溫順華，李 鋒，黃庶冰，廖 威，陳麗梅，黃庶識*

（1.昆明理工大學(xué) 生物工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650500；2.廣西科學(xué)院 生物物理實驗室，廣西 南寧 530007；3.廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006；4.廣西大學(xué)，廣西 南寧 530004；5.廣西職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)系，廣西 南寧 530226）

生物質(zhì)能源已被認為是解決全球能源危機的最理想途徑之一。作為生物質(zhì)能源之一的燃料乙醇已在全球得到廣泛的使用，但目前使用的乙醇主要是利用含淀粉作物和含糖作物（如小麥、玉米、甘蔗等）作為原料，通過發(fā)酵取得[1-2]。將糧食作物和經(jīng)濟作物用于生物乙醇的大規(guī)模生產(chǎn)，將會導(dǎo)致土地利用的擴張以及糧食價格的上漲，燃料乙醇的生產(chǎn)成本逐級提高，如果進一步發(fā)展乙醇生產(chǎn)，主要原料和土地供給空間客觀上無法支撐燃料乙醇的擴張。因此農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢棄物（如玉米秸稈、木材等纖維素生物質(zhì)）用于生物乙醇的生產(chǎn)被認為是解決能源危機的最可行策略[3-4]。但是，纖維素水解酶的系列開發(fā)、五碳糖發(fā)酵技術(shù)工程的菌株開發(fā)以及然纖維素結(jié)構(gòu)中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三者有效分離還存在重大技術(shù)瓶頸，成為妨礙纖維素酶法生物轉(zhuǎn)化技術(shù)實用化的主要障礙[5]。

海洋藻類用于第三代生物質(zhì)能源的生產(chǎn)具有比較優(yōu)勢[6]。與陸生植物相比，利用海洋藻類生產(chǎn)燃料乙醇在解決能源和環(huán)境問題的同時不會占用耕地，海洋藻類的光合轉(zhuǎn)化率高，碳水化合物含量高，與陸生纖維素生物質(zhì)相比，藻類幾乎不含木質(zhì)素，纖維素含量低，容易進行預(yù)處理[7-8]。美國能源部（DOE）的一份研究報告分析顯示，每公頃海域年產(chǎn)大型海藻為59t（干重），其最高乙醇理論產(chǎn)量為干重的0.254%，基于這些數(shù)據(jù)估算，每公頃海域年最大乙醇產(chǎn)量為19000L[9]。這一數(shù)值比甘蔗的乙醇產(chǎn)量高了2倍，比玉米的乙醇產(chǎn)量高5倍[10]。但海藻成分較為復(fù)雜，如大型褐藻海帶，其碳水化合物的主要成分為昆布多糖、海帶淀粉、褐藻膠等多糖以及甘露醇等單糖，工業(yè)微生物無法直接利用這些多糖成分以及甘露醇來生產(chǎn)燃料乙醇，因此在藻類燃料乙醇的生產(chǎn)過程中需通過物理，化學(xué)或生物降解等方法來將多糖降解為微生物可直接利用的單糖[11]。傳統(tǒng)的化學(xué)酸水解法降解海藻的多糖工藝，條件不易控制，并且裂解的產(chǎn)物分子量不均一，生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量的廢氣和廢液，會帶來環(huán)境污染；利用從微生物中分離提取的多糖降解酶，對海藻多糖降解為微生物可發(fā)酵糖組分，是一種經(jīng)濟、有效、無污染的方法。將海藻中多糖成份用于燃料乙醇生產(chǎn)的另一技術(shù)手段是通過基因工程方法來構(gòu)建能夠直接利用褐藻膠等海藻多糖來發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的基因工程菌，如2012年WARGACKI A J等[12]通過基因工程手段構(gòu)建了一個能夠直接利用褐藻膠生產(chǎn)乙醇的工程菌，能夠直接將大型海藻的褐藻膠以及其他組分轉(zhuǎn)化為乙醇，盡管如此，其技術(shù)仍然是基于褐藻膠裂解酶。

