魏民巍，鄭賽晶，孟慶乃，金永明，周 昆，胡利民

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市中藥藥理學(xué)重點實驗室，天津 300193;2.上海煙草(集團(tuán))公司技術(shù)中心，上海 200082)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是具有氣流受限特征的呼吸系統(tǒng)常見疾病之一，其發(fā)病率和病死率逐年攀升。因出現(xiàn)氣流受限且不完全可逆，呈漸進(jìn)性進(jìn)展，導(dǎo)致患者肺功能減退，勞動能力和生活質(zhì)量下降，嚴(yán)重可致殘，甚至死亡[1]。目前普遍認(rèn)為吸煙是COPD的重要誘因[2]，而慢性氣道炎癥則是其重要的發(fā)病機(jī)制。有研究認(rèn)為卷煙能通過誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子，激活相關(guān)通路，繼而誘導(dǎo)氣道黏液蛋白基因(MUC5AC)高表達(dá)[3],氣道黏液高分泌可加速患者肺功能下降。為降低吸煙造成的損傷，我們在煙草配方中添加中藥成分提取液，制成卷煙。通過使用煙氣懸凝物刺激人類支氣管上皮細(xì)胞16HBE，建立細(xì)胞染毒模型，觀察中藥添加劑對卷煙誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞TNF-α、IL-8及MUC5AC mRNA表達(dá)的影響，為中藥添加劑在卷煙中應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清、青鏈霉素為HyClone產(chǎn)品；0.25% EDTA-胰蛋白酶，Sigma；CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒，日本同仁；TNF-α、IL-8 ELISA試劑盒，RD分裝。RNA提取試劑盒，TIANGEN；cDNA合成、RT-PCR試劑盒，Applied Biosystems 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)方法 人類支氣管上皮細(xì)胞系16HBE(來源中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫)用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～4 d傳代1次，隔天換液。

1.2.2 中藥添加劑卷煙及煙氣懸凝物(CSC)的制備 本實驗所用卷煙由上海煙草(集團(tuán))公司提供。中藥添加劑卷煙制法如下：將生藥材回流提取后減壓濃縮，至生藥材與浸膏之比為1∶1，加入浸膏3倍體積量的95%乙醇，24 h后抽濾，取上清液減壓濃縮至稠膏。所得稠膏噴灑在煙絲上，烘干制成卷煙。所用藥材以補(bǔ)中益氣藥為主，輔以清熱潤肺藥。主要包括太子參、杭白芍、枸杞子、丹參、浙貝母等。采用國際主流的煙氣懸凝物染毒細(xì)胞[4],以靜電捕集法[5]收集煙氣懸凝物，DMSO洗脫，樣品稀釋至50 mg/mL，分裝至EP管于-80 ℃保存，實驗時用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

1.2.3 細(xì)胞活力檢測 取指數(shù)生長期16HBE細(xì)胞，胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/mL，每孔200 μL接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi),培養(yǎng)24 h。無血清培養(yǎng)基稀釋CSC至200、100、50、25 μg/mL，每孔200 μL對細(xì)胞染毒。12、24 h后棄上清,每孔加100 μL CCK-8溶液(1∶10稀釋),2 h后，多功能讀板機(jī)測定在450 nm處的吸光度。計算細(xì)胞活力。

1.2.4 PCR法檢測CSC染毒對16HBE細(xì)胞TNF-α、IL-8、MUC5AC mRNA表達(dá)影響 取指數(shù)生長期16HBE細(xì)胞，胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/mL。每孔以2 mL細(xì)胞懸液接種于12孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞生長單層融合后，予以無血清RPMI 1640培養(yǎng)液饑餓24 h。以不同濃度的CSC對細(xì)胞染毒，每個劑量設(shè)3個平行孔，每孔終體積1 mL,37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12、24 h。按RNA提取試劑盒說明書提取RNA，并計算其濃度，RNA濃度(μg/μL)=OD260讀數(shù)×40×稀釋倍數(shù)/100。按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書依次在PCR管中加入反應(yīng)物，每管10 μL。加入RNA樣品2 μg，用RNase-free water補(bǔ)足反應(yīng)體系至20 μL。放入PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：25 ℃ 10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min。按PCR試劑盒說明書依次在PCR管中加入反應(yīng)物。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 4 min，變性95 ℃ 30 sec，復(fù)性58 ℃ 35 sec，延伸70 ℃ 40 sec，30 cycles。應(yīng)用7 500實時定量PCR儀分析軟件，查看并分析數(shù)據(jù)，獲得樣品的Ct值，計算得到ΔCt，與對照組比較后，取2-ΔΔCt值進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活力 染毒后細(xì)胞活力顯著下降，呈濃度依賴性。含添加劑組細(xì)胞活力高于普通煙組，當(dāng)CSC濃度為100、200 μg/mL時，添加劑組細(xì)胞活力較普通煙組顯著升高。

2.2 CSC染毒對細(xì)胞TNF-α、IL-8和MUC5AC mRNA表達(dá)影響 染毒后，TNF-α、IL-8 mRNA表達(dá)增多，呈劑量效應(yīng)關(guān)系。添加劑組低于普通煙組，但無統(tǒng)計學(xué)意義。染毒12 h后,MUC5AC mRNA表達(dá)增多，呈劑量效應(yīng)關(guān)系。添加劑組顯著低于普通煙組。染毒24 h后,添加劑組低于普通煙組，無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

