范愛麗，張魯剛

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊陵，712100；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所）

橙色大白菜遺傳轉(zhuǎn)化體系的初步建立

范愛麗1，2，張魯剛1

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊陵，712100；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所）

以06J28橙色大白菜子葉段為外植體，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)CMS7311-orf224基因，探討了潮霉素、頭孢霉素、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、農(nóng)桿菌濃度、感菌時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間等因素對(duì)橙色大白菜遺傳轉(zhuǎn)化的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，子葉段預(yù)培養(yǎng)2～3 d后，在OD600值為0.3～0.5的農(nóng)桿菌EHA-105菌液中侵染5min，再共培養(yǎng)2～3 d，在培養(yǎng)基中加入5mg/L Hyg（抗性篩選）和500mg/LCef（脫菌）可得到轉(zhuǎn)化植株。試驗(yàn)初步建立了橙色大白菜遺傳轉(zhuǎn)化體系，為大白菜種質(zhì)資源創(chuàng)新奠定了基礎(chǔ)。

橙色大白菜；CMS7311-orf224基因；遺傳轉(zhuǎn)化

利用DNA重組技術(shù)可使目標(biāo)基因在不同植物間轉(zhuǎn)移，突破了遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙，且保持了受體本身主要性狀不被改變，然而遺傳轉(zhuǎn)化效率與植物基因型等密切相關(guān)。橙色大白菜口感好、營養(yǎng)豐富、抗病毒病等病害，商品性好，是適應(yīng)性較廣的彩色大白菜新品種[1]。但由于A基因型限制，大白菜在遺傳轉(zhuǎn)化中存在周期長、轉(zhuǎn)化頻率低及重復(fù)性差等問題，制約了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在大白菜育種中的應(yīng)用[2，3]。本文在已建立的大白菜再生體系的基礎(chǔ)上[4]，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)CMS7311-orf224基因[5]，研究潮霉素（Hygromycin B，Hyg）、頭孢霉素（Cefotaxime，Cef）、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、農(nóng)桿菌濃度、感菌時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間等對(duì)橙色大白菜遺傳轉(zhuǎn)化的影響，初步建立橙色大白菜離體遺傳轉(zhuǎn)化體系，以期為創(chuàng)新大白菜種質(zhì)資源和品種改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

①植物材料、農(nóng)桿菌菌株和質(zhì)粒 植物材料為06J28橙色大白菜，取2片綠色子葉展平、第1片真葉未露出（播種5～6 d）的無菌苗；農(nóng)桿菌菌株為EHA-105；質(zhì)粒T-DNA區(qū)含有CaMV35S啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的Hyg、GUS和CMS7311-orf224基因。

②培養(yǎng)基 無菌苗培養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基中添加蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L，pH值5.8；預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基：7.0mg/L 6-BA+0.5mg/LNAA；共培養(yǎng)培養(yǎng)基：5.5mg/L 6-BA+0.5mg/LNAA+5mg/LHyg；篩選培養(yǎng)基：5.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+5mg/L Hyg+500mg/LCef；生根培養(yǎng)基：1/2 MS+0.5 mg/L NAA+5mg/L Hyg+500mg/L Cef；繼代培養(yǎng)基：MS+500mg/L Cef；LB液體培養(yǎng)基：10 g/LTryptone（胰蛋白胨）+5 g/L Yeast extract（酵母提取物）+10 g/L NaCl，pH值7.0（固體培養(yǎng)基加5%的瓊脂）；農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)基：LB+60mg/L Rif（利福平）+ 50mg/L Str（鏈霉素）+50mg/L Kan（卡那霉素），pH值7.2（固體培養(yǎng)基加12.0mg/L的瓊脂）。

1.2 試驗(yàn)方法

①外植體子葉段的獲得 在無菌條件下，保留大白菜單片子葉，在生長點(diǎn)處（即子葉葉柄基部和下胚軸交接處）先橫切，再縱切去除頂芽，同時(shí)切除此子葉頂端的1/3。