褐藻膠占褐藻總碳水化合物的50%左右，是細胞壁的主要組成成分和胞內(nèi)基質(zhì)的成分，是由單糖醛酸聚合的多糖，單糖主要有兩類型，即β-（1→4）D-甘露醛酸（M）與α-（1→4）L-古羅糖醛酸（G）[13-15]。海藻酸鹽裂解酶能夠通過β消去基制將褐藻膠水解成為甘露糖醛酸和古羅糖醛酸[16]。前期研究結(jié)果顯示，甘露糖醛酸和古羅糖醛酸可以被特定酵母利用并轉(zhuǎn)化為乙醇。因此，海藻酸鹽裂解酶在將褐藻膠水解成為微生物可發(fā)酵利用的單糖的同時，還能降低褐藻與水混合液的黏度，利于乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)。褐藻膠裂解酶現(xiàn)在主要用于制備海藻原生質(zhì)體，廣泛運用于藻類的細胞工程、基因工程等領(lǐng)域[17-18]。此外褐藻膠裂解酶還被用于醫(yī)藥研究，其可用作藥物酶治療由銅綠假單胞菌感染造成的肺囊性纖維化癥，另外還被用于制備具生物活性的海藻寡糖，近年來的研究表明，褐藻膠降解產(chǎn)物具有降血脂、抗腫瘤等作用[19-22]。但是，至今未有將褐藻膠裂解酶用于海藻生物質(zhì)能源領(lǐng)域的相關(guān)報道。

在褐藻生物質(zhì)能源的前期研究中，從腐爛的馬尾藻中分離鑒定了一株產(chǎn)多種裂解酶的菌株Shewanella haliotis BP-1，實驗結(jié)果顯示，該菌株除了能夠產(chǎn)海藻酸鈉裂解酶以外，還能夠產(chǎn)瓊脂酶和昆布多糖酶，薄層層析（TLC）結(jié)果表明該菌株分泌的海藻酸鈉裂解酶能夠?qū)⒑Ｔ逅徕c水解成為單糖。本文對菌株Shewanella haliotis BP-1的產(chǎn)海藻酸鈉裂解酶條件進行初步優(yōu)化，為后續(xù)的酶特性研究、海藻的糖化處理以及海藻水解醪液制取乙醇提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株

從腐爛的馬尾藻（采集自北海潿洲島）中分離純化得到的海藻酸鈉裂解酶產(chǎn)生菌，經(jīng)理化和分子生物學(xué)鑒定為Shewanella haliotis BP-1，由本實驗室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.5g，K2HPO41.05g，KH2PO40.45g，NaCl 1g，MgSO4·7H2O 0.05g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001g，海藻酸鈉（阿拉丁，AR）0.5g，蒸餾水100mL，pH 7.0。種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基成分相同，固體培養(yǎng)基中加入1.5%（w/v）的瓊脂粉。

1.3 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

通過單因素試驗來初步優(yōu)化菌株Shewanella haliotis BP-1的產(chǎn)酶條件，試驗過程中，在對應(yīng)幾種培養(yǎng)條件不變的情況下，通過改變單一培養(yǎng)條件或單一發(fā)酵培養(yǎng)基組份含量來進行。菌株Shewanella haliotis BP-1在液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇，劃線培養(yǎng)并挑單菌落接種于種子培養(yǎng)基，37℃、160r/min培養(yǎng)24h作為菌種。除特殊說明外，基本培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度37℃，搖床轉(zhuǎn)速160r/min，100mL三角瓶裝液量為50mL。按1%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h后，發(fā)酵液4℃，12000r/min離心5min，取上清為酶液，-20℃保存，用于酶活測定。

1.4 酶活測定方法

酶活檢測方法參照PREISS J等的[23]方法作適當(dāng)修改。取2mL 0.1%（w/v）的海藻酸鈉溶液（0.1mmol/L pH 7.5的Tris-HCl緩沖液配制），加入0.5mL酶液，在37℃水浴30min后沸水浴5min。冷卻至室溫后測波長235nm處的吸收值。在波長235nm處光密度每分鐘增加0.001定義為1個酶活力單位（U）。

