喻艷，王輝，2（.內江師范學院生命科學學院，四川，642；2.四川省高等學校特色農(nóng)業(yè)資源研究與利用重點實驗室）

黃瓜單倍體培養(yǎng)的研究進展

喻艷1，王輝1，2
（1.內江師范學院生命科學學院，四川，641112；2.四川省高等學校特色農(nóng)業(yè)資源研究與利用重點實驗室）

綜述了近幾年來人工培養(yǎng)誘導產(chǎn)生黃瓜單倍體的研究進展，包括黃瓜單倍體的主要獲得途徑、影響黃瓜單倍體培養(yǎng)的主要因素和黃瓜單倍體培養(yǎng)中存在的問題，并對黃瓜單倍體培養(yǎng)前景進行了展望。

黃瓜；單倍體培養(yǎng)；影響因素；研究進展

單倍體培養(yǎng)是一種縮短有性育種周期、提高育種效率、快速選育植物新品種的途徑，其中花藥培養(yǎng)是人工誘導獲得單倍體和純合多倍體的有效途徑之一。近年來花藥離體培養(yǎng)的研究進展很快，目前已經(jīng)有多種植物通過花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株，其中以十字花科、茄科和禾本科植物居多[1，2]。在葫蘆科蔬菜中，從20世紀80年代初開始，國內外已有不少研究單位相繼開展了西瓜和甜瓜的花藥培養(yǎng)研究。1974年，西貞夫首先對黃瓜花藥培養(yǎng)進行了研究，并誘導出愈傷組織，分化出莖葉器官[3]。謝淼等[4]、谷佳南等[5]也相繼開展了黃瓜花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導及再生的研究。綜述了近幾年國內外黃瓜單倍體培養(yǎng)的主要途徑、影響因素及存在的問題，為進一步開展黃瓜單倍體培養(yǎng)提供理論參考。

1 黃瓜單倍體的獲得途徑

1.1 體內發(fā)生途徑

體內發(fā)生即從胚囊內產(chǎn)生單倍體，包括自發(fā)產(chǎn)生、假受精、半受精、孤雄生殖和孤雌生殖等。自發(fā)產(chǎn)生單倍體的現(xiàn)象，在油菜中經(jīng)常出現(xiàn)[6]。假受精即雌配子或雌性細胞經(jīng)花粉或雄核刺激后未受精而產(chǎn)生單倍體植株，如玉米品種間雜交，馬鈴薯、苜蓿、煙草和楊樹等的種間雜交都有此現(xiàn)象。半受精是雌雄配子都參與胚胎發(fā)生，但不發(fā)生核融合，因而產(chǎn)生具父母本來源的嵌合體植株。孤雄生殖是卵細胞不受精，卵核消失，或卵細胞在受精前失活，由精核在卵細胞內單獨發(fā)育成單倍體，因此只含有一套雄配子染色體，這類單倍體的發(fā)生頻率很低。孤雌生殖即精核進入卵細胞后未與卵核融合而退化，卵核未經(jīng)受精而單獨發(fā)育成單倍體，在遠緣雜交中有時會出現(xiàn)。體內發(fā)生途徑都是由不正常的受精作用而產(chǎn)生，育種工作中極少通過體內發(fā)生途徑獲得單倍體，主要通過離體誘導途徑獲得。

1.2 離體途徑

①花藥、花粉培養(yǎng) a.外植體的采集時間和預處理。外植體的采集時間是決定單倍體是否能誘導成功的關鍵。不同種類的植物進行花藥培養(yǎng)，其外植體的采集時間不同。單核期之前的花藥結構較小、質地幼嫩易破碎，不易取材；單核期之后的花藥因花瓣開始松動，微生物可能侵入花藥，給材料消毒帶來困難，所以一般選擇處于單核期的花藥進行單倍體誘導。而黃瓜花藥培養(yǎng)外植體的采集時間多為單核中后期[4，7]。