②農(nóng)桿菌菌液的制備 從-80℃超低溫冰箱中取出攜帶質(zhì)粒CMS7311-orf224基因的EHA-105菌液，在冰上緩慢融化，然后在超凈工作臺(tái)上用接種環(huán)蘸取少量菌液，在添加Kan 50mg/L、Rif60mg/L和Str50mg/L抗生素的LB固體培養(yǎng)基上劃線；28℃倒置培養(yǎng)48～36 h，菌斑出現(xiàn)后，挑取單菌落接種到含Kan 50mg/L、Rif 60mg/L、Str 50mg/L的LB液體培養(yǎng)基中 （pH值7.2），于28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。取對(duì)數(shù)生長期菌液，在4℃、5 000 r/min條件下離心5 min，棄上清液，取沉淀重新懸浮于10倍MS液體培養(yǎng)基中（pH值5.3），振蕩后稀釋不同濃度作為侵染液。

③影響大白菜遺傳轉(zhuǎn)化主要因素的試驗(yàn) A.Hyg選擇壓的確定。a.無菌條件下，將06J28子葉段分別豎直插入Hyg濃度為0，3，5，7，10 mg/L的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，觀察不定芽分化對(duì)Hyg的敏感性，2周換1次培養(yǎng)基，統(tǒng)計(jì)芽分化數(shù)情況。b.無菌條件下，將06J28幼苗分別豎直插入Hyg濃度為0，3，5，7，10mg/L的生根培養(yǎng)基上，觀察根系生長對(duì)Hyg的敏感性，2周換1次培養(yǎng)基，觀察統(tǒng)計(jì)生根情況。

B.Cef抑菌劑濃度對(duì)抑菌和芽分化的影響。無菌條件下，06J28子葉段經(jīng)農(nóng)桿菌菌液 （OD600值為0.3～0.5）振蕩侵染5 min后，將其取出用無菌濾紙吸干表面的菌液，豎直插入含不同濃度Cef（0，300，400，500，600mg/L）的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上分化。每隔2周換1次培養(yǎng)基，觀察抑菌情況和芽分化情況，篩選最適的Cef濃度。

C.預(yù)培養(yǎng)時(shí)間。無菌條件下，將06J28子葉段分別進(jìn)行 0，1，2，3，4，5，6，7 d的預(yù)培養(yǎng)，后投入OD600值為0.3～0.5的菌液中，振蕩侵染5min后，將其取出用無菌濾紙吸干表面的菌液，豎直插入共培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后，再轉(zhuǎn)接到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上分化。每隔2周換1次培養(yǎng)基，統(tǒng)計(jì)抗性芽數(shù)，分析預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)大白菜遺傳轉(zhuǎn)化的影響。

D.農(nóng)桿菌濃度。制備好的菌液分別用MS液稀釋至 OD600值分別為 0，0.1，0.3，0.4，0.5，0.6（OD600值為1時(shí)，菌液濃度約為8×108個(gè)/mL）。無菌條件下，06J28子葉段經(jīng)預(yù)培養(yǎng)2～3 d后投入OD600值分別為0，0.1，0.3，0.4，0.5，0.6的菌液中振蕩侵染5 min，然后取出用無菌濾紙吸干表面的菌液，豎直插入共培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d，再轉(zhuǎn)接到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上分化，每隔2周換1次培養(yǎng)基，統(tǒng)計(jì)抗性芽數(shù)，分析農(nóng)桿菌濃度對(duì)大白菜遺傳轉(zhuǎn)化的影響。

E.侵染時(shí)間。無菌條件下，06J28子葉段經(jīng)預(yù)培養(yǎng) 2～3 d后投入 OD600值為0.3～0.5的菌液中侵染，時(shí)間分別為1，5，10，15，20，25，30min，其間不停搖動(dòng)。將侵染后的外植體取出，用無菌濾紙吸干表面菌液，豎直插入共培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后，再轉(zhuǎn)接到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上分化，每2周換1次培養(yǎng)基，統(tǒng)計(jì)抗性芽數(shù)，分析侵染時(shí)間對(duì)大白菜遺傳轉(zhuǎn)化的影響。

F.共培養(yǎng)時(shí)間。無菌條件下，06J28子葉段經(jīng)預(yù)培養(yǎng)2～3 d后投入OD600值為0.3～0.5的菌液中，振蕩侵染5 min后，取出用無菌濾紙吸干表面的菌液，豎直插入培養(yǎng)基，在光下分別共培養(yǎng)0，1，2，3，4，5，6，7 d，然后再轉(zhuǎn)接到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上分化，每隔2周換1次培養(yǎng)基，統(tǒng)計(jì)抗性芽數(shù)，分析共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)大白菜遺傳轉(zhuǎn)化的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 Hyg的敏感濃度篩選

