丁　輝，程　楠，齊德珍，徐世民

(1.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072； 2.精餾技術(shù)國家工程研究中心，天津 300072)

角鯊烯(squalene)，為無色或微黃色透明油狀液體，分子式為C30H50，化學(xué)名稱為2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯，是一種高度不飽和的直鏈三萜類化合物，廣泛存在于大多數(shù)動植物體內(nèi)。角鯊烯在醫(yī)藥、化妝品和保健品等領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用[1-3]。目前它的主要來源為鯊魚肝油，而由于近年來鯊魚的低繁殖率以及環(huán)境破壞對魚種的污染，出于對野生海洋動物的保護(hù)，提取植物性角鯊烯逐漸替代動物性角鯊烯逐漸成為一種趨勢[4-5]。

大豆油脫臭餾出物(SODD)是大豆油脫臭過程中得到的副產(chǎn)品，主要組成為：游離脂肪酸(FFA)、甘油酯、甾醇及甾醇酯、生育酚、角鯊烯、少量的烴類、酮和醛等。它可用來提取脂肪酸、生育酚、甾醇，也可用于提取角鯊烯。目前國內(nèi)外對生育酚、植物甾醇的提取分離研究較多，許多成果已經(jīng)實現(xiàn)工業(yè)化[6-9]。

目前植物性角鯊烯的提取分離多采用植物油為原料，價格昂貴，成本較高；主要方法有皂化分離法、減壓蒸餾法、分子蒸餾法、超臨界流體萃取法和柱色譜分離法等[10-14]。本研究以大豆脫臭餾出物為原料，成本低廉，通過皂化、二級分子蒸餾過程富集角鯊烯，用高效液相色譜測定其含量。并討論了皂化反應(yīng)以及分子蒸餾的最適宜條件，為正在發(fā)展的植物角鯊烯的提取提供有用的依據(jù)。

1　試驗部分

1.1　儀器與試劑

大豆油脫臭餾出物，ω(角鯊烯)為1.95%，購于某油脂加工廠；色譜純甲醇；液氮；其他為國產(chǎn)分析純。

Waters 600-717-996高效液相色譜儀，美國Waters公司；刮膜式小試分子蒸餾器，德國VTA公司；LABOROTA 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國海道爾夫公司；F12再循環(huán)冷卻器，德國Julabo公司。

1.2　不皂化物的提取

稱取300 g大豆油脫臭餾出物放入2 000 mL三口圓底燒瓶中，加入一定量的氫氧化鉀-乙醇溶液，在一定溫度下攪拌回流一定時間；停止加熱后用500 mL蒸餾水進(jìn)行水洗；冷卻后用150 mL正己烷重復(fù)萃取5次，合并萃取液；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的乙醇水溶液洗滌萃取液；將洗滌后的不皂化物在冰箱內(nèi)存放4 h，將析出的皂去除；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸除正己烷，得到不皂化物[15]。

1.3　分子蒸餾過程

SODD不皂化物從進(jìn)料器經(jīng)預(yù)熱后進(jìn)入分子蒸餾裝置，物料在重力及刮膜器共同作用下在蒸發(fā)表面上形成均勻液膜，蒸餾溫度由導(dǎo)熱油精確控制。原料在蒸發(fā)面上受熱，在高真空條件下(系統(tǒng)壓力低于10 Pa)，低沸點組分從液膜表面蒸發(fā)，在中間冷凝器被冷凝成液相，沿冷凝面流入餾出液接收瓶；重組分則沿主體壁面流入餾余液接收瓶。為防止揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)入真空系統(tǒng)，在管路上設(shè)置冷阱，其中加入液氮作為制冷劑。由于真空系統(tǒng)有中間冷凝管和冷阱的雙重冷凝作用，保證了整個系統(tǒng)操作壓力的均衡[15]。

1.4　分析方法

采用Waters 600-717-996 高效液相色譜儀。色譜條件為：色譜柱YMC-PackODS-A(s-5 μm，12 nm)；柱溫25 ℃；流動相V(甲醇)∶V(水)為99∶1，流速1.0 mL/min；檢測波長210 nm；檢測時間25 min；進(jìn)樣量10 μL。采用面積歸一法計算含量。

