歐 文，黃榕彬，曹 軒，賀冬秀，陳臨溪，唐國(guó)濤

（南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南 衡陽(yáng) 421001）

薺菜（Capsella bursa-pastoris）為十字花科1~2年生草木植物，全草可入藥，是藥食同源植物。薺菜多糖是薺菜中的主要活性成分之一。近年來，多糖所具有的各種生理功能逐漸為人們所重視，如降低血糖濃度、抗腫瘤、抗疲勞及抗衰老等。從天然動(dòng)植物提取的多糖，往往含有大量蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的存在不僅可能影響其結(jié)構(gòu)和生物活性，且可能導(dǎo)致藥理作用下降[1~2]，因此，脫蛋白是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。常見的脫蛋白方法有Sevag法、三氯乙酸法、木瓜蛋白酶法等[3]，不同的除蛋白方法適用于不同來源的多糖，目前尚未見到去除薺菜多糖中蛋白質(zhì)方法的研究報(bào)道。本試驗(yàn)通過對(duì)以上3種方法的比較，對(duì)薺菜多糖提取液中最佳的蛋白質(zhì)去除方法進(jìn)行了初步探討，以清潔、條件溫和、操作簡(jiǎn)單的方法為多糖類藥品和保健產(chǎn)品的開發(fā)提供了有利條件[4].。

1 材料與儀器

薺菜采摘于湖南省衡陽(yáng)市新華開發(fā)區(qū)，經(jīng)過南華大學(xué)嚴(yán)奉祥教授鑒定。薺菜陰干，粉碎，過0.42mm篩，備用。

日本島津UV-2450紫外分析儀、BSZZ4S型電子分析天平、80-1型離心機(jī)。

木瓜蛋白酶、考馬斯藍(lán)G-250（Roche）、牛血清白蛋白。葡萄糖、三氯乙酸、三氯甲烷、苯酚、正丁醇、濃硫酸等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖提取方法

稱取薺菜藥材粉末60g，加4倍量95%乙醇回流提取脫脂，藥渣加600mL蒸餾水超聲1h，過濾，離心，取上清液，得粗多糖提取液。

2.2 多糖含量測(cè)定方法

采用苯酚-硫酸法，準(zhǔn)確稱取葡萄糖20.0mg，置燒杯中，加水溶解轉(zhuǎn)至100mL容量瓶并稀釋至刻度作為母液，吸取 0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL葡萄糖母液置不同的具塞試管中用蒸餾水補(bǔ)充至2.0mL，加入6%苯酚1.0mL及濃硫酸5.0mL，搖勻冷卻，室溫放置20min，490nm測(cè)吸光度，以2.0mL蒸餾水按同樣操作為空白對(duì)照，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，吸光度為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行回歸處理，建立回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1.183X-0.003（r=0.9994）。表明葡萄糖質(zhì)量濃度在1.0~6.0mg·mL-1的范圍內(nèi)，X與Y的線性關(guān)系良好。

2.3 蛋白含量測(cè)定方法

蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定[5]。取6支具 塞 試 管，分 別 加 入 0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，0.6mL配置好的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液（100g·L-1），用蒸餾水加至0.6mL，搖勻后各加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5mL（100mg考馬斯亮藍(lán)G-250與50mL 95%的乙醇混合，再加入100mL 85%的磷酸溶液定容至1000mL），放置5min，在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定。以牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)X，吸光度為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行回歸處理，建立回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=1.2457X+0.1020（r=0.996）。表明牛血清白蛋白含量在16.7~100mg·mL-1的范圍內(nèi)，X與Y的線性關(guān)系良好。

2. 4 蛋白去除方法比較研究

2. 4. 1 指標(biāo)的確定

采用蛋白去除率和多糖損失率作為指標(biāo)進(jìn)行考察。

2.4.2 Sevag法

取50mL多糖提取液，按照多糖提取液、氯仿、正丁醇的體積比為16∶4∶1加入氯仿與正丁醇，混合物離心振蕩30min，分出上清液，多次重復(fù)上述步驟測(cè)定上清液的多 糖和蛋白濃度。多次測(cè)量蛋白去除率均不足80%（圖1），而此時(shí)多糖的損失率在20%。

圖1 Sevag法

2.4.3 三氯乙酸法

依次取10mL多糖提取液加入5支具塞試管，再分別加入1mL，2mL，3mL，4mL，5mL三氯乙酸溶液（3 mol·L-1），4℃下靜置過夜，離心棄去沉淀，收集上清液，測(cè)定多糖和蛋白濃度。測(cè)定蛋白去除率85.52 %（圖2），多糖損失率為25.08 %。

2.4.4 木瓜蛋白酶法

配置木瓜蛋白酶溶液：取1g木瓜蛋白酶，用pH 5.5的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液溶解，定容至100mL，酶液最終質(zhì)量濃度為10g·L-1。另取10 mL多糖提取液，加入2.0%的木瓜蛋白酶溶液，在50℃水浴酶解1.5h，沸水浴滅酶10min，冷卻至室溫，3000r·min-1離心5min除去沉淀，取上清液醇沉，沉淀復(fù)溶至原體積，測(cè)定溶液中多糖和蛋白濃度。測(cè)定蛋白去除率88.21%，多糖損失率為7.43%。