①Hyg濃度對(duì)大白菜子葉段不定芽再生的影響 從表1可以看出，Hyg濃度越大，不定芽分化所需時(shí)間越長，芽的生長狀況越差。當(dāng)Hyg濃度低于5mg/L時(shí)有不定芽的分化，而當(dāng)濃度高于7mg/L時(shí)無不定芽的分化。因此選擇5mg/L為Hyg對(duì)子葉段不定芽誘導(dǎo)的臨界點(diǎn)。

②大白菜幼苗生根的Hyg濃度篩選 從表2可看出，Hyg濃度越大，幼苗生長情況越弱，根系出現(xiàn)的時(shí)間越晚。當(dāng)Hyg濃度為5mg/L時(shí)，根系生長受限，植株的生長也受到明顯抑制，故選擇濃度5mg/L為Hyg抑制大白菜幼苗根系生長的臨界濃度。

2.2 Cef抑菌劑對(duì)抑菌效果和芽分化的影響

從表 3可以看出，Cef濃度為 300～600 mg/L時(shí)，濃度越大抑菌效果越明顯，污染率也越低。當(dāng)Cef濃度為500mg/L時(shí)，得到了最多的抗性芽。試驗(yàn)中觀察到Cef濃度低于500mg/L時(shí)，促進(jìn)不定芽發(fā)生，而Cef濃度超過500mg/L時(shí)對(duì)不定芽生長有一定抑制。綜合考慮抑菌效果、污染率和獲得的不定芽數(shù)認(rèn)為，Cef最佳抑菌濃度為500mg/L。

2.3 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)大白菜遺傳轉(zhuǎn)化的影響

從表4可以看出，未進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)的大白菜子葉段有明顯的農(nóng)桿菌污染，而經(jīng)1～7 d預(yù)培養(yǎng)的大白菜子葉段，隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的延長，子葉段感染農(nóng)桿菌的污染率顯著降低，然而抗性芽并沒有隨之增加。綜合比較得出，預(yù)培養(yǎng)子葉段2～3 d有利于大白菜遺傳轉(zhuǎn)化。

表1 Hyg濃度對(duì)大白菜子葉段不定芽再生的影響

表2 大白菜幼苗生根的Hyg濃度篩選

表3 不同Cef濃度的抑菌效果和對(duì)芽分化的影響

2.4 農(nóng)桿菌濃度對(duì)大白菜遺傳轉(zhuǎn)化的影響

表5結(jié)果顯示，農(nóng)桿菌濃度過高或過低都不利于抗性芽再生，當(dāng)OD600值低于0.1時(shí)沒有抗性芽產(chǎn)生，OD600值高于0.7時(shí)觀察到子葉段污染加重，傷口褐化，軟腐增多，沒有抗性芽生成。OD600值為0.3～0.5時(shí)，農(nóng)桿菌對(duì)大白菜子葉段毒害程度最小，外植體無污染且有抗性芽再生，故最適的OD600值為0.3～0.5。

2.5 感菌時(shí)間對(duì)大白菜遺傳轉(zhuǎn)化的影響

從表6可以看出，農(nóng)桿菌侵染時(shí)間短于5min時(shí)，子葉段無污染也沒有抗性芽產(chǎn)生；侵染時(shí)間為5min時(shí)，子葉段無污染且有3個(gè)抗性芽產(chǎn)生；當(dāng)侵染時(shí)間為10min時(shí)，雖有抗性芽產(chǎn)生，但是外植體有70%污染；侵染時(shí)間超過20 min，子葉段全部污染導(dǎo)致死亡。故以5min的侵染效果為最優(yōu)。

2.6 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)大白菜遺傳轉(zhuǎn)化的影響

從表7看出，共培養(yǎng)1～4 d獲到1～3個(gè)抗性芽，無污染的情況下共培養(yǎng)時(shí)間為2～3 d時(shí)抗性芽最多。試驗(yàn)中觀察到，隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長，農(nóng)桿菌過度生長，外植體受感染和褐化嚴(yán)重，再生困難，同時(shí)后繼培養(yǎng)中抑菌相當(dāng)困難。故共培養(yǎng)的最佳時(shí)間為2～3 d。

