歐陽冬梅，劉凰，徐金星，劉春華，鄒東旺，楊良波，唐記平，謝克強(qiáng)

（1.江西廣昌縣白蓮產(chǎn)業(yè)發(fā)展局，344900；2.廣昌縣白蓮科學(xué)研究所）

基于SRAP標(biāo)記的蓮種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

歐陽冬梅1，劉凰1，徐金星2，劉春華2，鄒東旺1，楊良波2，唐記平1，謝克強(qiáng)1

（1.江西廣昌縣白蓮產(chǎn)業(yè)發(fā)展局，344900；2.廣昌縣白蓮科學(xué)研究所）

利用SRAP標(biāo)記對來自國內(nèi)外蓮主要產(chǎn)區(qū)在20世紀(jì)初期育出、并在蓮育種中具有重要利用價(jià)值的40份蓮屬材料進(jìn)行了分析。11對引物在40份材料中共擴(kuò)增了184條條帶，多態(tài)性條帶127條，多態(tài)性頻率為69.0%，表明蓮屬具有豐富的遺傳多樣性。聚類分析結(jié)果表明，蓮屬種質(zhì)資源可分為3大類群，這與傳統(tǒng)意義上的形態(tài)學(xué)分類相一致。且40份蓮品種（材料）表現(xiàn)出很強(qiáng)的地域相似性，這說明來自同一個(gè)地域內(nèi)的品種（材料）分化程度低，遺傳多樣性不豐富，極易造成品種單一化。

蓮；SRAP；遺傳多樣性分析

我國是蓮的原產(chǎn)地之一，蓮在我國不僅栽培歷史悠久，而且分布廣泛，且是最具特色、栽培面積最大、品種資源最豐富的水生經(jīng)濟(jì)作物[1]。迄今為止，中國擁有花蓮品種資源800多個(gè)[2]，藕蓮品種和子蓮品種資源分別數(shù)十個(gè)。蓮是常異花授粉植物，不同品種間的基因交流很容易通過昆蟲的授粉來完成，導(dǎo)致品種間遺傳資源的混合和品種內(nèi)的遺傳差異較大[3]。目前，我國蓮?fù)N異名現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，同一地區(qū)品種單一化現(xiàn)象嚴(yán)重，大大增加了蓮栽培的風(fēng)險(xiǎn)性。為了避免這一現(xiàn)象，選取了40份代表性品種（材料）進(jìn)行SRAP遺傳多樣性分析，以期明確它們的遺傳背景，探討全國各地主要傳統(tǒng)型品種與廣昌縣現(xiàn)有栽培品種的關(guān)系，從而為蓮品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用40份蓮品種（材料）為國內(nèi)外蓮主要產(chǎn)區(qū)在20世紀(jì)初期廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)的優(yōu)異材料。材料取自廣昌縣白蓮科學(xué)研究所博覽園內(nèi)。這40份材料包括野生蓮、全國各地傳統(tǒng)品種、廣昌縣現(xiàn)栽培品種和花蓮品種，材料詳細(xì)信息見表1。

1.2 樣品制備

采集蓮幼嫩葉片置于塑料袋中（自封袋），再加入變色硅膠，搖動(dòng)使葉片與硅膠充分均勻接觸。一般來說，硅膠與葉片質(zhì)量比應(yīng)為10∶1，以保證葉片在12 h內(nèi)干燥，一旦發(fā)現(xiàn)硅膠從深藍(lán)變?yōu)榉奂t，及時(shí)更換硅膠，干燥的葉片材料在室溫下保存即可。

1.3 DNA的提取

選取上述硅膠干燥的葉片30 mg，用液氮磨成粉狀，再用DNA提取試劑盒提取植物基因組DNA。DNA質(zhì)量檢測用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行，電泳緩沖液為0.5×TBE，電壓100 V，電泳30 min。

1.4 SRAP分析

PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為15 μL，反應(yīng)混合液中包括：50 ng/μL DNA模板1 μL，10×PCR buffer 1.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.6 μL，10 mmol/L上下游引物各0.5 μL，2 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL，不足部分用無菌水補(bǔ)充。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5℃5 min；95℃1 min，35℃ 1 min，72℃ 1 min，5個(gè)循環(huán)；95℃ 1 min，50℃1 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min，溫度降到4℃即完成擴(kuò)增。