采摘的花蕾經(jīng)鏡檢合格后還需要進行預處理，以改變小孢子的發(fā)育方向，使盡可能多的小孢子從配子體發(fā)育途徑轉向孢子體發(fā)育途徑，即成為具胚胎發(fā)生潛力的小孢子。不同植物預處理的方法各不相同，主要包括：低溫、高溫、化學物質、離心、射線等。谷佳南等[5]的研究表明，在4℃低溫條件下預處理72 h的黃瓜花藥培養(yǎng)效果最佳。

b.愈傷組織和胚狀體的誘導。預處理后的花藥經(jīng)常規(guī)滅菌后要進行再生植株誘導。而愈傷組織和胚狀體的誘導是形成再生植株的2條途徑：即花藥→愈傷組織→分化叢生芽→再生苗；花藥→胚狀體→分化叢生芽→再生苗。在黃瓜花藥培養(yǎng)上多采用第一條途徑形成再生植株。

②子房—胚珠培養(yǎng) a.外植體的采集時間和預處理。外植體的采集時間一般為開花前1 d或2 d，在誘導效率上沒有明顯差異[7]。外植體的預處理根據(jù)基因型不同而不同，一般華北型和腌漬型可直接進行誘導[7]。

b.胚狀體誘導。胚狀體誘導選擇MS培養(yǎng)基，附加NAA 0.1mg/L、2，4-D 4.0mg/L、6-BA 1.0mg/L和3%蔗糖[7]。胚狀體形成過程中的關鍵因素除了培養(yǎng)基的配比外，還要注意光照條件和溫度條件?？烧{節(jié)光周期為14 h/10 h，溫度以25℃為宜。葉永亮等[7]將未完全成熟的黃瓜種子綠胚接種在MS+6-BA 0.2mg/L的培養(yǎng)基上，成功誘導形成了胚狀體。

2 影響黃瓜單倍體培養(yǎng)的因素

2.1 外植體的采集時間

不同植物或同一種植物的不同品種，選擇小孢子的發(fā)育時期各不相同。一般認為，黃瓜單倍體誘導多選擇單核中后期的小孢子進行培養(yǎng)[7，8]。但谷佳南等[5]對自交7代的10個黃瓜品種的花藥小孢子不同發(fā)育時期進行了誘導，結果表明，單核中期的小孢子誘導率最高，且品種間有較小的差異。分析原因可能與品種的基因型及植株的生長環(huán)境有關。

2.2 接種前的預處理

接種前的預處理對愈傷組織誘導有明顯的影響，特別是在誘發(fā)小孢子脫分化方面作用十分明顯。是否適時適溫預處理對黃瓜愈傷組織誘導率有一定影響[8]。蘇華等[8]的研究發(fā)現(xiàn)（表1），供試黃瓜花藥經(jīng)4℃低溫處理24 h的誘導率較對照 （CK）略高，但差異不明顯，且隨著處理時間的增加，其誘導率逐漸下降，但對照下降得更快；經(jīng)過48 h預處理的花藥愈傷組織的誘導率比對照48 h的顯著提高；而經(jīng)32℃高溫處理的花藥材料誘導率均低于對照，其結果表明，黃瓜花藥經(jīng)低溫預處理24～48 h有利于愈傷組織的誘導，高溫預處理不利于黃瓜愈傷組織的誘導，一般以低溫預處理24 h為好。

2.3 生長調節(jié)物質

研究表明，花藥離體培養(yǎng)過程中，生長調節(jié)物質配比及其含量對愈傷組織的誘導具有重要作用，能顯著影響誘導率，對愈傷組織的起源有重要調控作用[9～11]。其中代表性的激素為細胞分裂素（TDZ、6-BA、KT等）和生長素類（NAA、IAA、IBA、2，4-D等）。在使用過程中，一般幾種生長調節(jié)物質配合使用比單獨使用效果顯著。

谷佳南等[5]對10個品種的黃瓜花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導時開展了6-BA、NAA和2，4-D的濃度配比試驗，結果表明，在6-BA濃度相同的情況下，B5培養(yǎng)基上添加2，4-D的誘導效果優(yōu)于NAA，其中以0.25 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D的誘導效果較好，愈傷組織誘導率達54.39%，但有小部分愈傷組織老化并變褐，而在上述培養(yǎng)基中添加1.0mg/L AgNO3對抑制愈傷組織老化有明顯效果，愈傷組織誘導率增加到72.82%，其中M25和M7品種的誘導率分別為100%和93.33%。說明在B5培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L 2，4-D和1.0 mg/L AgNO3誘導愈傷組織效果較好，且有明顯抑制其變褐老化的作用。這可能與AgNO3抑制乙烯的形成，促進多胺的合成，從而提高胚性愈傷組織的形成有關[12]。