表4 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)大白菜遺傳轉(zhuǎn)化的影響

表5 農(nóng)桿菌濃度對(duì)大白菜遺傳轉(zhuǎn)化的影響

表6 感菌時(shí)間對(duì)大白菜遺傳轉(zhuǎn)化的影響

表7 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)大白菜遺傳轉(zhuǎn)化的影響

3 小結(jié)與討論

合適的選擇壓是植物遺傳轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵之一。當(dāng)選擇壓低時(shí)，部分未轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞由于產(chǎn)生耐受性而分化成假陽性植株；當(dāng)選擇壓高時(shí)，轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞由于不能承受高選擇壓而同樣被抑制，使轉(zhuǎn)化效率降低。白菜類中常用的篩選標(biāo)記有卡那霉素和潮霉素抗性基因。王峰等[6]認(rèn)為5mg/L卡那霉素可完全抑制大白菜、小白菜及菜心子葉的再生。而余沛濤等[7]用50mg/L卡那霉素篩選轉(zhuǎn)化后的幼苗，其卡那霉素的選擇濃度是王峰等[6]試驗(yàn)結(jié)果的 10倍。張艷萍等[8]研究得出，卡那霉素濃度為10mg/L時(shí)對(duì)大白菜轉(zhuǎn)化體的篩選是有效的，藺忠龍等[9]和楊廣東等[10，11]與張艷萍有相同報(bào)道。 楊廣東等[12]采用分級(jí)分布篩選研究認(rèn)為，共培養(yǎng)后先在不含卡那霉素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上恢復(fù)生長7～ 10 d，再轉(zhuǎn)到含5mg/L卡那霉素的篩選培養(yǎng)基上選擇，當(dāng)抗性芽叢分化后轉(zhuǎn)到含7.5 mg/L卡那霉素的伸長培養(yǎng)基上，將伸長的單芽切下再轉(zhuǎn)到含5mg/L卡那霉素的生根培養(yǎng)基上生根，總共得到GP-11轉(zhuǎn)化苗9株，中白4號(hào)轉(zhuǎn)化苗6株。謝建坤等[13]研究白菜抗蟲基因轉(zhuǎn)化受體體系時(shí)，潮霉素的選擇濃度為20mg/L，獲得了52株抗性苗，其中20%為GUS陽性植株。田志宏等[14]利用1 mg/L潮霉素篩選出魯白六號(hào)8株潮霉素抗性苗。張蕊等[15]以5mg/L潮霉素作為大白菜津育60轉(zhuǎn)化的抗生素篩選濃度。張曉東等[16]認(rèn)為在篩選培養(yǎng)基中添加10 mg/L潮霉素對(duì)大白菜抗性芽的篩選最有效。本試驗(yàn)篩選的潮霉素濃度為5mg/L，和張蕊等[15]研究結(jié)果相同，與其他研究結(jié)果有差異[14，16]。從以上研究可以看出，研究者根據(jù)植物表達(dá)載體上篩選抗性標(biāo)記基因選擇不同的抗生素，主要有卡那霉素和潮霉素2類抗生素，卡那霉素的濃度選擇范圍為5～50mg/L，潮霉素的濃度選擇范圍為1～20mg/L，總的說來，卡那霉素選擇壓一般比潮霉素高，可能因?yàn)榇蟀撞嘶蛐筒煌约俺泵顾貙?duì)外源基因表達(dá)水平低的芽產(chǎn)生了強(qiáng)的抑制作用。