擴(kuò)增產(chǎn)物加上10 μL的上樣緩沖液94℃預(yù)變性5 min，采用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠，0.5× TBE緩沖液，65 W恒功率電泳1.5 h。銀染檢測電泳結(jié)果。

1.5 SRAP數(shù)據(jù)處理

對各蓮材料各引物擴(kuò)增情況作統(tǒng)計(jì)，有帶記為1，無帶記為0，缺失記為2。作矩陣圖輸入計(jì)算機(jī)，應(yīng)用平均距離法進(jìn)行聚類分析，并采用NTSYS-pc（Version 2.1）軟件處理，建立聚類圖。

表1 試驗(yàn)材料信息

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性分析

從40對SRAP引物中篩選出11對擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性適中的引物對這40份材料進(jìn)行擴(kuò)增，11對引物共擴(kuò)增產(chǎn)生184條帶，平均每個(gè)引物對擴(kuò)增出16.7條。其中多態(tài)性條帶127條，多態(tài)性頻率為69.0%。不同引物對多態(tài)性頻率差異較大，多態(tài)性頻率最高的為 EM14+ME10和 EM11+ME10，為100%，多態(tài)性頻率最低的為EM9+ME10，為52.6%（表 2）。

2.2 指紋圖譜的構(gòu)建

以“0”“1”和“2”分別表示擴(kuò)增的“有”、“無”和“缺失”，將11對多態(tài)性引物產(chǎn)生的127個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行排序，形成一個(gè)數(shù)據(jù)距陣（表3），建立品種計(jì)算機(jī)化的DNA指紋，以區(qū)分供試品種（材料）。結(jié)果顯示，每一份種質(zhì)都有自己獨(dú)特的指紋圖譜。

2.3 聚類結(jié)果

根據(jù)這 11對多態(tài)性引物的擴(kuò)增結(jié)果，經(jīng)NTSYS-pc聚類分析，得出品種（材料）間的聚類圖（圖1）。結(jié)果表明，各品種 （材料）間相似系數(shù)在0.68～0.93。其中以雪湖貢蓮和馬當(dāng)蓮的相似系數(shù)最大，為0.93，說明它們之間的遺傳差異很小。在相似系數(shù)為0.79的位置，可將參試品種分為三大類。第Ⅰ類包括大部分野生蓮品種和一個(gè)花蓮品種（桌上蓮）；第Ⅱ類包括泰國野生蓮Ⅳ、Ⅵ，傳統(tǒng)子蓮品種和一個(gè)子蓮花蓮兼用品種（星空牡丹）；第Ⅲ類為花蓮品種。

表2 11對SRAP引物對的多態(tài)性比較

另外，從聚類圖上還可以看出，各種質(zhì)材料的聚類結(jié)果與地理位置有一定的聯(lián)系，來自同一個(gè)地方的種質(zhì)除個(gè)別外（如泰國野生蓮Ⅳ和Ⅵ），大部分都聚在了一起。這反映出同一個(gè)地方的品種材料的親本可能相同或者相近，表明同一地區(qū)品種單一化程度較高。

表3 部分材料對引物EM3+ME6和EM10+ME11的擴(kuò)增結(jié)果

3 小結(jié)與討論

SRAP （seq uence-related amplified polymorphism，特征序列擴(kuò)增多態(tài)性），以全基因組為靶標(biāo)，通過設(shè)計(jì)的引物對ORFs（open reading frames）進(jìn)行擴(kuò)增，上游引物對外顯子進(jìn)行特異性擴(kuò)增，下游引物對內(nèi)含子區(qū)域、啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增。與其他分子標(biāo)記相比，該標(biāo)記具有簡便、穩(wěn)定、中等產(chǎn)率的特點(diǎn)，是一種較理想的分子標(biāo)記[4，5]。本研究利用11對SRAP標(biāo)記基本區(qū)分了40份蓮品種材料，證明了SRAP標(biāo)記應(yīng)用于蓮種質(zhì)資源鑒定的可行性。雪湖貢蓮和馬當(dāng)蓮相似系數(shù)為0.93，可能由于供試品種之間很相似，或是因?yàn)楣┰嚻贩N較多，而可用的SRAP引物有限，兩者的特異性條帶較少，使這兩個(gè)品種未能很好地分開。

