劉小轉(zhuǎn)，潘新娟

·綜述·

TGF-β／Smad信號分子在腭融合過程中的作用

M echanism of TGF-β／Sm ad Signaling M olecu le in Paiatal Fusion Process

劉小轉(zhuǎn)，潘新娟

目的了解TGF-β／Smad信號分子在腭發(fā)育過程中的表達和作用。方法 參閱國內(nèi)外相關(guān)文獻，對TGF-β和Smad信號分子在腭融合過程中的表達做一綜述。結(jié)果TGF-β和Smad信號分子在腭融合過程中具有時空表達的特異性。結(jié)論TGF-β／Smad信號分子在腭融合過程中起著至關(guān)重要的作用，為指導(dǎo)臨床應(yīng)用TGF-β和預(yù)防先天性腭裂發(fā)生的新途徑提供理論和實驗依據(jù)。

TGF-β；Smad；腭融合；腭裂

哺乳動物腭的形成過程復(fù)雜，包括腭突上皮與間充質(zhì)之間的相互作用、腭突的正常發(fā)育以及準確定位、細胞外基質(zhì)的重新塑形、兩側(cè)腭突的接觸、黏著與融合，還包括其中的細胞增殖、分化和凝聚。胚胎早期，任何外源性致畸因子，都可能通過改變各種細胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factors，TGF-βs）的表達，從細胞生物學(xué)水平改變腭突的正常發(fā)育，導(dǎo)致腭裂［1］。Smad蛋白是目前唯一被發(fā)現(xiàn)的TGF-β受體作用底物［2］，廣泛存在于各種哺乳動物細胞中。TGF-βs啟動核內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄必須經(jīng)過細胞膜相應(yīng)受體及其下游效應(yīng)分子，如Smad蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)才起作用。所以，當Raftery［3］、Sekelsky［4］等分別鑒定出Smad信號蛋白，尤其是多個Smad蛋白家族成員的編碼基因被相繼克隆后，探討TGF-β／Smad信號途徑在腭發(fā)育及腭裂形成中的作用，以避免腭裂的發(fā)生，成為國內(nèi)外研究的熱點。

1 TGF-β亞型在腭發(fā)育過程中的作用

TGF-β亞型（TGF-βl、TGF-β2、TGF-β3）在物種之間極度保守，具有71%～76%的同源性，信號途徑都是Smads或者MAPKs。在小鼠腭發(fā)育的早期階段已經(jīng)有TGF-β亞型的表達。早在妊娠11.0～11.5 d，當腭體從上頜突推移中突出，并延伸時，只有TGF-β3可在垂直生長的腭突的上皮成分中測出，并且貫穿于中嵴上皮細胞轉(zhuǎn)化成間質(zhì)細胞的整個過程［5］。在妊娠12.0～12.5 d，在腭突延伸和垂直生長時，TGF-βl和TGF-β2分別表達在腭突上皮細胞和腭突間質(zhì)細胞內(nèi)。在妊娠13.0～13.5 d，腭突的上抬期，在腭突的上皮成分TGF-β3高度表達，在這個部位將產(chǎn)生后來的中嵴上皮縫［5］。同時，TGF-βl的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也在腭突中嵴上皮（medial edge epithelial，MEE）細胞中表達，這個階段腭突中的間質(zhì)細胞也離散地表達TGF-β1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而且TGF-β2的表達貫穿于腭突的間質(zhì)細胞。但是，也有研究者提出，在腭形成的早期階段沒有TGF-β2的表達。在妊娠14.0～14.5 d，兩側(cè)腭突直接接觸前，TGF-β3 在MEE細胞中高度集中，在腭突的鼻緣和鼻中隔的上皮也有表達。TGF-βl停留在表達TGF-β3的MEE細胞中和腭突的其他上皮成分中。TGF-β2仍然在間質(zhì)細胞中表達，尤其是與上皮直接接觸的間質(zhì)細胞［6］。但是，幾乎沒有MEE細胞表達TGF-β2的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在腭發(fā)育的整個過程中，妊娠14.0～14.5 d腭突中嵴上皮中的TGF-β3轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達量是最高的。此時，嚙齒類動物腭突的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化達到一個高峰。在妊娠15.0～15.5 d，當腭突經(jīng)過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化剛剛?cè)诤蠒r，中嵴上皮仍然繼續(xù)表達TGF-β3和TGF-βl，直到中嵴上皮細胞失去它們的形態(tài)，完成間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化［7］。與妊娠13.5 d和14.5 d相比，上皮島內(nèi)剩余的未轉(zhuǎn)化的中嵴上皮中TGF-β3的表達明顯減少。然而，在腭突上皮縫內(nèi)TGF-β3仍然高水平地表達。TGF-β3和TGF-βl局限于中嵴上皮，但是在這一階段稍后，TGF-βl也在間質(zhì)細胞中表達。在妊娠16.0～16.5 d，TGF-β3主要在間質(zhì)細胞表達，僅有有限TGF-β3陽性的上皮細胞殘留在融合的上皮附近。TGF-β2分散地表達在中縫周圍的間質(zhì)細胞中。然而，間質(zhì)細胞內(nèi)TGF-β的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物主要在腭和鼻發(fā)育過程中局限于骨化的區(qū)域。