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化過程中，為了抑制農(nóng)桿菌的生長，需要在培養(yǎng)基中加入抗生素?？股匾志暮脡闹苯佑绊戅D(zhuǎn)化效率高低，白菜類作物常用的抗生素有氨芐青霉素 （Ampicillin）、 羧芐青霉素（Carbenillin）、頭孢霉素和淡紫青霉素（Lilacillin）等。張鳳蘭[17]認(rèn)為淡紫青霉素效果較好，她通過研究不同濃度的淡紫青霉素對(duì)白菜子葉不定芽的影響，發(fā)現(xiàn)白菜不定芽再生幾乎不受淡紫青霉素的影響，但淡紫青霉素在國內(nèi)較難買到，關(guān)于它的應(yīng)用報(bào)道較少。謝建坤等[13]選擇500mg/L羧芐青霉素抑制農(nóng)桿菌的生長。藺忠龍等[9]得出氨芐青霉素濃度為500mg/L時(shí)，大白菜抗性芽產(chǎn)生頻率最高。張蕊等[15]利用卡那霉素抑菌的研究得出，在培養(yǎng)基中加入400 mg/L卡那霉素既可抑制農(nóng)桿菌的過度生長，又對(duì)白菜外植體的出芽率無致命影響。余小林等[18]觀察到，頭孢霉素對(duì)白菜和菜心的外植體不定芽的再生有明顯的抑制作用，在抑菌效果相當(dāng)?shù)那闆r下，選擇價(jià)格便宜、易獲得的氨芐青霉素作為抑菌劑，其適宜濃度為300mg/L。楊廣東等[10，11]認(rèn)為頭孢霉素濃度為400 mg/L時(shí)對(duì)抑菌是有效的。本試驗(yàn)得出，頭孢霉素濃度低于500mg/L時(shí)有促進(jìn)不定芽再生的作用，而試驗(yàn)得出的頭孢霉素最佳濃度500mg/L比楊廣東等[10，11]的研究結(jié)果稍高?？傊煌难芯空卟捎貌煌目股剡M(jìn)行抑菌，造成試驗(yàn)結(jié)果存在差異的原因可能是不同基因型大白菜對(duì)抗生素濃度及類型的敏感性不同。

此外，影響大白菜遺傳轉(zhuǎn)化的因素還有農(nóng)桿菌株種類、菌液培養(yǎng)時(shí)間、菌液濃度、菌液感染時(shí)間、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間等。王火旭等[19]在以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大白菜轉(zhuǎn)化研究中得出，子葉預(yù)培養(yǎng)2～3 d后，在OD600值為0.3～0.5的工程菌液中侵染2～10min，再共培養(yǎng)2～3 d，大白菜的轉(zhuǎn)化效率較高。邢德峰等[20]得到大白菜遺傳轉(zhuǎn)化最佳轉(zhuǎn)化受體和因素組合是：帶柄子葉侵染菌液OD600值為0.3，在pH值為5.2的MSC培養(yǎng)基中共培養(yǎng)60 h。各因素對(duì)抗性芽分化的影響程度依次為：外植體類型＞（菌液濃度×共培養(yǎng)pH值）＞（菌液濃度×共培養(yǎng)時(shí)間）；與EHA 105相比，R1000轉(zhuǎn)化大白菜子葉和下胚軸獲得的抗性芽頻率差異顯著。余小林等[18]試驗(yàn)得出，LBA4404/pBI355-AMF菌株的感染效率遠(yuǎn)高于EHA105/pBI355-AMF。張鳳蘭[17]認(rèn)為用OD600值為0.8的菌液侵染外植體15min，再在pH值為5.2的共培養(yǎng)基中共培養(yǎng)3 d遺傳轉(zhuǎn)化效果最佳。田志宏等[14]研究得出，魯白六號(hào)子葉的最佳遺傳轉(zhuǎn)化條件為：農(nóng)桿菌Hn1301菌液OD600值0.3～0.5，侵染時(shí)間10min，共培養(yǎng)2 d。朱常香等[21]認(rèn)為最佳的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為2～3 d，共培養(yǎng)時(shí)間以2 d為宜。楊廣東等[10]在大白菜遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)優(yōu)化的研究中認(rèn)為，OD600值為0.3、侵染時(shí)間為5min時(shí)，抗性芽產(chǎn)生的頻率較高。楊廣東等[12]將豇豆胰蛋白酶抑制劑基因?qū)氪蟀撞俗越幌礕P-11和雜交種中白4號(hào)中，以預(yù)培養(yǎng)1 d的3 d苗齡的大白菜帶柄子葉為外植體，在OD600值為0.5的農(nóng)桿菌菌液中侵染5min，再在pH值為5.2的共培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)2～3 d，得到了大白菜抗性植株。張艷萍等[8]以預(yù)培養(yǎng)2 d、苗齡4 d的大白菜不帶柄半子葉為外植體，在OD600值為0.6的菌液中侵染8min，再在pH值為5.8的共培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，得到了抗性植株。張蕊等[15]的研究結(jié)果得出，在OD600值為0.8的菌液中侵染5 min且共培養(yǎng)2 d轉(zhuǎn)化效果最優(yōu)。本試驗(yàn)研究得出，06J28橙色大白菜子葉段預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)時(shí)間均為2～3 d，農(nóng)桿菌菌液OD600值為0.3～0.5，侵染5min。