2.4 其他培養(yǎng)基成分

基本培養(yǎng)基種類、無機成分及配比、有機成分等的變化對黃瓜離體培養(yǎng)中愈傷組織的產(chǎn)生同樣具有重要作用。有機碳源不但可以提供能源，還可作為滲透調節(jié)物質，對培養(yǎng)效果影響明顯。多個試驗結果表明，用麥芽糖替代蔗糖常常能取得更好的培養(yǎng)效果[13～15]，但對同源四倍體水稻而言，以60 g/L蔗糖為碳源時誘導效果最好[3]。在黃瓜單倍體培養(yǎng)方面，以蔗糖為碳源時誘導效果較好[5，7]。

2.5 消毒方法

喬奇等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，消毒方法對花藥愈傷組織的形成有一定影響。一般采用的消毒方法是用75%的乙醇浸泡30 s后再用無菌水沖洗3～5次，谷佳南等[5]在進行黃瓜花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導及再生的研究時即采用的這種方法。

表1 不同處理方式對黃瓜花藥愈傷組織誘導率的影響

2.6 其他因素

單倍體培養(yǎng)中，愈傷組織的誘導還受多種生理及環(huán)境因子的影響。供試植株的生理狀況對愈傷組織誘導有一定影響，通常情況下幼年植株的花藥對誘導的反應能力較強[8]。另外，組織學研究證實，花藥壁在花粉產(chǎn)生愈傷組織和形成胚的過程中對其有一定影響，只有貼靠在花藥壁附近的花粉才能順利實現(xiàn)脫分化。這說明絨氈層起源的某些重要物質的梯度變化對愈傷誘導有重要影響[16]，但其作用機理仍有待進一步深入研究。

3 黃瓜單倍體培養(yǎng)中存在的問題及展望

目前通過花藥培養(yǎng)已獲得成功黃瓜單倍體，并取得了可喜的進展，但仍然存在誘導率低、重復性差等問題，離建立一套成熟的培養(yǎng)體系還有一定距離。造成以上問題的原因主要有3點：其一，基因型差異較大；其二，培養(yǎng)基中外源調節(jié)劑的種類及其配比關系較難掌握；其三，愈傷組織誘導率及分化率低。

單倍體培養(yǎng)在黃瓜倍性育種、種質資源創(chuàng)新、親本鑒定及分子生物學研究方面具有重大意義[17，18]，但是單倍體育種工作道路艱難，仍需相關研究者不斷努力，探索出愈傷組織誘導效率高且重復性較好的培養(yǎng)基配方，創(chuàng)造利于單倍體生長的優(yōu)越環(huán)境，為黃瓜單倍體育種的后續(xù)研究打下堅實的基礎。

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Research Progress on Cucumber Haploid Culture

YU Yan1,WANG Hui1,2
(1.School ofLife Science,Neijiang Normal University,Sichuan,641112;2.Key Laboratory ofColleges and Universities in Sichuan forResearch and Utilization ofDistinctive Agricultural Undertakings)

This paper briefly reviewed the research progress on producing cucumber haploid by the artificial culture, including themain ways to get cucumber haploid,main factors influencing the cucumber haploid culture,existing problems and prospects of cucumber haploid culture.

Cucumber;Haploid culture;Influencing factors;Research progress

10.3865/j.issn.1001-3547.2012.18.002

四川省教育廳科研項目（10ZA014），內江市科技支撐計劃項目（2010）

喻艷（1990-），女，本科在讀，專業(yè)為生物技術，電話：18728102967，E-mail：yuyanmwc@163.com

王輝（1982-），男，碩士，助理研究員，研究方向為植物遺傳育種，E-mail：whscnj@126.com

2012-06-28