2　結(jié)果與討論

2.1　皂化反應(yīng)正交試驗結(jié)果

影響皂化反應(yīng)的主要因素有反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度和堿的濃度等。以不皂化物中角鯊烯含量為指標(biāo)，采用L8(27)正交設(shè)計對3個因素進(jìn)行優(yōu)化，確定最適宜皂化反應(yīng)條件。其試驗因素和水平設(shè)置見表1。水平1的選擇依據(jù)為前期單因素試驗結(jié)果，水平2則在水平1基礎(chǔ)上相應(yīng)降低，以尋求在較低時間、較低溫度、較少堿用量的情況下，獲取最適宜試驗效果。試驗結(jié)果列于表2中。

表1　皂化反應(yīng)正交試驗因子水平表Table 1　Definition of factors and levels for saponification

表2　正交設(shè)計直觀分析表Table 2　Visual analysis table of orthogonal design

由表2可知，影響皂化反應(yīng)的因素的主次順序為B>A>C；在交互作用中RB×C>RA×B>RA×C，但是這些交互作用的影響相對于溫度和時間的影響可以忽略不計，可視為由試驗誤差引起的。在此未考慮角鯊烯收率的原因是，在前期單因素試驗結(jié)果中，角鯊烯收率變化并不明顯。這是由于維生素E的抗氧化效果甚于角鯊烯，對角鯊烯起到了保護(hù)作用，而SODD中維生素E的含量較高，故角鯊烯在原料中具有較高的穩(wěn)定性，不會遭到破壞，這與文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致[16]。綜合考慮得出最適宜工藝條件為A1B1C2，即反應(yīng)時間為40 min，反應(yīng)溫度為80 ℃，KOH濃度為0.8 mol/L。

為驗證優(yōu)化條件，取原料10 g，加入0.8 mol/L新配制的氫氧化鉀-乙醇溶液100 mL，在80 ℃攪拌回流條件下反應(yīng)40 min，按1.2步驟進(jìn)行提取，在此進(jìn)行3組平行試驗，3次試驗結(jié)果ω(角鯊烯)的平均值為9.9%，收率為98.6%。

2.2　第一級分子蒸餾響應(yīng)面設(shè)計分析

2.2.1設(shè)計方案及結(jié)果

影響分子蒸餾富集效果的因素主要有：系統(tǒng)壓力、預(yù)熱溫度、蒸發(fā)溫度、進(jìn)料速率、刮膜轉(zhuǎn)速等。由于角鯊烯是熱敏性物質(zhì)，需盡量降低蒸餾溫度，故固定系統(tǒng)壓力為裝置所能達(dá)到的最小壓力，即0.1 Pa，固定預(yù)熱溫度70 ℃，SODD進(jìn)料量60 g。采用Box-Behnken響應(yīng)曲面法[17]對分子蒸餾效果影響較大的蒸發(fā)溫度、進(jìn)料速率、刮膜轉(zhuǎn)速這3因素進(jìn)行試驗設(shè)計和分析，以獲得角鯊烯的最高含量及最佳收率。本試驗設(shè)計包括12個因子試驗點和3個重復(fù)中心點，其中3個重復(fù)中心點用來計算純誤差。具體的因素水平見表3。各水平的確定以單因素影響研究結(jié)論為依據(jù)，由于第一級分子蒸餾的目的是去除輕烴、醛、酮等低沸點物質(zhì)，而角鯊烯較容易被蒸出，故第一級分子蒸餾在較低蒸發(fā)溫度及進(jìn)料速率范圍內(nèi)進(jìn)行。

表3　3因素水平及編碼Table 3　Independent variables and their levels

表4　Box-Behnken試驗設(shè)計及試驗數(shù)據(jù)Table 4　Box-Behnken design and experimental data

2.2.2響應(yīng)面模型的建立與分析

由Design-Expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并回歸擬合，方差分析結(jié)果如表5所示，可得到以角鯊烯含量及收率為響應(yīng)值的回歸公式分別為：

表5　角鯊烯含量及收率的響應(yīng)面分析擬合回歸方程的方差分析結(jié)果Table 5　Analysis of variance with regression model on extraction conditions of squalene content and yield

注：Values of “Prob>F” less than 0.050 0 indicate model terms are significant.