1.5 蛋白含量測定

蛋白含量測定按Bradford方法[24]。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響

溫度是影響菌株生長代謝的重要環(huán)境因子，分別在25℃、28℃、35℃、37℃的條件下，對菌株BP-1在發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)72h，檢測發(fā)酵液中海藻酸鹽裂解酶活力。結(jié)果（圖1）顯示，在28℃～35℃溫度范圍內(nèi)，菌株具有較高產(chǎn)酶能力，35℃產(chǎn)酶能力最大，當(dāng)培養(yǎng)溫度低于28℃或高于35℃時，菌株的產(chǎn)酶能力大幅降低。

圖1 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on alginate lyase production

2.2 初始pH值對產(chǎn)酶的影響

用氫氧化鉀調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值，對菌株BP-1發(fā)酵培養(yǎng)72h，檢測發(fā)酵液中酶活力。結(jié)果（圖2）表明，該菌株在pH7.5～8.0的范圍內(nèi)具有較高的產(chǎn)酶能力，最適產(chǎn)酶pH值為8.0，高于8.0該菌株產(chǎn)酶能力大幅下降。

圖2 初始pH值對產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of initial pH value on alginate lyase production

2.3 不同濃度碳源對產(chǎn)酶的影響

試驗過程中發(fā)現(xiàn)菌株Shewanella haliotis BP-1只有以海藻酸鈉為碳源時才能產(chǎn)生海藻酸鈉裂解酶，表明海藻酸鈉是該菌株產(chǎn)海藻酸鈉裂解酶的誘導(dǎo)物，對酶的產(chǎn)生至關(guān)重要。以海藻酸鈉作為唯一碳源，使用不同海藻酸鈉濃度的培養(yǎng)基分別對菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)72h。當(dāng)海藻酸鈉濃度為0.4%（w/v）時菌株的產(chǎn)酶能力最強，濃度大于0.4%（w/v）時菌株的產(chǎn)酶能力呈下降趨勢（圖3）。

圖3 海藻酸鈉濃度對產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of the sodium alginate on alginate lyase production

2.4 氮源對產(chǎn)酶的影響

分別用0.5%（w/v）的酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、硝酸鈉、氯化銨、硫酸銨作為氮源進行菌株的發(fā)酵培養(yǎng)，考查不同氮源對產(chǎn)酶的影響。當(dāng)以牛內(nèi)膏和酵母粉作為氮源時菌株不產(chǎn)海藻酸鈉裂解酶，以硫酸銨作為氮源時菌的產(chǎn)酶能力最高（圖4A）。隨后以硫酸銨作為氮源，考查不同氮源濃度對菌株產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖4B。當(dāng)硫酸銨濃度為0.6%（w/v）時菌株產(chǎn)酶能力最大，因此以0.6%（w/v）的硫酸銨做為產(chǎn)酶的最適氮源濃度。

2.5 無機鹽對產(chǎn)酶的影響

2.5.1 NaCl對產(chǎn)酶的影響

由于該菌株篩選自海洋，對鹽度的依賴是海洋微生物的典型特征。推測NaCl濃度對產(chǎn)酶的影響較大。采用含不同濃度NaCl的培養(yǎng)基對菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果見圖5，NaCl濃度在1%～2%（w/v）的范圍內(nèi)菌株產(chǎn)酶能力較高，當(dāng)NaCl濃度為2%（w/v）時菌株的產(chǎn)酶能力最為理想，高于2%（w/v）時菌株的產(chǎn)酶能力急劇降低。

圖4 氮源對產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of nitrogen source on alginate lyase production

圖5 NaCl濃度對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of the NaCl on alginate lyase production