盡管關(guān)于TGF-β亞型在腭發(fā)育過程中精確的時空分布還有一些爭議，但是大多數(shù)的研究者一致認為TGF-βl在腭突的生長和細胞增殖方面起著至關(guān)重要的作用。TGF-β1和TGF-β2在腭發(fā)育過程中可以調(diào)控間質(zhì)細胞的增殖和細胞外基質(zhì)的合成，給妊娠12 d的BIO·A鼠注射可的松，可誘導(dǎo)TGF-β2表達水平下降延遲l d，抑制間充質(zhì)細胞增殖及腭生長，從而導(dǎo)致腭裂［8］。而TGF-β3主要是促進上皮－間質(zhì)的轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)中縫上皮的融合［9］。TGF-β3（－／－）突變鼠僅表現(xiàn)出腭裂畸形，無其他顱面畸形，兩側(cè)腭突黏著但不能融合，上皮縫不能溶解，從而導(dǎo)致腭裂。由此可知，TGF-β3對腭融合的影響是通過內(nèi)在的原發(fā)機制，而非繼發(fā)顱面畸形的效應(yīng)［10］。在TGF-β（－／－）突變鼠胚腭融合期，MEE細胞的凋亡數(shù)目顯著減少，中縫仍有MEE細胞存活，基底膜未降解。加入TGF-β3，可完全改善突變鼠胚的腭裂，表明TGF-β3在調(diào)控MEE細胞的轉(zhuǎn)歸及基底膜的降解過程中起著特定作用，提示腭融合時，TGF-β3可能作為凋亡的誘導(dǎo)因子調(diào)節(jié)MEE細胞的轉(zhuǎn)歸，而MEE細胞自中縫的遷移以及間充質(zhì)的持續(xù)形成是腭融合的重要步驟［11］。Taya等報道，加入重組人TGF-β3，可以改善TGF-β3（－／－）突變鼠的腭裂畸形，而加入TGF-βl或TGF-β2，腭突僅接近正常融合［12］，加入激活素或抑制素則對未融合的腭突無影響。TGF-β3在腭融合前，誘導(dǎo)腭胚中嵴上皮細胞膜外出現(xiàn)絲狀偽足，調(diào)節(jié)腭突融合。進而表明TGF-β3的效應(yīng)是由細胞膜外受體傳導(dǎo)的，由此為治療及預(yù)防胚胎腭裂提供了新途徑。