煙氣細(xì)胞毒性是指在煙氣直接造成細(xì)胞死亡的毒性作用，即細(xì)胞一次或一段時間內(nèi)多次接觸煙氣后出現(xiàn)的細(xì)胞死亡現(xiàn)象。結(jié)果表明，添加劑組細(xì)胞存活率高于普通煙組,當(dāng)CSC劑量大于100 μg/mL時有統(tǒng)計學(xué)意義,表明中藥添加劑具有降低CSC細(xì)胞毒性的作用。大量研究證實煙氣中的大量自由基不但可以直接破壞細(xì)胞內(nèi)氧化平衡，而且可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞多種細(xì)胞因子表達(dá)增多，這些炎癥介質(zhì)相應(yīng)基因的表達(dá)活性主要是受核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB),CCAAT/增強(qiáng)了結(jié)合蛋白(C/EBP)和激活蛋白復(fù)合體-l(AP-l)的調(diào)控[6]。香煙煙霧刺激人呼吸道上皮細(xì)胞，可誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)[7]和TNF-α的表達(dá)增加[8-12]。這些炎癥因子可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等向氣道內(nèi)浸潤，放大炎癥反應(yīng)，造成氣道慢性炎癥和持續(xù)損傷。因此比較不同卷煙煙氣懸凝物染毒后細(xì)胞TNF-α及IL-8表達(dá)對評價中藥添加劑降低卷煙危害作用具有重要意義。此外，香煙還是誘導(dǎo)氣道黏液高分泌的重要因素，可誘導(dǎo)氣道黏液蛋白基因(MUC5AC)高表達(dá)[13-14]。氣道黏液高分泌是慢性氣道炎癥的一個重要的病理特征，氣道黏液堵塞是導(dǎo)致發(fā)病和死亡的一個主要原因。故將中藥添加劑作為是否能降低氣道黏液蛋白基因表達(dá)評價標(biāo)準(zhǔn)之一。實驗結(jié)果顯示CSC染毒后細(xì)胞TNF-α及IL-8 mRNA表達(dá)在一定濃度和時間范圍內(nèi)呈藥物濃度和時間依賴性表達(dá)增加。染毒后TNF-α及IL-8含量及mRNA表達(dá)下降，但均無統(tǒng)計學(xué)意義。CSC能誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞MUC5AC mRNA高表達(dá),染毒12 h后，添加劑組顯著低于普通煙組。染毒24 h后，添加劑組低于普通煙組，無統(tǒng)計學(xué)意義。此結(jié)果表明添加劑可降低氣道黏液蛋白基因表達(dá)，其是否能夠減少吸煙所致呼吸道黏液高分泌有待進(jìn)一步的證實。由于添加劑有效成分經(jīng)燃燒后轉(zhuǎn)化率較低，其作用效果亦有待提高。

[1]中華呼吸學(xué)會.慢性阻塞性肺疾病診治指南(2007年修訂版)[J].中華呼吸與結(jié)核雜志,2007(1):50.

[2]Eisner M D,Anthonisen N,Coultas D,et al.An official American Thoracic Society public policy statement:Novel risk factors and the global burden of chronic obstructive pulmonary disease[J].American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine,2010,182(5):693-718.

[3]張明周,張明科,歐雪梅,等.HSP70在香煙誘導(dǎo)人類氣道上皮細(xì)胞黏液高分泌中的作用[J].四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2009,40(5):927-933.

[4]Johnson M D,Schilz J,Djordjevic M V,et al.Evaluation of in vitro assays for assessing the toxicity of cigarette smoke and smokeless tobacco[J].Cancer Epidemiology,Biomarkers & Prevention,2009,18(12):3263-3304.

[5]Dube M F,Green C.Methods of collection of smoke foranalytical purposes[J].Recent Adv Tob Sci,1982(8):42-102.

[6]CloutierA,TEar,Blais-Charron B,et al.Differential involvement of NF-κB and MAPkinase pathways inthe Generation of inflammatory cytokines by human neutrophils[J].Leukocyte Biol,2007,81:567-577.

[7]邢瑞婷.香煙煙霧凝集物誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞IL-8表達(dá)的機(jī)制[D].鄭州:鄭州大學(xué),2010.

[8]Moretto N,Facchinetti F,Southworth T,et al.Alpha,beta-Unsaturated aldehydes contained in cigarette smoke elicit IL-8 release in pulmonary cells through mitogen-activated protein kinases[J].American Journal of Physiology-lung Cellular and Molecular Physiology,2009,296(5):839-848.

[9]Oltmanns U,Chung K F,Walters M,et al.cigarette smoke induces IL-8,but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle [J].respiratory research,2005(6):74.

[10]Nakanaga M T,Jay A.Nadel cigarette smoke induces MUC5AC mucin overproduction via tumor necrosis factor-α-converting enzyme in human airway epithelial cells[J].American Journal of Physiology-lung Cellular and Molecular Physiology,2004(287):420-427.

[11]Hellermann G R,Nagy S B,Xiaoyuan Kong,et al.Mechanism of cigarette smoke condensate-induced acute inflammatory response in human bronchial epithelial cells[J].respiratory research,2002(3):22.

[12]LI Chao-jun,Ning Wen,Matthay M A,et al.MAPK pathway mediates EGR-1-HSP70-dependent cigarette smoke-induced chemokine production[J].American Journal of Physiology-lung Cellular and Molecular Physiology,2007,292(5):1297-1303.

[13]Baginski T K,Dabbagh K,Satjawatcharaphong C,et al.Cigarette smoke synergistically enhances respiratory mucin induction by proinflammatory stimuli[J].American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology,2006,35(2):165-174.

[14]Perrais M,Pigny P,Copin M C,et al.Induction of MUC2 and MUC5AC mucins by factors of the epidermal growth factor (EGF) family is mediated by EGF receptor/Ras/Raf/extracellular signal-regulated kinase cascade and Sp1[J].Journal of Biological Chemistry,2002,277(35):32258-32267.