2.5.2 Mg2+、Fe2+對產(chǎn)酶的影響

配制含不同濃度MgSO4·7H2O和FeSO4·7H2O的發(fā)酵培養(yǎng)基對菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，研究不同Mg2+和Fe2+濃度對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖6A，在不含Mg2+的培養(yǎng)基中幾乎無海藻酸鈉裂解酶活性，而當(dāng)MgSO4·7H2O濃度為0.2%（w/v）時菌株的產(chǎn)酶能力最強。Fe2+濃度的試驗（圖6B）表明，高濃度的Fe2+會抑制菌株的產(chǎn)酶能力，但當(dāng)FeSO4·7H2O為0.001%（w/v）時菌株具備最佳產(chǎn)酶能力。

2.6 接種量對產(chǎn)酶的影響

圖6 Mg2+和Fe2+濃度對產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of Mg2+and Fe2+on alginate lyase production

發(fā)酵培養(yǎng)基中分別按0.5%（v/v）、1%（v/v）、2%（v/v）、4%（v/v）、6%（v/v）、8%（v/v）的接種量接入菌種進行發(fā)酵72h，結(jié)果見圖7，當(dāng)接種量為1%時產(chǎn)酶量最大，高于1%時，隨接種量的增加菌體產(chǎn)酶量明顯下降。因此最適的產(chǎn)酶接種量為1%。

圖7 接種量對產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of inoculum on alginate lyase production

2.7 裝液量對產(chǎn)酶的影響

采用500mL三角瓶，分別裝入50mL、100mL、150mL、200mL、250mL、300mL不同體積的培養(yǎng)基，接種菌株后培養(yǎng)72h，結(jié)果見圖8。隨著裝液量的增加，菌體的產(chǎn)酶量隨之增加，當(dāng)裝量超過200mL時繼續(xù)增大裝液量，菌體的產(chǎn)酶量會隨之下降，表明菌體的產(chǎn)酶量會受溶氧量的影響。裝量為200mL時菌體的產(chǎn)酶量最大，適于批量發(fā)酵。

2.8 搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響

搖床轉(zhuǎn)速與發(fā)酵液中的溶氧量有關(guān)，這里研究了不同轉(zhuǎn)速對菌株產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖9，當(dāng)轉(zhuǎn)速為200r/min時菌體的產(chǎn)酶量最大，轉(zhuǎn)速大于200r/min時菌株的產(chǎn)酶能力急劇降低，表明該菌株可能是兼性厭氧菌。

圖8 裝液量對產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of shaking flask volume on alginate lyase production

圖9 搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of rotation speed on alginate lyase production

2.9 K+濃度對產(chǎn)酶的影響

以上述優(yōu)化后的條件改變K+濃度來對菌株進行發(fā)酵，結(jié)果見圖10。試驗表明在3種K+濃度組合中，在1.05%（w/v）K2HPO4加上0.45%（w/v）KH2PO4的K+配方培養(yǎng)菌株時，菌株的產(chǎn)酶能力最強。因此產(chǎn)酶培養(yǎng)基的K+配方初步確定為1.05%（w/v）K2HPO4加0.45%（w/v）KH2PO4。

圖10 K+濃度對產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effect of K+on alginate lyase production

2.10 優(yōu)化后菌體的產(chǎn)酶曲線

根據(jù)上述研究確定了菌株Shewanella haliotis BP-1產(chǎn)海藻酸鈉裂解酶的最佳產(chǎn)酶條件。最佳培養(yǎng)條件為：pH 8.0，溫度35℃，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，接種量1%（v/v），裝量為500mL三角瓶裝200mL。優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成為K2HPO41.05%，KH2PO40.45%，MgSO4·7H2O 0.2%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，硫酸銨0.6%，NaCl 2%，海藻酸鈉0.4%。在此條件下對菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)120h，每12h取樣1次，測發(fā)酵液中酶活性，蛋白量和菌濃度，計算酶的比活力，結(jié)果見圖11。培養(yǎng)24h后培養(yǎng)基中酶活性達到較大值（28.1U/mL），隨培養(yǎng)時間的延長，發(fā)酵液酶活性在培養(yǎng)48h后達到最大值30.4U/mL，隨后緩慢降低，但發(fā)酵液中的蛋白濃度隨發(fā)酵時間的延長而增加，而細菌培養(yǎng)24h后即達到穩(wěn)定期，36h后為衰退期。通過比活力計算發(fā)現(xiàn)在24h時酶的比活力最大為0.92U/μg。分析發(fā)酵液酶活性在24h至60h相對穩(wěn)定的原因是隨著培養(yǎng)時間的增加培養(yǎng)基的pH值升高（實驗發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)24h后培養(yǎng)基的pH值升高至8.5），從而使酶的穩(wěn)定性降低，部份酶失活，菌株為了保持生長需要持續(xù)分泌海藻酸鹽裂解酶來將海藻酸鈉水解，因此這也可能是發(fā)酵液中蛋白濃度持續(xù)升高的原因，培養(yǎng)基中蛋白濃度升高的另一原因可能是菌體的死亡裂解導(dǎo)致的。

