按芡實(shí)方向選育芡實(shí)新品種，追求果粒大、殼薄、米仁大、產(chǎn)量高；二是按王蓮方向選育，翹邊明顯，觀賞為主。

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Genetic Analysis and Evaluation ofEuryale feroxGermplasm Resources and Their Hybrid Progenies

YOU Yongning1,YIN Yulai2,DIAO Ying1,SUN Fangfang2,ZHENG Xingfei1,ZHOU Mingquan3, BAO Zhongzhou2,HU Zhongli1
(1.College of Life Sciences,Wuhan University,430072; 2.Suzhou Vegetable Research Institute;3.Hubei Lotus Engineering Technology Research Center)

In this research,two DNA molecular markers AFLP and SRAP were used to study genetic relationships of elevenEuryale feroxresources withVictoria cruzianaand four hybrids ofV.cruzianaandE.ferox.Thirteen pairs of AFLP primers showed 490 bands,including 447 polymorphic bands (91.22%),and nine pairs of SRAP primers showed 162 bands,including 151 polymorphic bands(93.21%).The clustering tree showed thatV.cruzianaclearly separated with other fifteen samples and there also had some differences between the elevenE.feroxsamples and the four hybrids.At the same time,fiveE.feroxsamples were provided to take the quality testing,and the cluster analysis was carried out on the basis of these data.The results showed that genetic distances among the materials were very near,and the nutrient variations were difficult to be used to distinguish the genetic and taxonomic status of the materials.

Germplasm resources;Euryale ferox;Victoria cruziana;Molecular markers;Quality properties

10.3865/j.issn.1001-3547.2012.16.008

江蘇省蘇州市科技計(jì)劃項(xiàng)目“蘇州幾種特色水生蔬菜種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與利用”（YJG0909）

游永寧（1986－），男，博士研究生，主要從事植物遺傳學(xué)、植物種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究

鮑忠洲，通信作者，E-mail：baozz1942@163.com

2012-06-30