2 TGF-β受體在腭發(fā)育過程中的表達和作用

在哺乳動物的多種細胞表面存在3種TGF-β受體，即I、II、III型受體，這3種受體在腭發(fā)育過中與TGF-β亞型一樣，具有時空表達的特性。最早在小鼠腭突中出現(xiàn)的TβR亞型是TβR-I，在腭突剛從上頜突中長出，也就是小鼠妊娠12 d時，TβR-I己開始在腭突中表達，此時在腭突上皮和一些間質(zhì)細胞內(nèi)可以看到明顯的TβR-I陽性細胞。當腭突于舌兩側(cè)垂直生長時，TβR-I在上皮中的表達沒有什么變化，但是間質(zhì)細胞內(nèi)的著色有所減褪。在腭突上抬至水平狀態(tài)、中縫接觸以及中嵴上皮細胞在中縫位置變成單層上皮這個過程中，TβR-I一直保持著在腭突的上皮表達的優(yōu)勢，但是在上皮下的間質(zhì)細胞內(nèi)沒有表達。隨著腭的發(fā)育，腭突上皮崩解，TβR-I在上皮縫的分布也變得不連續(xù)。在妊娠15 d時，腭突融合，間質(zhì)細胞匯合后，除了腭的口腔上皮和鼻上皮還有TβR-I的表達外，間質(zhì)細胞內(nèi)有微弱的TβR-I表達。TβR-II從腭突的垂直生長期開始表達，位于腭突的上皮細胞。在腭突上抬、中嵴上皮細胞黏著、中縫上皮崩解過程中，TβR-II持續(xù)在這些上皮細胞中表達。但當腭突融合后，TβR-II只在中縫位置少量的間質(zhì)細胞內(nèi)有微弱的表達。TβR-II在腭突中的表達位置與TGF-β3是一致的，由此可以推斷在腭發(fā)育的過程中，TGF-β3是以自分泌的方式與TβR-II結(jié)合來發(fā)揮作用的。TβR-III也是在妊娠13 d，腭突還在舌兩側(cè)垂直生長時開始出現(xiàn)的，但是表達很微弱。當腭突上抬、中縫形成時，TBR-III的表達量急劇上升，著色的位置局限于中嵴上皮細胞。隨著腭突發(fā)育，TβRIII在中縫位置的分布也變得不連續(xù)，著色細胞在腭的口腔三角和鼻三角區(qū)域較集中。到妊娠15 d，當中嵴上皮細胞從中縫位置消失、間質(zhì)融合后，除了少量的中嵴上皮島和間質(zhì)樣細胞還有TβR-III的表達外，其他的腭突細胞均無表達?？偠灾?，如果能確定TβRs在細胞亞群中的表達，就可以定位TGF-β的反應(yīng)性［13］。在腭發(fā)育過程中，TβR-I、TβR-II和TGF-β3表達模式一樣，首要地在腭突的上皮細胞中表達，包括口腔上皮、鼻上皮以及腭突中縫接觸前和剛接觸時的中嵴上皮細胞內(nèi)，在中縫位置當中嵴上皮細胞消失時，這些分子的表達也逐漸地消失［14］。然而，TβR-III的表達在時空上局限于腭突中嵴上皮細胞內(nèi)。那么，根據(jù)TβR-III在中嵴上皮中的特異性的表達，可知TGF-β3在中嵴上皮細胞中的生物效應(yīng)可能是由TβR-III調(diào)控的。在腭突融合過程中，中嵴上皮細胞選擇性地經(jīng)歷了上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化和遷移，這些過程主要是由TGF-β3調(diào)控的［15］。在中嵴上皮細胞中，TGF-β3以自分泌的形式與TβR-II結(jié)合，而TβR-III可能調(diào)節(jié)兩者的結(jié)合過程，通過形成TβR-I、TβR-II受體復(fù)合物，局部地提高TGF-β3的自分泌信號。