圖11 優(yōu)化后菌株BP-1的產(chǎn)酶曲線Fig.11 Time course of alginate lyase production by strain BP-1 after optimization

3 結(jié)論

本實驗優(yōu)化了產(chǎn)海藻酸鈉裂解酶菌株Shewanella haliotis BP-1的產(chǎn)酶條件，優(yōu)化后菌株的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為K2HPO41.05%，KH2PO40.45%，MgSO4·7H2O 0.2%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，硫酸銨0.6%，NaCl 2%，海藻酸鈉0.4%。最佳培養(yǎng)條件為pH 8.0，溫度35℃，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，接種量1%（v/v），裝量為500mL三角瓶裝200mL。在產(chǎn)酶最適培養(yǎng)基和最適培養(yǎng)條件下菌株Shewanella haliotis BP-1培養(yǎng)24h后即可達到隱定期，此時培養(yǎng)液中酶的比活力最高。隨后隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)液中酶的活性變化不大，保持在30U/mL左右。由于該菌株可能為兼性厭氧菌，因此培養(yǎng)液中的溶氧量對菌株的產(chǎn)酶影響較大。嚴格控制培養(yǎng)液中溶氧量有助于進一步提高菌株的產(chǎn)酶能力，提高發(fā)酵液中的酶量。另外，該菌株的產(chǎn)酶發(fā)酵周期短，這是該菌株產(chǎn)酶的優(yōu)勢，利于工業(yè)發(fā)酵，可極大的降低生產(chǎn)成本。同時查《Bergey’s manual of Systematic Bacteriology》（2nd）[25]和網(wǎng)站http://www.bacterio.cict.fr/s/shewanella.html發(fā)現(xiàn)該菌株也是Shewanella屬中第一個篩選得到的能產(chǎn)海藻酸鈉裂解酶的菌株。

[1]PASCALE C.Feasibility of producing bio-ethanol from waste residues:a Canadian perspective:feasibility of producing bio-ethanol from waste residues in Canada[J].Resour Conserv Recy,2007,50(3):211-230.

[2]BOTHAST R,SCHLICHER M.Biotechnological processes for conversion of corn into ethanol[J].Appl Microb Biotechnol,2005,67(1):19-25.

[3]LU X,ZHANG Y,ANGELIDAKI I.Optimization of H2SO4catalyzed hydrothermal pretreatment of rapeseed straw for bioconversion to ethanol:focusing on pretreatment at high solids content[J].Bioresource Technol,2009,100(12):3048-3053.

[4]陳姍姍，潘詩翰，董 蓉，等.褐藻燃料乙醇研究進展及其應(yīng)用前景[J].中國釀造，2011（4）：11-15.

[5]BERNDES G,HOOGWIJK M,BROEK R VAN DEN.The contribution of biomass in the future global energy supply:a review of 17 studies[J].Biomass Bioenerg,2003,25(1):1-28.

[6]CHIARAMONTI D.Bioethanol:role and production technologies[J].Impr Crop Plant Ind End Use,2007:209-251.

[7]SHILTON AN,POWELL N,MARA DD,et al.Solar-powered aeration and disinfection,anaerobic co-digestion,biological CO2scrubbing and biofuel production:the energy and carbon management opportunities of waste stabilization ponds[J].Water Sci Technol,2008,58(1):253-258.