圖1 40份蓮品種材料的聚類樹系分析

蓮在我國栽培歷史悠久，依據(jù)其利用目的已明顯演化為三大類群：子蓮、藕蓮和花蓮。在本研究中，40份蓮品種材料也分為三大類，與園藝學(xué)分類系統(tǒng)相吻合[6]，說明蓮三大類型之間遺傳分化十分明顯。

本研究中來自全國各地的野蓮材料表現(xiàn)為葉片厚實(shí)、花無或少量、不結(jié)實(shí)或瓣化，在農(nóng)藝性狀上與藕蓮極其相似，生產(chǎn)上習(xí)慣將它們劃分為藕蓮品種，泰國野生蓮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ，在農(nóng)藝性狀上也與藕蓮相似，在聚類圖上得到了證實(shí)，與野生蓮聚在了第Ⅰ類群。而泰國野生蓮Ⅳ和Ⅵ在農(nóng)藝性狀上與子蓮相似，表現(xiàn)為花多且結(jié)實(shí)，在聚類圖中與傳統(tǒng)子蓮品種聚在第Ⅱ類群。這說明泰國野生蓮品種之間遺傳背景差異較大，在利用這些野生蓮品種進(jìn)行育種時(shí)，需根據(jù)育種目標(biāo)的不同，選擇不同的材料做親本。同時(shí)也說明，分子鑒定應(yīng)該與形態(tài)學(xué)分類相結(jié)合，兩者互相佐證，才能在分類上更加準(zhǔn)確可信。我們還發(fā)現(xiàn)本研究中的40份蓮品種材料表現(xiàn)出很強(qiáng)的地域相似性，與前人的研究結(jié)果相似[7]，這說明來自同一個(gè)地域內(nèi)的品種分化程度低，遺傳多樣性不豐富，極易造成品種單一化，在生產(chǎn)上需多加注意。

在本研究中，古代蓮和野生蓮聚成一類，古代蓮是考古出土的千年古蓮子萌發(fā)繁育的后代，野生蓮生長在自然湖泊中，很少有人工馴化積累的變異，而藕蓮在長期的栽培過程中，只以產(chǎn)藕為馴化目的。野蓮分布很廣，前人一致認(rèn)為野蓮是現(xiàn)在栽培蓮的共同祖先，根據(jù)聚類結(jié)果，野蓮與藕蓮的遺傳差異相對較小，暗示藕蓮可能是由野生蓮直接馴化而來[8]。

[1]柯衛(wèi)東，李峰，劉玉平，等.我國蓮資源及育種研究綜述（上）[J].長江蔬菜，2003（4）：5-9.

[2]張行言.中國荷花新品種圖志Ⅰ[M].北京：中國林業(yè)出版社，2011.

[3]瞿楨，魏英輝，李大威，等.蓮品種資源的SRAP遺傳多樣性分析[J].氨基酸與生物資源，2008，30（3）：21-25.

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[7]郭宏波.蓮屬（Nelumbo）資源分類[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[8]向巧彥.蓮種質(zhì)資源遺傳多樣性研究及DNA指紋圖譜構(gòu)建[D].北京：北京林業(yè)大學(xué)，2008.

Genetic Diversity Analysis ofNelumboAccessions Based on SRAP Markers

OUYANG Dongmei1,LIU Huang1,XU Jinxing2,LIU Chunhua2,ZOU Dongwang1, YANG Liangbo2,TANG Jiping1,XIE Keqiang1
(1.Guangchang Industrial Development Bureau of White Lotus,Jiangxi 344900;2.Guangchang White Lotus Research Institute)

40Nelumboaccessions were analyzed with SRAP markers to estimate their genetic diversity.184 bands were obtained from 11 pairs of selected primers,and 127 bands were polymorphic,with the polymorphic rate of 69.0%,which indicated that the genetic diversity ofNelumbowas very rich.The results showed that all the materials could be divided into 3 groups,which was similar to the results of the traditional morphological classification by horticultural characteristics. Regional similarity was observed among the 40 materials,and the materials from the same region had low differentiation degree and poor genetic diversity,which easily resulted in the simplification of theNelumboaccessions.

Nelumbo;SRAP;Genetic diversity analysis

10.3865/j.issn.1001-3547.2012.16.010

國家公益性行業(yè)（水生蔬菜）科研專項(xiàng)子項(xiàng)目（200903017-05）資助

歐陽冬梅（1983-），女，研究生，助理農(nóng)藝師，主要從事子蓮育種

謝克強(qiáng)，通信作者，E-mail：xiekeqiang@126.com

2012-07-08