圖2 三氯乙酸法

比較Sevag法、三氯乙酸法、木瓜蛋白酶法脫除蛋白的效果，發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶法除蛋白的去除率最高，多糖損失率最小，因此選擇木瓜蛋白酶法除蛋白進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，考察不同因素對(duì)蛋白去除率的影響。

2.5 蛋白去除率的影響因素優(yōu)化

2.5.1 酶用量對(duì)蛋白去除率的影響

取10mL薺菜多糖提取液，在反應(yīng)溫度60℃，pH 5.0的反應(yīng)體系中，分別加入酶用量為1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%的木瓜蛋白酶溶液，水解2h，測(cè)定酶用量對(duì)蛋白去除率的影響。當(dāng)酶用量2.0%時(shí)，蛋白去除率為89.01%（圖3），繼續(xù)增加酶用量，蛋白去除效果增加不明顯，故酶用量選擇2.0%。

圖3 酶用量對(duì)蛋白去除率影響

2.5.2 pH對(duì)蛋白去除率的影響

溫度60℃，酶用量2.0%，調(diào)節(jié)pH分別為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，酶解 2h 后，測(cè)定蛋白的去除率（圖4），當(dāng)pH為5.0時(shí)，蛋白去除率最高。

2.5.3 酶解時(shí)間對(duì)蛋白去除率的影響

在溫度60℃，酶用量2.0%，pH 5.0時(shí)，分別測(cè)定酶解時(shí)間為 0.5h，1.0h，1.5h，2.0h，3.0h，4.0h 的蛋白去除率,蛋白去除率在一定范圍內(nèi)隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，1.5h后，蛋白去除率趨向平穩(wěn)（圖5）。因此，選用1.5h作為最佳酶解時(shí)間。

圖4 p H對(duì)蛋白去除效果的影響

圖5 酶解時(shí)間對(duì)蛋白去除率的影響

2.5.4 溫度對(duì)蛋白去除率的影響

當(dāng)酶用量2.0 %，pH 5.0，酶解反應(yīng)時(shí)間1.5 h時(shí)，分別測(cè)定酶解溫度為40℃，50℃，60℃，70℃，80℃時(shí)蛋白去除率，酶的活力在一定范圍內(nèi)隨溫度的升高而增高，溫度超過60℃后，酶活力下降（圖6）。因此，反應(yīng)的最適溫度應(yīng)為60℃ 。

圖6 酶解溫度對(duì)蛋白去除率的影響

在兼顧蛋白去除率和多糖損失率的情況下，在考察單因素的基礎(chǔ)上對(duì)酶法設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)來優(yōu)化除蛋白的工藝。

2.5.5 酶法除蛋白工藝優(yōu)選

在單因素考察的基礎(chǔ)上，選取酶用量（A）、pH（B）、溫度（C）、酶解時(shí)間（D）為考察因素，每個(gè)因素考察3個(gè)水平，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以蛋白去除率優(yōu)選木瓜蛋白酶法除蛋白的工藝，因素和水平見表1。

表1 酶法除蛋白工藝因素水平Table1 Factors and levels of removing protein by enzyme method

由直觀分析結(jié)果可以看出4個(gè)因素對(duì)蛋白質(zhì)去除率的影響程度不同，依次為A＞D＞C＞B，故以B作誤差項(xiàng)進(jìn)行方差估算，結(jié)果見表3。A因素和D因素對(duì)蛋白去除率都有顯著性影響，C因素?zé)o顯著性影響。最佳條件為A2B1C2D3，即酶用量2.0%，pH 5.0，溫度60℃，時(shí)間2.0h，在該條件下蛋白的去除率為91.12%。

表2 酶法除蛋白工藝L9正交試驗(yàn)及結(jié)果Table 2 Results of L9(3)4 orthogonal test of removing protein by enzyme method

表3 蛋白去除率方差分析Table 3 Analysis of variance of PRP

2.5.6 工藝驗(yàn)證

按酶法除蛋白的最佳工藝對(duì)同一批多糖提取液進(jìn)行驗(yàn)證（n=3） ，蛋白去除率分別為89.56%、90.15%、91.23%，多糖損失率分別為5.25%、5.69%、6.03%。3次結(jié)果均處于較高水平, 說明該提取工藝是可靠的。

3 討論

Sevag法需要多次重復(fù)操作，多糖損失量大，成本高；三氯乙酸法多糖損失率較高可能是含有氨基易形成復(fù)鹽降低其溶解度，并且以上方法都引入了大量有機(jī)試劑，易造成有機(jī)殘留，不宜大規(guī)模應(yīng)用。木瓜蛋白酶法效率高，條件溫和，蛋白去除率和多糖保留率都很高，不引入有機(jī)試劑，因而能夠較好應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，能為多糖類藥品和保健產(chǎn)品的開發(fā)提供有利條件。

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