3 Sm ads蛋白在腭發(fā)育過程中的表達和作用

TGF-β家族成員通過激活一系列的絲氨酸酶和蘇氨酸酶起作用。一個激活的TGF-β配體由細胞膜錨定的TβR-III遞呈給跨膜信號的受體TβR-I和TβR-II，TβR-I和TβR-II隨后又激活細胞內(nèi)的Smad蛋白。Smad蛋白家族是把TGF-β與其受體結(jié)合后產(chǎn)生的信號從胞質(zhì)傳導(dǎo)到細胞核內(nèi)的中介分子，參與TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的有Smad2、3、4、7。在腭發(fā)育過程中，受體調(diào)控蛋白Smad2／Smad3的激活和表達是TGF／Smad信號途徑起作用的關(guān)鍵證據(jù)。

在妊娠12 d，Smad2已在剛長出的腭突的上皮細胞中開始表達，一直到妊娠15 d，Smad2蛋白在不同形態(tài)的腭突的上皮中持續(xù)表達。然而，腭突內(nèi)Smad2表達的量與腭突的體積和形態(tài)并不相關(guān)，在妊娠14～14.5 d，Smad2的表達量達到最高峰，隨著融合逐漸降低，融合后完全消失；而且，Smad2蛋白僅在腭突的中嵴上皮細胞、腭的口腔上皮細胞和鼻上皮細胞中出現(xiàn)。P-Smad2是Smad2的活性形式，是在妊娠13 d腭突在舌的兩側(cè)垂直生長時開始出現(xiàn)，著色部位于腭鼻上皮遠端部位的細胞核內(nèi)。在妊娠14 d腭突在舌上水平生長時，P-Smad2散布在腭突的上皮細胞內(nèi)。在妊娠14.5 d，腭突繼續(xù)生長，當腭突在中縫位置最后接觸時，P-Smad2在腭突尖端位置的上皮細胞中表達。當上皮縫分解時，PSmad2在中縫處的分布變得不連續(xù)，與此同時在腭的口腔三角和鼻三角區(qū)域P-Smad2的著色很集中，而與中嵴上皮緊接的間質(zhì)細胞內(nèi)沒有P-Smad2的表達。在妊娠15 d的后期，當中嵴上皮細胞在中縫處完全消失，間質(zhì)細胞完全融合時，P-Smad2蛋白在腭組織中也完全的消失。由此可見，在腭突融合過程中，Smad2蛋白的磷酸化在空間上局限于腭突的中嵴上皮細胞，在時間上也與中嵴上皮細胞的退化、消失密切相關(guān)［16］。

研究發(fā)現(xiàn)，在TGF-β3突變型胎鼠腭組織的中嵴上皮細胞中P-Smad2的表達缺失，但是，在腭組織發(fā)育的同一階段，Smad2在TGF-β3突變型和野生型胎鼠的腭突上皮內(nèi)的表達水平無明顯的區(qū)別。由此可知，Smad2在調(diào)節(jié)MEE細胞的消失過程中起著關(guān)鍵的作用，而且TGF-β3是Smad2活化的一個首要啟動因子［20］。

4 展望

隨著細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，國內(nèi)外在TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控方面的研究已取得很大的進步，對Smad家族的結(jié)構(gòu)、功能、下游分子和目的基因有了較為深入的認識。在口腔學(xué)研究領(lǐng)域，加強TGF-β／Smad信號通路在腭發(fā)育以及腭裂發(fā)生過程中的的研究，從細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達調(diào)控水平闡明TGF-βs作用的分子機理，將為指導(dǎo)臨床應(yīng)用TGF-βs和探索預(yù)防先天性腭裂發(fā)生的新途徑提供理論和實驗依據(jù)，這對于推動本學(xué)科的發(fā)展具有重要意義。

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1672－688X（2012）04－0315－03

2012－09－15

河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南洛陽471003

劉小轉(zhuǎn)（1978－），女，河南洛陽人，助教，從事醫(yī)學(xué)免疫學(xué)教學(xué)工作。