總結(jié)前人研究結(jié)果可得出，預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)的時(shí)間一般不超過3 d；農(nóng)桿菌菌液OD600值為0.3～0.8；侵染2～15min，最高達(dá)15min?？傊?，農(nóng)桿菌侵染菌液濃度、侵染時(shí)間及培養(yǎng)時(shí)間差異較大，不能普遍適用，這可能與大白菜的基因型和根癌農(nóng)桿菌菌株的種類等有關(guān)。

本試驗(yàn)以06J28橙色大白菜子葉段為外植體，子葉段預(yù)培養(yǎng)2～3 d后，在OD600值為0.3～0.5的菌液中侵染5min，再共培養(yǎng)2～3 d，培養(yǎng)基中加入5 mg/L潮霉素 （抗性篩選），500mg/L頭孢霉素 （抑制農(nóng)桿菌），遺傳轉(zhuǎn)化效率較高，經(jīng)檢測初步獲得了轉(zhuǎn)CMS7311-orf224基因橙色大白菜植株[5]，后將對(duì)初步檢測的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行Southern雜交和Northern雜交檢測，進(jìn)一步判斷該目的基因是否整合到橙色大白菜基因組中；同時(shí)通過轉(zhuǎn)基因植株花器官的觀察，驗(yàn)證細(xì)胞質(zhì)雄性不育系基因在橙色大白菜中的作用，創(chuàng)造新的大白菜不育系種質(zhì)資源，也為研究細(xì)胞質(zhì)雄性不育機(jī)理奠定一定的基礎(chǔ)。

[1]張魯剛，惠麥俠，張明科.彩色大白菜新品種“金冠1號(hào)”的選育[J].北方園藝，2005（4）：67-68.

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Establishment of Genetic Transformation System for Orange Heading Chinese Cabbage

FAN Aili1,2,ZHANG Lugang1
(1.College ofHorticulture,Northwest A&FUniversity/State Key Laboratory ofCrop Stress Biology for Arid Area,Yangling 712100;2.Vegetable Research Institute,Guangxi Academy ofAgricultural Sciences)

In this study,several factors affecting the transformation rate were studied by Agrobacterium-mediated CMS7311-orf224 gene in 06J28 Chinese cabbage,and these factors included sensitivity of cotyledon segments to hygromycin (Hyg)and Cefotaxime (Cef),pre-culture days,concentrations of Agrobacterium tumefaciens,co-culture days and times of being infected on the optimum culturemedium.The results showed that,resistant plants could be obtained with the conditions as follows:the cotyledon segments of 06J28 Chinese cabbage were pre-cultured for 2-3 days,and then infected with EHA-105 (the OD600value ranged from 0.3 to 0.5)for 5minutes and were co-cultured for 2-3 days,lastly were transformed to screening-culture medium (adding 5 mg/L Hyg and 500 mg/L Cef).A higher efficient genetic transformation system was established for orange Chinese cabbage,which set up a basis for germplasm resources innovation of Chinese cabbage.

Orange heading Chinese cabbage;CMS7311-orf224 gene;Genetic transformation

10.3865/j.issn.1001-3547.2012.18.003

國家科技支撐計(jì)劃（2009BADB8B03），陜西省蔬菜產(chǎn)業(yè)體系，廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)項(xiàng)目（2011YZ17），廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目

范愛麗（1975-），女，博士，助理研究員，主要從事蔬菜育種與生物技術(shù)研究，電話：18778043495，E-mail：fanaili@gxaas.net

張魯剛（1963-），男，通信作者，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事蔬菜育種與生物技術(shù)研究，電話：029-87082131，15091199690，E-mail：lugangzh@163.com

2012-06-12