[8]MI QUANLING,WANG RUITING,ZHANG XUEJING.Exploitation and utilization of bio-energy[J].China Forest Prod Ind,2010,37(4):51-53.

[9]ROESIJADE G.,JONES SB,SNOWDEN-SWAN LJ,et al.,Macroalgae as a biomass feedstock:A preliminary analysis[M].Prepared for the U.S.Department of Energy under contract DE-AC05-76RL01830 by Pacific Northwest National Laboratory.2010.

[10]CHRIS S,HEATHER Y,CAROLINE T,et al.Feedstocks for lignocellulosic biofuels[J].Science,2010,329(5993):790-792.

[11]JANG JS,CHO YK,JEONG GT,et al.Optimization of saccharification and ethanol production by simultaneous saccharification and fermentation(SSF)from seaweed,Saccharina japonica[J].Bioproc Biosyst Eng,2012,35(1-2):11-18.

[12]WARGACKI A J,LEONARD E,WIN M N,REGITSKY D D,SANTOS C N S,KIM P B,COOPER S R,RAISNER R M,HERMAN A,SIVITZ A B,LAKSHMANASWAMY A,KASHIYAMA Y,BAKER D,YOSHIKUNI Y.An Engineered microbial platform for direct biofuel productionfrombrownmacroalgae[J].Science,2012,335(6066):308-313.

[13]TANG JC,TANIGUCHI H,CHU H,et al,Isolation and characterization of alginate-degrading bacteria for disposal of seaweed wastes[J].Lett Appl Microbiol,2009,48(1):38-43.

[14]KLOAREG B,QUATRANO RS.Structure of the cell walls of marine algae and ecophysiological functions of the matrix polysaccharides[J].Oceanogr Mar Biol Ann Rev,1988,26(26):259-315.

[15]CAO LIXIANG,XIE LUJING,XUE XIAOLI,et al.Purification and characterization of alginate lyase fromStreptomycesspecies strain A5 Isolated from banana rhizosphere[J].J Agric Food Chem,2007,55(13),5113-5117.

[16]LI JW,SONG S,LI CB,et al.Purification and characterization of a bifunctional alginate lyase fromPseudoalteromonassp.SM0524[J].Marine Drug,2011,9:109-123.

[17]BOYEN C,BERTHEAU Y,BARBEYRON T,et al.Preparation of guluronate lyase fromPseudomonas alginovorafor protoplast isolation in Laminaria[J].Enzyme Microb Technol,1990,12:885-890

[18]管 斌，倪雪朋，李悅明，等.海藻多糖降解酶的研究進展[J].中國釀造，2010（9）：8-12.

[19]ALKAWASH MA,SOOTHILL JS,SCHILLER NL.Alginate lyase enhances antibiotic killing of mucoidPseudomonas aeruginosain biofilms[J].APMIS,2006,114:131-8

[20]OTTERLEI M,SANDAN A,SKJ?K-BRAEK G,et al.Induction of cytokine production from human monocytes stimulated with alginate[J].J Immunother,1991,10:286-91

[21]OTTERLEI M,SUNDAN A,SKJ?K-BRAEK G,et al.Similar mechanisms of action of defined polysaccharides and lipo polysaccharides:characterization of binding and tumor necrosis factor α induction[J].Infect Immun,1993,61:1917-1925.

[22]STEVAN FR,OLIVEIRA MBM,NOSEDA MD,et al.Cytotoxic effects against HeLa cells of polysaccharides from seaweeds[J].J Submicrosc Cytol Pathol,2001,33:477-484.

[23]PREISS J,ASHWELL G.Alginic acid metabolism in bacteria.I.Enzymatic formation of unsaturated oligosaccharides and 4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronic acid[J].J Biol Chem,1962,237(2):309-316.

[24]BRADFORD MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Anal Biochem,1976,72:248-254.

[25]BOWMAN J P.Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology.2nd[M].New York:Springer,2005:480-491.