Y1=15.01+0.44X1+0.63X1X2-

(1)

Y2=89.00-15.00X1+5.12X2+

(2)

由表5可以看出：回歸方程Y1和Y2的線性相關(guān)系數(shù)分別為0.965 3及0.980 2；模型項P值均遠(yuǎn)小于0.05，說明方程顯著；失擬項不顯著，說明方程的擬合度較好。各交互作用對角鯊烯含量和收率影響的響應(yīng)面圖如圖1及圖2所示。

圖1　各交互作用對角鯊烯含量影響的響應(yīng)面圖Fig.1　Response surface curve of squalene content as functions of each interaction

2.2.3最適宜條件的確定及試驗驗證

為使角鯊烯的ω(角鯊烯)和收率同時達(dá)到一最適宜值，依舊利用Design-Expert軟件，將ω(角鯊烯)的標(biāo)準(zhǔn)范圍定在15.0%～15.5%，目標(biāo)選定“maximize”；收率范圍定在90.0%～100.0%，應(yīng)用2個模型方程，通過Design Expert軟件可以得到目標(biāo)的圖解最優(yōu)化。最優(yōu)化圖解如圖3所示。

最終確定優(yōu)化條件為：蒸發(fā)溫度73 ℃、進(jìn)料速度1.1 mL/min、刮膜速度250 r/min，此時重相中ω(角鯊烯)為15.2%，收率為92.0%。該溫度條件下能保證角鯊烯不隨之被蒸出，而較低的進(jìn)料速度可以保證物料在蒸發(fā)壁面上的停留時間不致過短，提高蒸發(fā)效率；較高的刮膜轉(zhuǎn)速能使液膜厚度更小，分布更均勻，使得蒸發(fā)過程的傳熱和傳質(zhì)過程更完全，但是轉(zhuǎn)速過高也會導(dǎo)致角鯊烯在輕組分中出現(xiàn)。

在優(yōu)化條件下進(jìn)行重復(fù)試驗，試驗結(jié)果列于表6中。

表6　最適宜條件下測定結(jié)果Table 6　Results in optimal conditions

2.3　第2級分子蒸餾結(jié)果分析

以第1級分子蒸餾的餾余物36 g為原料進(jìn)行第2級分子蒸餾，選用的條件為：系統(tǒng)壓力：0.1 Pa、蒸發(fā)溫度175 ℃、進(jìn)料速率4 mL/min、刮膜轉(zhuǎn)速200 r/min、預(yù)熱溫度：70 ℃、冷凝面溫度：25 ℃。得到ω(角鯊烯)為21.0%的輕相，收率為95.7%。

3　結(jié)論

圖2　各交互作用對角鯊烯收率影響的響應(yīng)面圖Fig.2　Response surface curve of squalene yield as functions of each interaction

圖3　優(yōu)化圖(覆蓋圖)Fig.3　Overlay plot

采用大豆油脫臭餾出物為原料，探索了經(jīng)皂化反應(yīng)及2級分子蒸餾提取植物性角鯊烯代替動物角鯊烯的工藝過程。分別用正交因子設(shè)計及響應(yīng)面法對皂化反應(yīng)及分子蒸餾的試驗條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到了相應(yīng)的優(yōu)化工藝條件。

1)皂化反應(yīng)過程：反應(yīng)時間40 min，反應(yīng)溫度80 ℃，KOH濃度0.8 mol/L，得到ω(角鯊烯)為9.92%的不皂化物，收率為98.6%；

2)第1級分子蒸餾過程：蒸發(fā)溫度73 ℃，進(jìn)料速率1.10 mL/min，刮膜轉(zhuǎn)速250 r/min，得到ω(角鯊烯)為15.2%的重相，收率為91.7%。經(jīng)第2級分子蒸餾過程得到ω(角鯊烯)為21.01%的輕相，總收率為86.8%。

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